鎘脅迫對泰山白首烏種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

摘要：為探明泰山自首烏對重金屬鎘的耐受性及鎘對泰山自首烏的作用機理，本試驗以泰山自首烏種子、幼苗為材料，用不同濃度（0、5、50、100、200、400 μmol/L和800 μmol/L）氯化鎘對泰山白首烏種子、萌發(fā)幼苗及土培苗進行脅迫處理，研究鎘脅迫對其種子萌發(fā)、幼苗生長及光合特性的影響。結果表明：隨著鎘濃度升高，泰山白首烏種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率總體均呈現先上升后下降趨勢。不同濃度鎘處理對泰山白首烏萌發(fā)幼苗根及莖的伸長均表現為抑制作用，且鎘濃度越大抑制作用越明顯。土培條件下，鎘能影響泰山自首烏幼苗生長，隨著鎘濃度升高總體呈現先促后抑趨勢，即低濃度鎘處理可使植株地上部增高，葉片數、生物量增加，高濃度鎘處理則抑制植株生長，生物量降低，并出現葉片瘦小枯黃現象；鎘濃度在100 - 400 μmol/L之間時，土培苗葉綠素含量與對照差異均不顯著，但其余鎘處理對葉綠素含量增加有較大或顯著抑制作用；鎘處理組土培苗光合指標整體上隨鎘濃度升高呈現先上升后下降趨勢。綜之，泰山白首烏對鎘脅迫具有一定的耐受性，一定濃度范圍內鎘處理可促進種子萌發(fā)與幼苗生長，隨著鎘濃度升高，其對種子萌發(fā)和幼苗生長均表現為抑制作用。

關鍵詞：泰山白首烏；種子萌發(fā)；幼苗生長；鎘脅迫；萌發(fā)特性；光合特性

中圖分類號：S567.239 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 10-0086-07

泰山白首烏（Cynanchum bungei Decne.）來源于蘿蘑科（Asclepiadaceae）鵝絨藤屬植物戟葉牛皮消（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight.），為多年生纏繞草本植物，以其塊根入藥，屬泰山四大名藥之一，在山東泰安、濟南等地多見，現與隔山消共稱為白首烏。它具有補肝腎、強筋骨、益精血、烏須發(fā)的功效。白首烏與何首烏多被歷代本草并而載之，《開寶本草》中記錄何首烏謂“根大如拳，有赤白二種，赤者雄，白者雌”：《本草從新》中記有“凡使赤白各半……”。展雪鋒，對《本草綱目》中有關首烏雌雄之分進行過本草考證，指出《本草綱目》中首烏所指“雌者”為蘿藦科植物戟葉牛皮消Cynanchum bungei Dec-ne.，即泰山白首烏?，F代研究表明，泰山白首烏主要含有C21甾苷、苯乙酮類、多糖類、揮發(fā)油和氨基酸等活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、護肝、降血脂和進行免疫調節(jié)等作用。白首烏抗氧化活性較強，抗衰老效果顯著。Wu等對提取到的白首烏中的抗氧化活性成分溶劑進行過選擇研究，這為自首烏的擴大應用提供了解決思路。然而，泰山白首烏野生資源有限，栽培技術的不成熟性已限制其發(fā)展，市場上出現越來越多的偽品以替代正品泰山白首烏，白首烏仿野生種植逐漸得以發(fā)展。

土壤在生物多樣性的形成和維持中發(fā)揮著關鍵作用，良好的土壤環(huán)境是植物生長的基礎。隨著經濟社會發(fā)展，不合理排放工業(yè)“三廢”、過度使用農藥及化肥往往會導致土壤重金屬污染，以鎘、砷、汞、鉛及其復合污染較為嚴重，其中重金屬鎘（Cd）因其毒性大、遷移性強且易被植物吸收而受到廣泛關注。Cd具有導致胎兒畸形、人體癌變等風險，可通過食物鏈中的富集作用進行積累進入人體，是公認的致突變物質。Cd能降低光合作用，導致植物生長遲緩和氧化應激，并影響植物次生代謝。因此，探索重金屬Cd對泰山自首烏的影響并調控泰山白首烏種植中的重金屬積累已成為白首烏仿野生種植中亟待解決的問題。本研究通過對泰山自首烏種子、幼苗進行外源Cd處理，比較脅迫處理前后種子萌發(fā)、幼苗生長及其光合特性的變化，為初步探明Cd脅迫對泰山白首烏的作用機理及今后泰山白首烏優(yōu)質資源的開發(fā)奠定一定的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗所用泰山白首烏種子為戟葉牛皮消的成熟種子，采自山東中醫(yī)藥大學藥用植物園，業(yè)經山東中醫(yī)藥大學藥學院徐凌川教授鑒定，自然干燥后避光防潮保存。Cd2+供源為氯化鎘（CdCl2.2·5H2O，國藥集團化學試劑有限公司產品），該試劑為分析純。土培苗栽培基質為蛭石：泥炭土=1：3的混合基質。

主要儀器和試劑：紫外可見分光光度計（UV1800PC，上海奧析科學儀器有限公司產品）；便攜式光合儀（11- 6800，美國LI- COR公司產品）；藥品穩(wěn)定性試驗箱（SHH -400SD，重慶康誠永生試驗設備有限公司產品）；葉綠素（Chloro-phyll）檢測試劑盒（比色法，上海源葉生物科技有限公司產品）。

1.2 試驗處理及方法

1.2.1 種子萌發(fā)期鎘脅迫處理

試驗于2023年3月在山東中醫(yī)藥大學藥用植物園進行。選取大小均一、籽粒飽滿健康的泰山白首烏種子，用75%酒精消毒5 min后蒸餾水沖洗干凈，再用清水浸泡24 h，之后分別在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中均勻放置50粒。各試驗組分別加入5、50、100、200、400、800 μmol/L氯化鎘溶液進行鎘脅迫處理，以加純水為對照組，每處理重復3次，共處理1 050粒種子。將各處理培養(yǎng)皿置于藥品穩(wěn)定性試驗箱中進行種子萌發(fā)試驗，其晝夜溫度為25℃/20℃，空氣相對濕度為75%，光照周期為12 h/12 h（光照／黑暗）。每天分別向培養(yǎng)皿中加入適量不同濃度的氯化鎘溶液以保持濕潤，除處理液濃度不同外其他因素保持一致。為保證培養(yǎng)過程中鎘濃度保持不變，培養(yǎng)皿內濾紙每隔2d更換一次，并加入相應濃度的氯化鎘溶液。每天定時觀察種子萌發(fā)情況，培養(yǎng)5d后每隔ld記錄一次種子萌發(fā)數，以種子胚根露白視為萌發(fā)，15 d時結束種子萌發(fā)試驗。

發(fā)芽勢（%）=8 d時正常萌發(fā)種子數／供試種子數×100：

發(fā)芽率（%）= 12 d時正常萌發(fā)種子數／供試種子數×100。

1.2.2 幼苗期鎘脅迫處理

在進行1.2.1中試驗同時對350粒大小均一、籽粒飽滿健康的泰山白首烏種子進行萌發(fā)并進行后續(xù)幼苗期鎘脅迫處理及幼苗土培試驗。分別選取8株根長1 - 1.5 cm、長勢一致的泰山白首烏幼苗放置在分層發(fā)芽盒中，各試驗組分別加入5、50、100、200、400、800μmol/L氯化鎘溶液進行鎘脅迫處理，以加純水為對照，每個處理重復3次，共處理幼苗168株。將發(fā)芽盒置于藥品穩(wěn)定性試驗箱中進行育苗，溫濕度條件同1.2.1。每天分別向發(fā)芽盒中加入適量不同濃度氯化鎘溶液以保持濕潤，使育苗過程中氯化鎘溶液濃度保持不變，除處理液濃度不同外其他因素保持一致。每隔1 d記錄一次根長（根系平均長度）和株高（莖基部至植株頂端的高度）數據，鎘處理14 d時完成試驗。

1.2.3 幼苗土培及鎘脅迫處理

每組分別選取16株根長2 - 2.5 cm、株高3-3.5 cm、苗齡12 d、長勢一致的泰山白首烏幼苗栽于裝有混合基質的育苗盤（32孔，5.4 cm×2.8 cm×5.1 cm，底部有孔）中進行土培。當植株長出6片功能葉時，各試驗組混合基質中加入一定量的5、50、100、200、400、800 μmol/L氯化鎘溶液進行脅迫處理，以加純水為對照，共處理幼苗112株。將育苗盤置于自然環(huán)境中，使混合基質保持濕潤，除處理液濃度不同外其他因素保持一致。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 土培苗生長指標測定

土培苗鎘脅迫處理60 d時，7個處理組均選取長勢一致的泰山白首烏植株，調查記錄植株葉片數、根長、株高，比較鎘處理前后各生長指標的差異，計算根相對伸長率及莖相對伸長率。

根相對伸長率（%）=（處理60 d根長-處理前根長）／處理前根長×100；

莖相對伸長率（%）=（處理60 d莖長-處理前莖長）／處理前莖長×100。

1.3.2 土培苗生物量測定

土培苗鎘脅迫處理60 d時，7個處理組中選取長勢一致的泰山自首烏植株，將其從培養(yǎng)基質中分離，用清水洗凈，取地上、地下兩部分，用電子天平分別稱量兩部分鮮重（WF上和WF下）。稱重鮮樣經鼓風干燥箱80℃烘干至恒重，測定干重（WD）。

1.3.3 土培苗葉綠素含量測定

鎘脅迫處理60d時，每株選取相同部位的成熟葉片，洗凈擦干，去除中脈后剪碎，稱鮮樣0.1 g，葉綠素提取步驟按照葉綠素（Chlorophyll）檢測試劑盒說明書進行，使用紫外可見分光光度計于665、649 nm處檢測葉綠素。和葉綠素b的吸光度。根據下述經驗公式計算出葉綠素。葉綠素b和總葉綠素含量。各經驗公式如下：

Ca（mg/L）=13.95×A665-6.88×A649;

Cb（mg/L）= 24.96×A649-7.32×A665;

CT（mg/L）= 6.63×A665+18.08×A649;

Ma（mg/g）= Ca×V×N/（W×1 000）;

Mb（mg/g）= Cb×V×N/（W×1 000）;

MT（mg/g）= Cr×V×N/（W×1 000）。

式中：Ca、Cb、CT分別表示葉綠素a、b的濃度和總葉綠素濃度；Ma、Mb、Mr分別代表葉綠素a、b含量和總葉綠素含量：V為葉綠素粗提液體積（10mL）；N為稀釋倍數；W為樣品鮮重（g）。

1.3.4 土培苗光合指標測定

鎘脅迫處理60 d時，7個處理組均選取長勢一致植株，每株選擇3張位置相同的成熟葉片，使用LI-6800便攜式光合儀測定凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和胞間Co：濃度（Ci）。

1.4 數據處理與分析

使用Microsoft Excel 2010進行數據統(tǒng)計，應用GraphPad Prism 9.5.1進行數據處理、分析及繪圖，運用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對泰山自首烏種子萌發(fā)的影響

由表1可以看出，隨著鎘濃度逐漸升高，泰山白首烏種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率總體均呈現先升后降趨勢。鎘濃度為400 μmol/L時種子發(fā)芽勢達到最大值，為62.47%，顯著高于對照95.22%；鎘濃度升高至800 μmol/L時，種子發(fā)芽勢較400μmol/L處理顯著降低，與對照無顯著性差異。鎘濃度400 μmol/L時種子發(fā)芽率達到最大值，為66.67%，較對照顯著高出15. 25%：鎘濃度升至800 μmol/L時種子發(fā)芽率僅為49.67%，與對照差異顯著。以上表明，鎘處理對泰山自首烏種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率均有顯著影響：不同濃度鎘處理均可提高種子發(fā)芽勢，5 - 400 μmol/L鎘濃度處理的促進作用顯著；50 - 400 μmol/L鎘濃度處理對發(fā)芽率的促進作用顯著，800 μmol/L鎘處理顯著降低種子發(fā)芽率。

2.2 鎘脅迫對泰山自首烏萌發(fā)幼苗生長的影響

試驗結果表明，鎘脅迫14 d內，各處理組泰山白首烏萌發(fā)幼苗根長隨著鎘處理時間延長其增速較對照（CK）相對緩慢。由表2看出，不同濃度鎘處理14 d時，幼苗根長對照為2.90 cm，鎘濃度5 - 800 μmol/L各處理組較對照分別為顯著降低47.25%、50. 69%、44. 83%、50. 69%、49. 31%、52.76%。由此可知，不同濃度鎘處理對泰山白首烏萌發(fā)幼苗根的伸長負面影響較大，抑制作用明顯。試驗中觀察發(fā)現，鎘濃度越高，萌發(fā)幼苗根出現褐變、萎縮的現象越嚴重，根長明顯減小，爛根現象明顯，幼苗死亡率升高。

各濃度鎘脅迫對萌發(fā)幼苗莖生長均呈現抑制作用，且濃度越高抑制作周越明顯（表2）。鎘處理14 d時，泰山白首烏萌發(fā)幼苗株高對照為8.00cm，鎘濃度5- 800 μmol/L各處理組較對照分別顯著降低27.13%、41. 25%、47. 88%、51. 63%、53 .75%、58.38%。

2.3 鎘脅迫對泰山白首烏土培苗生長的影響

由表3可以看出，隨鎘濃度升高，鎘脅迫對泰山白首烏土培苗根、莖生長呈現先促后抑的作用趨勢，植株葉片數、生物量積累也呈現先升高后降低趨勢。鎘濃度為50 μmol/L時，根相對伸長率達到最高值，升至800 μmol/L后根相對伸長率僅為6.76%。鎘濃度為100 μmol/L時，莖相對伸長率達到最高值，為18.84%，升至800 μmol/L后莖相對伸長率僅為5. 66%。植株葉片數，對照為15.38片，鎘濃度100 μmol/L處理達到峰值，升至800 μmol/L后葉片數僅為12.56片。鎘處理濃度在5 - 400 μmol/L范圍內，各處理組植株生物量積累能力均優(yōu)于CK或與之基本持平，鎘濃度升至800 μmol/L生物量積累受到較大抑制。整體上看，鎘濃度50、100 μmol/L處理對泰山白首烏土培苗根莖生長、葉片數和生物量促進作用較大，鎘濃度800 μmol/L處理對土培苗生長的負面影響最大，抑制作用最顯著。

試驗中發(fā)現，一定濃度鎘處理可使泰山白首烏植株矮小、葉片瘦小枯黃，高濃度（800 μmol/L）處理葉片枯黃稀疏、植株矮小明顯，且出現葉片卷曲現象（圖1）。

2.4 鎘脅迫對泰山自首烏土培苗葉綠素含量的影響

由表4可見，隨著鎘濃度升高，鎘處理組泰山白首烏葉片葉綠素。含量大致呈先升后降的變化趨勢，但不同濃度鎘處理的葉綠素。含量均低于對照（CK），鎘濃度為800 μmol/L時與對照差異顯著。葉綠素a含量對照為1.148 mg/g，鎘處理組中鎘濃度為100 μmol/L時達到最大值，為0.965 mg/g，鎘濃度增至800 μmol/L時降至最低值，為0.610 mg/g。

泰山自首烏葉綠素b含量的變化趨勢與葉綠素。大致相同，鎘處理組葉綠素b含量均低于對照，鎘濃度為5、800 μmol/L時與對照差異顯著。鎘濃度為100 μmol/L時葉綠素b含量達到最大值，為0.432mg/g，鎘濃度增至800 μmol/L時僅為0.223 mg/g。

泰山白首烏總葉綠素（葉綠素a、b之和）含量，對照高于鎘處理組，鎘濃度為5、800 μmol/L時與對照差異顯著。鎘濃度為100 μmol/L時總葉綠素含量達到峰值，為1.397mg/g。由此可見，適當濃度鎘脅迫對泰山自首烏葉綠素含量影響不大。

2.5 鎘脅迫對泰山白首烏土培苗光合特性的影響

泰山白首烏土培苗葉片各光合指標值隨著鎘濃度升高呈現先上升后下降趨勢，高濃度（800μmol/L）鎘處理呈現抑制作用（表5）。這與鎘脅迫對黃樟幼苗影響之表現一致，即低濃度鎘處理促進、高濃度鎘處理抑制光合作用。隨鎘濃度升高，泰山白首烏凈光合速率（Pn）呈先上升后下降趨勢，各鎘處理與對照（CK）之間無顯著差異。隨鎘濃度升高，泰山白首烏蒸騰速率（Tr）鎘處理與對照大致相同。泰山白首烏氣孔導度（Gs）隨鎘濃度升高也呈先上升后下降趨勢，鎘濃度為50、100 μmol/L時其值大且作用強，與對照差異顯著。胞間CO2濃度（Ci）隨鎘濃度升高呈下降趨勢，且5 μmol/L鎘處理Ci顯著高于對照，其光合作用增強。

3 討論與結論

種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的起點，不同濃度鎘脅迫下植物種子的反應呈現出不同結果，部分植物種子低濃度鎘脅迫不影響或具有升高種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的作用，而高濃度鎘脅迫呈現抑制種子發(fā)芽的作用。從本試驗結果可以看出，隨著鎘濃度逐漸升高，泰山白首烏種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率總體呈現先上升后下降趨勢，鎘濃度為400μmol/L時發(fā)芽勢比對照高出95.22%，發(fā)芽率比對照高出15.25%。這表明適宜濃度鎘處理可促進泰山白首烏種子萌發(fā)。

相較于種子時期和成熟期，植物幼苗期更易受到外界影響，此期根的生長更能反映其成株在鎘脅迫環(huán)境下的生長狀況。對植株而言，根系是最直接接觸重金屬的部位，可通過觀察苗期根系生長狀況來判斷幼苗植株對重金屬鎘的耐受能力。試驗中發(fā)現，鎘脅迫對泰山白首烏萌發(fā)幼苗根和莖的伸長有明顯的抑制作用，濃度越大抑制作用越明顯，鎘濃度≥100 μmol/L時部分幼苗葉片出現黃褐色，鎘濃度≥200 μmol/L時根長明顯減小，爛根現象明顯，幼苗死亡率升高。這說明萌發(fā)幼苗對重金屬鎘的耐受性較差。

隨著鎘濃度升高，泰山白首烏土培苗根長、株高、葉片數呈現先增后減趨勢，低濃度鎘處理可促進根莖生長以及葉片的增加，高濃度鎘處理下植株生長受到的抑制作用最明顯，葉片生長出現稀疏、枯黃現象，須根減少。Cd的毒性作用可阻礙植物根系發(fā)育，降低根系的吸收能力，削弱植株對土壤養(yǎng)分的吸收，從而可影響生物量累積，以此可反映植物對鎘的耐受度。泰山白首烏為多年生草本植物，其生物量隨時間延長而增進累積，但各處理組植株生物量與對照間無顯著性差異，其原因可能是由于試驗時間較短而缺少長時間累積而造成。上述結果表明，泰山白首烏生長期對重金屬鎘具有一定的耐受性。

葉綠素是高等植物進行光合作用的重要物質，其與植物光合作用效率有著密不可分的關系，因此葉綠素含量的變化可影響到植物的生長發(fā)育。本試驗發(fā)現，鎘處理濃度在100 - 400μmol/L之間時，3個鎘處理泰山白首烏的葉綠素含量與對照差異均不顯著，即對其無較大影響，但其余鎘處理對葉綠素含量增加有較大或顯著抑制作用。植物光合作用受氣孔因素和非氣孔因素影響，可通過光合指標的變化來判斷是受氣孔因素還是非氣孔因素的影響。氣孔因素限制植物光合作用時Pn、Gs、Ci表現為同時降低，非氣孔因素限制光合作用時Pn降低而Ci升高，二者呈負相關。泰山白首烏土培苗鎘處理組葉片光合指標整體上隨鎘處理濃度升高呈現先上升后下降趨勢。5、800 μmol/L鎘處理下泰山白首烏Pn降低而Ci高于對照，說明此時影響光合作用的為非氣孔因素，鎘濃度在50 - 400 μmol/L時各處理組Pn、Gs、Ci較對照同時升高，說明此時主要受氣孔因素影響。

綜上，本試驗結果得出，泰山白首烏對鎘脅迫具有一定的耐受性，不同濃度鎘脅迫對泰山白首烏生長、生理的影響不同，整體表現為，低濃度鎘脅迫具有促進作用，高濃度鎘脅迫則表現為抑制。關于泰山白首烏對鎘污染土壤耐受的作用機制有待進一步研究。

基金項目：山東省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（2019-0976）；國家中醫(yī)藥管理局全國中藥資源普查項目（GZY-KJS-2018- 004）