馬鈴薯DHN基因家族的鑒定與分析

摘要：脫水素（dehydrin，DHN）作為一種高親水性蛋白，在植物響應(yīng)各種生物、非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。本研究在馬鈴薯基因組中鑒定出7個StDHNs基因，不均勻地分布在3條染色體上，編碼氨基酸數(shù)目為80-243 aa，內(nèi)含子數(shù)目均為1；StDHNs蛋白分子量在8.54 - 25.12 kDa之間，等電點為5.24- 7.38，共3個保守motifs，保守基序及進(jìn)化關(guān)系分析表明StDHN家族成員在進(jìn)化上具有高度的保守性。轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析結(jié)果顯不，StDHN5、StDHN6、StDHN7在特定逆境脅迫下顯著高表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)模式分析表明，StDHN5、StDHN6受到鹽和ABA脅迫的顯著誘導(dǎo)，StDHN7響應(yīng)干旱脅迫。本研究結(jié)果可為深入研究馬鈴薯DHN基因家族的功能及其在逆境脅迫抗性中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；DHN基因家族；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號：S532：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 10-0018-08

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（late embryogenesisabundant proteins，LEA蛋白）是生物體中廣泛存在的一類與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白，該類蛋白的編碼基因在植物種子胚胎發(fā)育晚期表達(dá)量豐富，而且在環(huán)境脅迫如干旱、低溫、鹽脅迫和ABA等條件下其mRNA會大量累積。積累親水性蛋白是植物應(yīng)對細(xì)胞脫水的主要途徑，脫水素（de-hydrin，DHN）是一種植物中廣泛存在的高親水性蛋白，屬于LEA第二家族成員，被稱為LEADⅡ蛋白，也稱響應(yīng)脫落酸（abscisic acid-respon-sive，RAB）蛋白或水脅迫蛋白（water stress pro-tein，WSP），并廣泛存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、液泡、線粒體和葉綠體等植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。

近年來脫水素基因的研究受到越來越多的關(guān)注，在擬南芥、小麥、水稻、大豆、枇杷、蘋果和葡萄，等植物中均有報道，大量的DHNs參與了植物對冷、熱、鹽和干旱等脅迫的響應(yīng)。在番茄中過表達(dá)雪蓮SiDHN基因，可抑制細(xì)胞膜損傷，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性；在干旱脅迫下，過表達(dá)脫水素基因MtCAS31可以降低苜蓿根系的導(dǎo)水率，從而減少水分流失，提高植株抗旱性：ABA處理后，過表達(dá)OsDhn-Rab16D基因的水稻植株莖和根比野生型更長，說明脫水素對ABA作出響應(yīng)，解除了ABA對植物根和莖生長的抑制作用：沉默辣椒脫水素基因CaDHN4會降低辣椒對低溫和鹽脅迫的耐受性，而在擬南芥中過表達(dá)CaDHN4基因則可以保護(hù)擬南芥免受寒冷和鹽脅迫的影響。

馬鈴薯是一種重要的糧食、經(jīng)濟作物，是世界第四大主要糧食作物，富含碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)，被廣泛用于食品中。馬鈴薯在全球范圍內(nèi)廣泛種植，其生產(chǎn)和供應(yīng)對世界糧食安全具有重要戰(zhàn)略意義。但馬鈴薯在逆境環(huán)境下的生長能力有限，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量，因此，進(jìn)行抗逆育種研究以提高其適應(yīng)性和產(chǎn)量具有重要意義。DHN基因家族在植物的逆境適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，但有關(guān)馬鈴薯DHN基因家族的研究較少。本研究從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)中鑒定出其DHN基因家族成員，并利用生物信息學(xué)方法結(jié)合熒光定量PCR進(jìn)行鑒定與分析，以期為深入研究該家族基因的功能及馬鈴薯抗逆育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯DHN基因家族鑒定

馬鈴薯的基因組數(shù)據(jù)來自http：//www. bioin-formaticslab. cn/pubs/dm8。同時從Pfam下載DHN保守結(jié)構(gòu)域（PF00257）的隱馬爾可夫模型，并以該結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)作為種子模型，通過HM-MER檢索確定馬鈴薯DHN基因家族成員。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)分析軟件（表1）對馬鈴薯DHN基因家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析、進(jìn)化關(guān)系分析及染色體定位分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

從Spud DB（http：//spuddb.uga.edu/）數(shù)據(jù)庫中下載DHN基因表達(dá)特征的RNA-seq數(shù)據(jù)集并進(jìn)行分析。該數(shù)據(jù)集包含生物脅迫處理（病毒感染）和非生物脅迫處理（鹽、甘露醇、β-氨基丁酸、苯并噻二唑、脫落酸、生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、高溫）及馬鈴薯不同組織（萼片、葉、根、芽、愈傷組織、匍匐莖、塊莖、花、葉柄、花瓣、雄蕊、心皮、果實）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄本豐度用FPKM值表示。將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)利用TBtools進(jìn)行熱圖展示，分析DHNs基因在不同逆境脅迫條件及不同組織中的表達(dá)特征。

1.4 馬鈴薯DHNs基因的表達(dá)模式分析

脅迫處理試驗于2023年8月進(jìn)行。將培養(yǎng)20 d的馬鈴薯DMI-3組培苗轉(zhuǎn)移至1/2MS液體培養(yǎng)基中適應(yīng)生長一周后，進(jìn)行脅迫處理。共設(shè)置150 mmol/L NaCl脅迫、260 μmol/L甘露醇模擬干旱脅迫、50 μmol/L脫落酸（ABA）及35℃高溫脅迫4種處理，每個處理4次重復(fù)，分別在處理o、3、24 h取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。使用Vazyme公司的FastPure@ Universal Plant TotalRNA Isolation Kit試劑盒提取總RNA，然后用Vazyme公司的HiScrip@Ⅲ lst Strand cDNA SynthesisKit （+gDNA wiper）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

根據(jù)候選基因的CDS序列，利用NCBI的Primer- BLAST設(shè)計實時熒光定量PCR（RT -qPCR）引物（表2）。RT - qPCR反應(yīng)體系共20μL，包含2 X SYBR qPCR Mix 10 μL、cDNA 2 μL、上游和下游引物各0.4 μL、RNase Free H2O 7.2μL。RT-qPCR反應(yīng)在Roche Light Cycler96熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min;94℃10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，并且以GAPD日基因為內(nèi)參基因，按照富含酸性氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯DHN基因家族鑒定和編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

根據(jù)DHN保守結(jié)構(gòu)域（PF00257），在馬鈴薯基因組中檢索鑒定出7個DHNs基因，參照基因在染色體上的位置，將其依次命名為StDHNl -StDHN7（表3）。對其進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，StDHN4蛋白質(zhì)最短（80個氨基酸），StDHN1最長（243個氨基酸），7個StDHNs蛋白質(zhì)平均長度為156.14個氨基酸：分子量最小的為StDHN4（8.54 kDa），最大的為StDHN1（25. 12kDa），平均分子量為16.78 kDa;等電點（pI）最小為5.24（StDHN7），最大為7.38 （StDHN1），平均等電點為6.47，其中57.14%的StDHNs蛋白pI小于7，說明馬鈴薯DHN基因家族編碼的多數(shù)蛋白

2.2 馬鈴薯DHN家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

＆DHN家族成員的基因結(jié)構(gòu)如圖1a所示，均只有1個內(nèi)含子，其中＆DHN3和＆DHN7的序列較長，超過1 000 bp。而＆DHN2的序列最短，在500 bp左右。StDHN家族蛋白共有3個保守mo-tif基序（圖1b、c），分別為S片段（RSSSSSSSSSEDDGEGCRRKK）、K片段（EKKGMMDKIKEKIPGHH）和Y片段（YGNPVRLTDEYCNPVQQT），這些保守motif是該家族的鑒定特征：但不同家族成員的保守motif數(shù)目與分布不同，StDHN4只含有S片段，StDHN2和StDHN7僅含有S和K片段，其余StDHN家族成員含有全部motifs。

2.3 馬鈴薯及不同物種DHNs的進(jìn)化關(guān)系分析

根據(jù)馬鈴薯DHN家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）可知，StDHNs被分為a、b兩大類，分別包含5個和2個家族成員。結(jié)合蛋白保守基序分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，進(jìn)化樹同一分支中的StDHN成員大多具有相似的motif組成，如b類分支中的兩個成員都含有motif1和motif2，而a類分支中除StDHN4外均含有motif1、motif2和motiB。

為揭示馬鈴薯DHNs與其他作物DHNs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，構(gòu)建了馬鈴薯、擬南芥和水稻DHNs蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）顯示，25個DHN成員被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3組，馬鈴薯、擬南芥和水稻的DHNs在每組中均有涉及。Ⅱ、Ⅲ組分別有8個和7個成員，少于Ⅰ組所含成員數(shù)。Ⅰ組中大多數(shù)AtDHNs聚在一個分支，Ⅱ組中所有AtDHNs聚在一個分支，Ⅲ組中所有OsDHNs聚在一個分支，而StDHNs中只有StDHN3和StDHN4單獨成簇，推測這兩個成員發(fā)揮的功能相似且與其他StDHNs成員具有差異。

2.4 馬鈴薯DHN基因家族的染色體定位分析

由圖4可見，7個＆DHNs基因不均勻地分布在1、2、4號染色體上，1號染色體上分布有StDHN1、＆DHN2，2號染色體上分布的基因最多（StDHN3、StDHN4、StDHN5、StDHN6），4號染色體上只有StDHN7 -個基因。

2.5 馬鈴薯DHN基因家族的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探究＆DHN基因家族在馬鈴薯抵御逆境脅迫中的作用，利用已公布的馬鈴薯RNA-seq數(shù)據(jù)集，對＆DHN家族成員在不同處理下的表達(dá)數(shù)據(jù)（FPKM值）進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）顯示。StDHN1、StDHN2、StDHN3、StDHN4在所有處理下均無明顯表達(dá)，＆DHN5表達(dá)活躍度一般，＆DHN6在苯并噻二唑處理的葉片中、ABA及高溫脅迫下明顯高表達(dá)，StDHN7在鹽脅迫及甘露醇模擬干旱脅迫下明顯高表達(dá)，而在高溫脅迫下表達(dá)量明顯降低。同時，由圖6可知，StDHN5、＆DHN6、StDHN7主要在馬鈴薯根、塊莖及成熟的果實中表達(dá)。

2.6 馬鈴薯DHNs基因在逆境脅迫下的表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，通過qRT-PCR分析StDHN5、＆DHN6、StDHN7基因在鹽、干旱、高溫脅迫及ABA處理下的表達(dá)情況，以進(jìn)一步驗證它們在馬鈴薯抵御逆境脅迫中發(fā)揮的作用。結(jié)果（圖7）表明，StDHN5在ABA處理24 h、StDHN6在鹽脅迫和ABA處理24 h、＆DHN7在干旱脅迫3h表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)表達(dá)，特別是StDHN6基因在ABA處理24 h的表達(dá)量顯著上調(diào)，其余條件下3個基因均下調(diào)表達(dá)。隨著處理時間的延長，StDHN5在干旱和高溫脅迫下、＆DHN7在4種處理下均表現(xiàn)為處理3h的表達(dá)量高于處理24 h的，而其余條件下3個基因的表達(dá)量則表現(xiàn)相反。3個基因間比較，＆DHN7在干旱脅迫3h、StDHN6在鹽脅迫和ABA處理24 h的表達(dá)量明顯較高。除鹽脅迫和ABA處理下的＆DHN7外，StDHN5、＆DHN6、StDHN7基因在不同逆境脅迫下的RT-qPCR分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

干旱、鹽堿等非生物脅迫通常對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。DHN是一類能夠應(yīng)答逆境脅迫的親水性蛋白，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜、結(jié)合金屬離子、作為分子伴侶等功能。目前，在園藝作物中鑒定到的DHN基因家族成員較多，其中蘋果有12個，梨和獼猴桃各有7個，葡萄和黃瓜各有4個。本研究從馬鈴薯全基因組中也鑒定到7個StDHN基因家族成員。

馬鈴薯DHN基因家族成員不均勻地分布在l、2、4號染色體上，均含有1個內(nèi)含子；編碼蛋白的氨基酸數(shù)目為80 - 243 aa，分子量為8.54 -25.12 kDa，等電點為5.24-7.38;不同成員的保守motif數(shù)目與分布不同，但處于系統(tǒng)進(jìn)化樹同一分支中的＆DHNs基因具有相似的motif組成，證明了該基因家族進(jìn)化的保守性。此外，構(gòu)建了馬鈴薯、擬南芥和水稻DHNs的系統(tǒng)進(jìn)化樹，可分為3組，分別包含3、3、1個馬鈴薯DHNs蛋白，表明了馬鈴薯DHN家族成員之間的多樣性。

利用已公布的馬鈴薯RNA - seq數(shù)據(jù)集對StDHN基因家族成員進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，結(jié)果表明只有StDHN5、StDHN6、StDHN7基因在脅迫中有明顯表達(dá)，且主要在根、塊莖及成熟的果實中表達(dá)，推測它們可能在馬鈴薯塊莖發(fā)育中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。目前已有一些植物的DHNs基因功能得到驗證，通過調(diào)控這些基因的表達(dá)可提高植物的耐逆境脅迫能力。然而，馬鈴薯DHN基因家族及其在逆境脅迫響應(yīng)方面的研究還較少。本研究在轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了鹽、干旱、高溫脅迫及ABA處理下StDHN5、StDHN6、StDHN7基因在馬鈴薯幼苗中的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StDHN5在鹽和ABA處理3h下調(diào)表達(dá)，之后表達(dá)量上升，尤其在ABA處理24 h的表達(dá)量明顯上調(diào)，但在干旱及高溫脅迫下均下調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量隨處理時間的延長呈降低趨勢：StDHN6在鹽脅迫和ABA處理24 h顯著上調(diào)表達(dá)，其余條件下均顯著下調(diào)表達(dá)：＆DHN7只在干旱處理3h上調(diào)表達(dá)，其他脅迫處理下均下調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量隨處理時間延長呈下降趨勢。綜合來看，StDHN5、＆DHN6的RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果基本一致，而StDHN7在鹽脅迫和ABA處理下的表達(dá)情況，RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果存在差異，這可能是因為＆DHN7基因的熒光表達(dá)受取樣部位的影響較大。

綜上，本研究從馬鈴薯基因組中鑒定出7個DHN家族基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式等進(jìn)行了分析，同時對其在不同脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯DHN基因家族在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用，這為今后進(jìn)一步開展馬鈴薯DHN家族基因的生物學(xué)功能及作用機制奠定了理論基礎(chǔ)。

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（重大科技創(chuàng)新工程）項目（2022LZGC017）