魔芋軟腐病病株與健株根系分泌物比較分析

摘""" 要：軟腐病是魔芋栽培中危害最嚴(yán)重的病害之一，目前無有效防控藥劑。為了解軟腐病病害發(fā)生與魔芋根系分泌物變化之間的關(guān)系，利用超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜（UHPLC -Q Exactive HF-X）分析魔芋健康植株（HK）與軟腐病病株（DK）根系分泌物的差異。結(jié)果表明，健康與發(fā)病植株根系分泌物顯著不同，鑒定到的差異代謝物有340種。HK中特有的代謝物有9種，其中苯丙烷和聚酮化合物有助于提高植物自身抗病性；DK中特有的代謝物有7種，其中麥芽六糖、乳糖-N-巖藻糖III有助于軟腐病病菌識別、侵染魔芋根系。差異代謝通路聚類分析結(jié)果表明，與代謝途徑相關(guān)的代謝物有212種，其中參與檸檬酸循環(huán)的檸檬酸含量在HK中上調(diào)，高于DK。研究結(jié)果為利用根系次生代謝物進(jìn)行軟腐病防控研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：魔芋；根系分泌物；軟腐病

中圖分類號：S632.3"""""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""""""""" 文章編號：1673-2871（2024）11-145-08

DOI：10.16861/j.cnki.zggc.2024.0167

收稿日期：2024-03-14；修回日期：2024-04-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（32072558）；湖北省種業(yè)高質(zhì)量發(fā)展專項；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2021-620-000-001-01）

作者簡介：周""" 潔，女，助理研究員，研究方向為特色薯芋類蔬菜種質(zhì)資源挖掘與利用。E-mail：384881257@qq.com

通信作者：吳金平，女，研究員，研究方向為特色薯芋類蔬菜種質(zhì)資源挖掘與利用。E-mail：274184394@qq.com

魔芋（Amorphophallus konjac）是天南星科多年生草本植物，在栽培學(xué)上屬于薯芋類作物，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一高含葡苷聚糖的植物[1]。魔芋葡甘聚糖可廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、環(huán)保、造紙、石油等行業(yè)，具有較高的應(yīng)用價值[2]。我國魔芋主要種植區(qū)域為云南、貴州、四川、陜西、湖北等的貧困山區(qū)，由于產(chǎn)值較高，已成為脫貧致富和鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)。據(jù)中國魔芋協(xié)會統(tǒng)計，2022年我國魔芋種植面積約14.6萬hm2，總產(chǎn)值150多億元，但在種植過程中，軟腐病頻發(fā)，輕則減產(chǎn)20%～30%，重則絕收，是目前魔芋種植的最大障礙。因此，如何有效降低該病害的發(fā)病率，是魔芋種植業(yè)急待解決的關(guān)鍵問題。

土壤與根系相關(guān)的微生物是植物健康狀況的重要組成部分[3]。前期研究表明，軟腐病菌侵染顯著改變魔芋根系內(nèi)生和根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，同時降低細(xì)菌群落豐度和多樣性[4-5]。植物通過向根際分泌低分子質(zhì)量的有機(jī)化合物來形成周圍的微生物群落[6]。根系分泌物可作為引發(fā)植物與根瘤菌和菌根真菌共生的信號[7]；番茄青枯菌的入侵導(dǎo)致番茄根系分泌物中酚類物質(zhì)增加[8]，番茄葉片受到病原菌侵染后，可增加根系蘋果酸釋放量，更多蘋果酸進(jìn)入根際后可以招募更多的有益菌向根際聚集，從而使番茄植株對病害產(chǎn)生防御反應(yīng)[9]。因此，植物可以通過修改根系分泌物的模式來招募有益的根際群落，從而有利于自身生長[7]。然而魔芋在受到軟腐病病菌侵染后根系分泌物如何受到影響的研究尚未見報道。筆者通過利用LC-MS技術(shù)分析魔芋軟腐病病株、健康植株根系分泌物的差異，進(jìn)一步明確軟腐病與魔芋根系分泌物的關(guān)系，為下一步藥劑施用、土壤養(yǎng)分調(diào)控、輪間作植物選擇等病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1"" 材料

魔芋品種為清江花魔芋，由恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院魔芋研究所提供，種芋質(zhì)量約100 g。2023年4月15日，芋種種植于湖北省恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)高新區(qū)1號露地，面積約300 m2，魔芋株距40 cm，行距60 cm。日常田間栽培管理。

1.2 收集根系分泌物

2023年7月28日，調(diào)查發(fā)現(xiàn)魔芋軟腐病發(fā)病率在20%左右，按照五點(diǎn)取樣法每點(diǎn)分別隨機(jī)選取長勢均勻的健康植株（HK）、軟腐病病株（DK）各1株，小心挖出魔芋。使用短期水培養(yǎng)收集法[10]，用自來水沖洗附著在根系表面的土壤，用蒸餾水沖洗根3次。將5株魔芋放入一個500 mL圓錐形燒瓶中，根部浸泡在300 mL蒸餾水中。在通風(fēng)條件下孵育6 h后，將培養(yǎng)液冷凍干燥后儲存在-80 °C冰箱，備用。

1.3 樣本制備

取50 mg固體樣本于2 mL離心管中，加入一顆直徑6 mm的研磨珠。通過含0.02 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）的400 μL提取液（甲醇與水體積比4∶1）進(jìn)行代謝產(chǎn)物提取。樣本溶液于冷凍組織研磨儀研磨6 min（-10 ℃，50 Hz），然后低溫超聲提取30 min（5 ℃，40 kHz）。將樣品靜置于-20 ℃，30 min后，離心15 min（4 ℃，13 000 r·min-1），吸取上清液至帶內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶中上機(jī)分析。

1.4 定性分析根系分泌物

委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行根系分泌物的代謝組提取、測定和分析。LC-MS 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件 Progenesis QI （Waters Corporation，Milford， USA） 進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，最終得到一個保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，同時將 MS質(zhì)譜信息與代謝公共數(shù)據(jù)庫HMDB（http：//www. hmdb. ca/）和Metlin（https：//metlin. scripps. edu/）以及美吉自建庫進(jìn)行匹配，得到代謝物信息。搜庫后的矩陣數(shù)據(jù)上傳美吉生物云平臺（https：//cloud. majorbio. com）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，數(shù)據(jù)矩陣用80%規(guī)則來去除缺失值，即保留至少一組樣品中非零值80%以上的變量，再進(jìn)行填補(bǔ)空缺值（原始矩陣中最小值填補(bǔ)空缺值），為減小樣品制備及儀器不穩(wěn)定帶來的誤差，用總和歸一化法對樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，得到歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣。同時刪除 QC 樣本相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）gt;30%的變量，并進(jìn)行l(wèi)og10對數(shù)化處理，得到最終用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用R 軟件包 ropls（Version1.6.2）進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交最小偏二乘判別分析（OPLS-DA），使用7次循環(huán)交互驗證來評估模型的穩(wěn)定性，并進(jìn)行student’s t 檢驗和差異倍數(shù)分析。差異代謝物的選擇基于OPLS-DA 模型得到的變量權(quán)重值（VIP）和 student’s t 檢驗 p 值來確定，設(shè)置VIPgt;1、plt;0.05 的代謝物為差異代謝物。

差異代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）進(jìn)行代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的代謝通路。采用Python軟件包scipy.stats進(jìn)行通路富集分析，并通過Fisher進(jìn)行精確檢驗，獲得與試驗處理最相關(guān)的生物學(xué)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

由圖1可知，健康與發(fā)病植株陰陽離子分離程度明顯，說明健康與發(fā)病植株根系分泌物顯著不同。由OPLS-DA模型參數(shù)可知，陽離子、陰離子模型參數(shù)值分別為0.90～1.00，0.85～1.00，其數(shù)值大于0.5接近1，均滿足此次OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠的要求。

2.2 健康與發(fā)病植株根系分泌物中差異代謝物篩選與鑒定

差異代謝物的篩選條件在設(shè)置為plt;0.05、VIPgt;1、上調(diào)/下調(diào)差異倍數(shù)gt;1的情況下，全部滿足差異篩選條件的陽離子峰是4273個，鑒定到的有名稱的差異代謝物是149個，其中上調(diào)75個，下調(diào)74個（圖2-a）；全部滿足差異篩選條件的陰離子峰是5799個，鑒定到的有名稱的差異代謝物是191個，其中上調(diào)111個，下調(diào)80個（圖2-b）。

根據(jù)HMDB Superclass分類規(guī)則，檢測的代謝物中含量最多的為脂質(zhì)和類脂分子（lipids and lipid-like molecules），有108種，占比40.15%；苯丙烷和聚酮化合物（phenylpropanoids and polyketides）40種，占比14.87%；有機(jī)雜環(huán)化合物（organoheterocyclic compounds）31種，占比11.52%；有機(jī)氧化合物（organic oxygen compounds）28種，占比10.41%；有機(jī)酸及其衍生物（organic acids and derivatives）27種，占比10.04%；苯環(huán)類化合物（benzenoids）14種，占比5.20%；核苷、核苷酸和類似物（nucleosides， nucleotides and analogue）13種，占比4.83%；有機(jī)氮化合物（organic nitrogen compounds）7種，占比2.60%；生物堿及其衍生物（alkaloids and derivatives）1種，占比0.37%（圖3）。在plt;0.05、VIPgt;1、上調(diào)/下調(diào)差異倍數(shù)gt;1.5的情況下，比較健康魔芋與發(fā)病魔芋根系物，發(fā)現(xiàn)代謝物下調(diào)特有的脂質(zhì)和類脂分子，上調(diào)特有的有機(jī)酸及其衍生物，核苷、核苷酸和類似物（表1）。

韋恩圖可以直觀表示代謝組中的共有差異代謝物以及特有差異代謝物。由圖4-a可知，HK與DK共同擁有的陽離子差異代謝物有619種；HK特有的代謝物有5種，分別為6-[（1Z） -2-羥基 -3-氧代 -1-烯基 -1-基] -7-甲氧基 -2H- 色胺 -2-酮｛6-[（1Z） -2-hydroxy-3-oxobut-1-en-1-yl]-7-methoxy-2H-chromen-2-ketone｝、荷包牡丹黃酮（buddleoflavonoloside）、4-O- 去甲基 -13-二氫阿霉素（4-O-Demethyl-13-dihydroadriamycinone）、粗皂甙L（tuberoside L）和3'-氨基-3'-脫氧亞胺葡糖苷酸（3'-amino-3'-deoxythimidine glucuronide）；DK特有的代謝物有2種，分別為二酰甘油[18：0/20：4（8Z，11Z，14Z，17Z）/0：0]｛DG[18：0/20：4（8Z，11Z，14Z，17Z）/0：0]｝和35-氨基 -30，31，32，33，34-戊醇（35-aminobacteriohopane-30，31，32，33，34-pentol）。由圖4-b可知，HK與DK共同擁有的陰離子代謝物有484種；DK特有的代謝物有5種，分別為麥芽六糖（maltohexaose）、溶血磷脂酰膽堿（16：0）[lysoPC（16：0）]、溶血磷脂酰膽堿[18：2（9Z，12Z）]｛lysoPC[18：2（9Z，12Z）]｝、7，8-二氫嘔吐葉酚9-[鼠李糖基-（1-gt; 6）-葡萄糖苷]｛7，8-dihydrovomifoliol 9-[rhamnosyl-（1-gt;6）-glucoside]｝、乳糖-N-巖藻糖III（lacto-N-fucopentaose III）；HK特有的代謝物有4種，分別為二磷酸腺苷（ADP）、鳥苷二磷酸腺苷（guanosine diphosphate adenosine）、雌馬酚（equol）、二磷酸胞苷（cytidine diphosphate）。HK特有代謝物分類為苯丙烷和聚酮化合物，核苷、核苷酸和類似物；DK特有代謝物分類為有機(jī)氧化合物（表2）。

2.3 健康與發(fā)病植株根系分泌物的差異代謝物相關(guān)通路分析

對健康與發(fā)病植株根系分泌物的差異代謝物進(jìn)行功能通路的統(tǒng)計，共匹配到3條功能通路，分別是代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、環(huán)境信息處理（environmental information processing），與代謝途徑相關(guān)的代謝物有212種（表3）。對本研究鑒定到的差異代謝物的代謝通路進(jìn)行統(tǒng)計，代謝物顯著富集的功能通路有2條，分別是代謝通路中的玉米素生物合成（zeatin biosynthesis）、檸檬酸循環(huán)（citrate cycle）和嘌呤代謝（purine metabolism）及環(huán)境信息處理通路中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporters）。HK與DK相比，上調(diào)的代謝物有ADP、檸檬酸、2-羥基腺嘌呤、L-天（門）冬氨酸，下調(diào)的代謝物有S-腺苷甲硫氨酸、尿酸和脫氧胞苷，其中只有檸檬酸參與的檸檬酸循環(huán)為上調(diào)（表4）。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，根系分泌物是植物與土壤及土傳病菌相互作用的橋梁，而化學(xué)趨向性是許多病原菌感受寄主植物信號并成功侵入寄主的重要方式[11-13]。Chen等[14]研究表明，抗病黃瓜的根系分泌物中糖類物質(zhì)較少，對尖孢鐮刀菌產(chǎn)生抑制作用；而感病、中抗黃瓜的根系分泌物中糖類物質(zhì)較多，從而促進(jìn)病原菌的生長。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在軟腐病病株（DK）根系分泌物中特有代謝物麥芽六糖、乳糖-N-巖藻糖III，這可能是糖類物質(zhì)有助于軟腐病病菌在魔芋根際及根表面定殖與繁殖，從而導(dǎo)致魔芋發(fā)病的原因，這與張愛華等[15]研究發(fā)現(xiàn)糖類對人參細(xì)菌性軟腐病病菌有明顯的趨化作用觀點(diǎn)相一致。

根系分泌物是調(diào)控土壤微生物群落的關(guān)鍵因素，不僅可以作為碳源為土壤中的微生物提供營養(yǎng)和能量，而且可以作為信號物質(zhì)吸引或排斥特異的微生物[16-17]。Hao等[18]研究表明，在水稻和西瓜間作系統(tǒng)中，水稻根系分泌物中的香豆酸可以抑制西瓜枯萎病病原菌的孢子萌發(fā)，從而降低西瓜枯萎病的發(fā)病率；De等[19]研究表明，生防菌熒光假單胞菌對番茄分泌物中的蘋果酸、檸檬酸表現(xiàn)出明顯的趨化性；Rudrappa等[20]研究表明，擬南芥受病原菌侵染后根系會分泌蘋果酸，而蘋果酸可以特異地吸引有益的枯草芽孢桿菌并誘導(dǎo)其定殖，從而達(dá)到自衛(wèi)的目的。本研究通過對健康魔芋與軟腐病魔芋根系分泌物代謝進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在健康魔芋中檸檬酸參與的檸檬酸代謝上調(diào)，這可能是檸檬酸誘導(dǎo)拮抗菌的趨化反應(yīng)和生物膜形成，通過與病原菌進(jìn)行生態(tài)位的競爭而發(fā)揮生防作用[21]。

苯丙烷化合物是衍生自肉桂酸的天然產(chǎn)物，可以預(yù)先形成或誘導(dǎo)針對病原體感染的物理和化學(xué)屏障，并分泌最終可以誘導(dǎo)植物防御相關(guān)基因表達(dá)的信號分子[22]。而聚酮化合物是次級代謝產(chǎn)物中最大的一類，包括大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)類、蒽醌類和聚醚類在內(nèi)的許多化合物，這些化合物能有效提高作物抗病性[23]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，健康魔芋特有的代謝物分類為苯丙烷和聚酮化合物，而這些物質(zhì)有助于誘導(dǎo)植物免疫應(yīng)答[24]，從而有助于增強(qiáng)魔芋對軟腐病病菌侵染的抗性，最終植株呈現(xiàn)出健康狀態(tài)。

綜上所述，根系分泌物是影響植物與微生物互作的重要因素，植物通過調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物也通過改變植物根系分泌物的組分達(dá)到利于自身生存的目的[25]。筆者通過健康、發(fā)病魔芋根系分泌物差異的研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)病魔芋根系分泌物中糖代謝物增多，而健康魔芋根系的檸檬酸、苯丙烷和聚酮化合物上調(diào)，那么在軟腐病防控中是否可以通過增施檸檬酸、苯丙烷或聚酮化合物，從而提高魔芋抗病性，還需要進(jìn)一步研究。

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Comparative analysis of root exudates between healthy and soft rot diseased Amorphophallus konjac

ZHOU Jie1， ZHAO Qinghua2， ZHANG Jie3， YANG Chaozhu2， QI Chuandong1， GUO Fengling1， WU Jinping1

（1. Key Laboratory of Ecological Cultivation on Alpine Vegetables， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement/Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Enshi Academy of Agricultural Sciences， Enshi 445000， Hubei， China; 3. Xiangyang Academy of Agricultural Sciences， Xiangyang 441000， Hubei， China）

Abstract： Soft rot is one of the most serious diseases in konjac cultivation， and there is currently no effective chemical agents. In order to understand the relationship between the changes of konjac root exudates induced by soft rot disease， the differences of root exudates between healthy（HK）and soft rot diseased konjac（DK）were analyzed by high-performance liquid chromatography tandem mass Fourier transform（UHPLC-q Exactive HF-X）. The results showed that the root exudates of healthy and diseased konjac were significantly different， and 340 different metabolites were identified. There were 9 special metabolites in HK， among which phenylpropane and polyketone compounds were helpful to improve the disease resistance of plants. There were 7 special metabolites in DK， among which maltohexaose and lacto-N-fucopentaose III contributed to the recognition and infection of soft rot bacteria in konjac roots. Cluster analysis of differential metabolic pathways revealed that there were 212 metabolites related to metabolic pathways， among which the tricarboxylic acid cycle of citric acid" was up-regulated in HK， higher than in DK. The research results provide a theoretical basis for the use of secondary metabolites in root for soft rot prevention and control.

Key words： Konjac; Root exudates; Soft rot diseased