雞傳染性法氏囊病毒新型變異株致病性研究

摘 要：雞傳染性法氏囊病是一種由雞傳染性法氏囊病毒引起的急性、高傳播性和致死率的烈性傳染病，雞感染該病毒后會(huì)引起法氏囊器官嚴(yán)重萎縮，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制。近年來(lái)IBDV新型變異株在我國(guó)開始流行，目前尚無(wú)商品化疫苗預(yù)防該病，未來(lái)可能成為養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的新威脅。因此，需要進(jìn)一步研究其流行病學(xué)情況和在臨床疾病可能發(fā)揮著潛在的作用。本研究針對(duì)新型變異株GD2021-08進(jìn)行致病模型建立，為生產(chǎn)防控提供參考和指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：雞傳染性法氏囊病毒；新型變異株；致病模型

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2024）11-0021-07

傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD），是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、高傳播性且具有免疫抑制性的傳染病，會(huì)增加誘發(fā)其他禽類疾病繼發(fā)的可能性或其他疫苗接種失敗的風(fēng)險(xiǎn)[1]。IBDV通常易感染3～6 周雛雞，該病一年四季都可以發(fā)生，在4～7月份多發(fā)，發(fā)病率極高，達(dá)80%～100%。發(fā)病過(guò)程持續(xù)一周且極為迅速，通常在感染3 d后即可引起法氏囊萎縮，開始出現(xiàn)死亡，感染4～6 d達(dá)到高峰，死亡率為5%～15%，感染并發(fā)癥后死亡率會(huì)更高，因此該病還被稱為雞中的“艾滋病”[2]。IBDV主要嚴(yán)重?fù)p害雛雞中樞免疫器官——法氏囊，使B淋巴細(xì)胞前體壞死或溶解，從而影響雞的發(fā)育以及抗體的產(chǎn)生。臨床癥狀主要有精神萎靡、羽毛蓬松雜亂、少食、間歇腹瀉等。解剖病雞可以發(fā)現(xiàn)法氏囊黏膜有出血、嚴(yán)重時(shí)法氏囊發(fā)黃甚至呈紫葡萄狀[3]。

1957年，IBD首次發(fā)生于美國(guó)Delaware州甘保羅鎮(zhèn)。根據(jù)發(fā)病地區(qū)，該病被命名為Gumboro disease，即甘保羅病[4]。1979年首次在我國(guó)廣州出現(xiàn)，周蛟等人在北京發(fā)現(xiàn)并于1982年分離出該病毒，隨后陸續(xù)在全國(guó)流行[5-6]。后來(lái)，疫苗的研發(fā)使這類經(jīng)典IBDV得到有效控制，感染IBDV的雞死亡率不高。

最近幾年來(lái)，隨著A、B節(jié)段不斷的重組重配，中國(guó)東部報(bào)道IBDV新型變異株出現(xiàn)。在2019年，中國(guó)從6個(gè)省份中首次檢測(cè)到新型變異株IBDV。這引起了人們對(duì)新型變異株的廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)陸續(xù)有人分離并對(duì)IBDV新型變異株進(jìn)行各方面研究[7]。新型變異株也迅速傳播到了其他亞洲國(guó)家，2021年在日本、韓國(guó)、馬來(lái)西亞等國(guó)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)IBDV新型變異株[8-9]。IBDV新型變異株可能成為家禽業(yè)新的威脅，防控形勢(shì)仍不容樂(lè)觀。

本研究前期從臨床中分離到一株IBDV新型變異株GD2021-08，為了解該毒株臨床致病情況。本文通過(guò)該毒株在SPF雞上的感染情況以及發(fā)病特征進(jìn)行研究，為生產(chǎn)防控提供參考和指導(dǎo)。

1" 材料方法

1.1" 材料

1.1.1" 病毒" 毒株：本試驗(yàn)用到的IBDV新型變異株代表株GD2021-08，由溫氏研究院分離純化鑒定。

1.1.2" "SPF雞胚、試驗(yàn)動(dòng)物" 無(wú)特定病原體（Specific pathogen free，SPF）雞、SPF雞胚均購(gòu)于廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司。雞胚在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，SPF雞在試驗(yàn)場(chǎng)負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)。

1.1.3" 主要試劑" 病毒基因組提取試劑盒（RaPure Viral RNA/DNA Kits），購(gòu)自Magen生物公司；PrimeScript? One Step RT-PCR Kit， Ver.2 （Dye Plus）一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒（E.Z.N.A. ? Gel Extraction Kit）、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒（E.Z.N.A.? Plasmid DNA Mini Kit I），Omega公司產(chǎn)品； In-Fusion? HD Cloning Plus，購(gòu)自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS），購(gòu)自Bovogen公司；DMEM購(gòu)自Hyclone公司。

1.1.4" 主要儀器設(shè)備" PCR儀、電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；凝膠掃描成像系統(tǒng)，美國(guó)Syngene公司；超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；磁力攪拌器，美國(guó)IKA公司；漩渦振蕩器，杭州儀表電機(jī)廠；超聲細(xì)胞破碎儀，南京新辰生物科技有限公司；普通水平離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；冷凍離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；超速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；-80 ℃超低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；-4 ℃超低溫冰箱，中國(guó)中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；天平，多利斯（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" IBDV新型變異株代表株GD2021-08的分離鑒定" 本研究以IBDV變異株GD2021-08為IBDV新型變異株代表株，將其在SPF雞上盲傳3代分離純化GD2021-08，得到IBDV新型變異株GD2021-08胚毒。對(duì)IBDV VP2基因進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)PCR檢測(cè)外源病毒混合感染情況。

1.2.2" IBDV新型變異株代表株GD2021-08的TCID50測(cè)定" IBDV變異株GD2021-08的TCID50通過(guò)免疫間接熒光試驗(yàn)（IFA）來(lái)檢測(cè)，將2.3.4中的-80 ℃凍融的已過(guò)濾研磨上清液用10%FBS的DMEM（F12）培養(yǎng)基依次倍比稀釋10倍接種到CEF細(xì)胞上，共稀釋11個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)復(fù)孔加培養(yǎng)液8孔/100 μL，37 ℃條件下CO2培養(yǎng)箱孵育36 h后測(cè)定病毒效價(jià)。

1.2.3" IBDV新型變異株GD 2021-08的最小攻毒劑量的確定" 將GD2021-08連續(xù)做10倍倍比稀釋，分別按照2×104、2×103、200、20 TCID50/0.2 mL的劑量以點(diǎn)眼滴鼻的方式接種28日齡SPF雞，設(shè)3組劑量，每組10只雞，設(shè)空白對(duì)照組10只雞，每只雞接種PBS/0.2 mL，見(jiàn)表1。攻毒后第7天（7 dpi），解剖所有雞，剖檢并稱量體重。

1.2.4" 致病性試驗(yàn)方案及其分組" 為了研究IBDV新型變異株GD2021-08對(duì)SPF雞的致病性，將45只16日齡的SPF雞隨機(jī)分為3組，感染組（21只）、空白對(duì)照組（4只）、觀察組（10只）。感染組、觀察組SPF雞在16日齡以點(diǎn)眼滴鼻的方式感染200 TCID50/0.2 mL，IBDV新型變異株GD2021-08，空白對(duì)照組在相同日齡注射同等劑量的PBS溶液。攻毒后1～7 d，每天觀察雞臨床癥狀、存活情況并稱重，隨機(jī)剖檢感染組3只和空白對(duì)照組2只雞，采集法氏囊和脾臟，觀察法氏囊、脾臟病變情況，依據(jù)（1-1）式、（1-2）式計(jì)算囊重比和脾重比；根據(jù)（1-3）式計(jì)算囊重指數(shù)（Bursa：body-weight index， BBIX）。分別在攻毒后第1、3、5、7 天剖檢的法氏囊用4%甲醛固定，送武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行組織病理切片分析。觀察組感染后觀察臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)存活率、發(fā)病率，在攻毒后第25 天，對(duì)存活雞進(jìn)行稱重，觀察體重變化。

囊重比＝（法氏囊重量/體重）× 1000" "（1-1）式

脾重比＝（脾臟重量/體重）× 1000" "（1-2）式

BBIX＝攻毒組雞囊重比/空白對(duì)照組雞平均囊重比 （1-3）式

當(dāng)BBIXlt; 0.7時(shí)，判定法氏囊萎縮。

2" 結(jié)果

2.1" 存活率、發(fā)病率及體重變化

通過(guò)連續(xù)25 d對(duì)觀察組的存活率統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有雞死亡，也沒(méi)有明顯臨床癥狀出現(xiàn)，存活率100%，見(jiàn)圖1。但通過(guò)稱重發(fā)現(xiàn)感染7、25 d時(shí)觀察組的體重較空白對(duì)照組體重有所減輕，見(jiàn)圖2。

2.2" 感染后剖檢結(jié)果

為了進(jìn)一步評(píng)估IBDV新型變異株GD2021-08導(dǎo)致的病理?yè)p傷，攻毒后1～7 d進(jìn)一步對(duì)感染組、空白對(duì)照組進(jìn)行剖檢，剖檢結(jié)果如圖3所示。感染后3 d法氏囊較空白對(duì)照組有明顯萎縮、發(fā)黃，脾臟則無(wú)顯著變化，說(shuō)明IBDV新型變異株GD2021-08能導(dǎo)致法氏囊病理?yè)p傷。

稱重統(tǒng)計(jì)后通過(guò)脾重比（圖4）、囊重比（圖5）和BBIX指數(shù)（圖6）發(fā)現(xiàn)，感染組在攻毒后的第3天時(shí)囊重比快速下降，在攻毒后的第3～7天囊體比與空白對(duì)照組相比有極顯著差異（Plt; 0.001），脾重比在感染初期的第2、4 天腫大，在2、4、6 dpi時(shí)與空白對(duì)照組相比有極明顯差異（Plt; 0.001），BBIX指數(shù)圖中明顯可看出囊指數(shù)在感染后1～7 d逐漸下降，3 d后低于0.7。該結(jié)果與解剖結(jié)果一致，證明IBDV GD2021-08株對(duì)雞有明顯致病性。

2.3" 法氏囊病理切片結(jié)果

法氏囊組織切片結(jié)果如圖7。發(fā)現(xiàn)感染IBDV新型變異株GD2021-08組攻毒后的第3 天法氏囊開始出現(xiàn)明顯病理?yè)p傷，皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞壞死、溶解、大量減少，上皮細(xì)胞大量增生（紅色箭頭所指），結(jié)締組織增生（黃色箭頭所指），有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（綠色箭頭所指），在感染后的第7 天時(shí)伴有囊腫形成（藍(lán)色箭頭所指）。在空白對(duì)照組的雞中未觀察到明顯的病理?yè)p傷。

3" 討論

IBD是一種可引起免疫抑制的急性傳染病，可造成疫苗接種失敗。免疫失敗的原因可能與抗原變異、重組錯(cuò)配有關(guān)。變異株主要流行于北美洲，帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[10]。但在2015年有研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)東部多省從免疫雞群檢出多株變異株，經(jīng)檢測(cè)證實(shí)是不同于美國(guó)早期變異株的新型變異株。該毒株對(duì)雞不致死，可引起法氏囊嚴(yán)重萎縮，導(dǎo)致強(qiáng)烈免疫抑制，引起廣泛關(guān)注，未來(lái)可能成為養(yǎng)禽業(yè)新的威脅[11]。目前中國(guó)IBDV新型變異株的流行情況報(bào)道很少，因此，進(jìn)行IBDV新型變異株流行病學(xué)調(diào)查是十分必要的。通過(guò)遺傳進(jìn)化分析闡明流行病學(xué)特征，評(píng)估流行傳播與遺傳進(jìn)化趨勢(shì)，為IBDV的有效防控和疫苗研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

IBDV有兩種血清型，即血清Ⅰ型和血清Ⅱ型。血清I型有獨(dú)特的嗜法氏囊性，在雞的法氏囊中復(fù)制并引起免疫抑制，血清II型雖然可以感染火雞的不同組織，但對(duì)雞是非致病性的[12]。這兩種血清型可以通過(guò)病毒中和試驗(yàn)（VN）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）來(lái)鑒別，但使用間接免疫熒光（IFA）和ELISA測(cè)定方法無(wú)法區(qū)分，只能檢測(cè)出兩者共有的常見(jiàn)抗原。血清I型根據(jù)致病性和抗原性可大致分為四種：經(jīng)典毒株（Classical IBDV，cIBDV）、變異株（Variant IBDV）、vvIBDV超強(qiáng)毒株（Very varient IBDV）、新型變異株（Novel varient IBDV），它們會(huì)產(chǎn)生不同的致病結(jié)果[13]。IBDV基因組由雙節(jié)段雙鏈RNA（dsRNA）——A、B片段構(gòu)成。較大片段A和較小片段B都有5'末端非編碼區(qū)（5'-noncoding region，5'-NCR）、3'末端非編碼區(qū)（3'-noncoding region，3'-NCR）和編碼區(qū)[14]。最近幾年來(lái)，隨著A、B節(jié)段不斷的重組重配，中國(guó)東部出現(xiàn)IBDV新型變異株。在2019年，中國(guó)從6個(gè)省份中首次檢測(cè)到新型變異株IBDV[15]。這引起了人們對(duì)新型變異株的廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)陸續(xù)有人分離IBDV新型變異株并對(duì)其進(jìn)行各方面研究。

為了評(píng)估IBDV新型變異株的致病性。本文用IBDV新型變異株GD2021-08感染16日齡SPF雞，建立致病模型。結(jié)果表明IBDV新型變異株GD2021-08株導(dǎo)致雞群體重明顯減輕，剖檢發(fā)現(xiàn)攻毒雞群法氏囊明顯縮小且重量減輕，進(jìn)一步制作組織病理切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)法氏囊有明顯的病理?yè)p傷，皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞壞死、溶解、大量減少，上皮細(xì)胞大量增生，結(jié)締組織增生，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有囊腫形成。法氏囊作為雞主要的中樞免疫器官，與體液免疫有關(guān)，可以影響淋巴B細(xì)胞的發(fā)育。病理結(jié)果說(shuō)明該變異毒株對(duì)雞群免疫系統(tǒng)造成巨大損傷，嚴(yán)重影響雞群生長(zhǎng)發(fā)育，會(huì)給生產(chǎn)帶來(lái)潛在的經(jīng)濟(jì)損失。

4" 結(jié)論

本文對(duì)IBDV新型變異株GD2021-08致病性進(jìn)行研究，結(jié)果表明該毒株引起雞群體重減輕以及明顯的法氏囊萎縮和炎性病變，雖然不直接引起雞群的死亡，但是給雞群的生長(zhǎng)性能帶來(lái)了巨大的危害，本模型對(duì)生產(chǎn)防控提供臨床參考和指導(dǎo)。

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收稿日期：2024-08-14

基金項(xiàng)目：“十四五”廣東省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新十大主攻方向 “揭榜掛帥”項(xiàng)目（重大動(dòng)物疫病新型綜合防控技術(shù)）

第一作者：李群輝（1988—），男，博士，主要從事畜禽疾病防控，E-mail：492992437@qq.com

通信作者：王連想（1975—），男，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事畜禽疾病防控和臨床生產(chǎn)管控，E-mail：animsci@126.com