黃精根狀莖無菌快繁體系建立

摘要" 為進(jìn)一步完善黃精無菌快繁技術(shù)體系提供技術(shù)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以選育的七葉黃精根狀莖作為外植體材料，測(cè)定不同消毒處理的根莖污染率、死亡率和不同濃度6-BA（6-Benzylminopurine）與NAA（1-Naphthalic acid）組合對(duì)其莖段腋芽的萌芽率影響，探索該植物根狀莖無菌快繁體系的建立。結(jié)果表明，以超聲波清洗機(jī)消毒15"min的處理效果最好，污染率和死亡率分別為20%和17%；恒溫振蕩器消毒15"min的污染率和死亡率分別為27%和37%，最佳消毒時(shí)間15"min；以MS為基本培養(yǎng)基，采用C12-Y組合（2.0"mg/L 6-BA+0.5"mg/L NAA）處理有芽莖段的效果最好，其平均萌芽率達(dá)76.67%，無芽莖段的平均萌芽率達(dá)56.67%。

關(guān)鍵詞" 黃精；根狀莖；無菌快繁體系；消毒處理

中圖分類號(hào)" S567"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A"""""" 文章編號(hào)" 1007-7731（2024）22-0097-04

DOI號(hào)" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.22.021

基金項(xiàng)目 遼寧省教育廳2021年度科學(xué)研究經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目“黃精品種選育與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培示范”（LJKZ1218）。

作者簡(jiǎn)介 程貴蘭（1977—），女，河北廊坊人，碩士，副教授，從事種苗快繁研究。

通信作者 高涵（1982—），女，遼寧營口人，碩士，講師，從事食品檢測(cè)及功能性食品開發(fā)；蔡智軍（1976—），男，內(nèi)蒙古赤峰人，教授，從事功能性食品研究。

收稿日期 2024-09-08

Establishment of aseptic rapid propagation system for the rhizomes of Polygonatum sibiricum

CHENG Guilan""" WANG Ya’nan""" ZHAO Zhihan""" GAO Han""" CAI Zhijun""" JIA Qingxian

（Liaoning Agricultural Vocational and Technical College， Yingkou 115009， China）

Abstract" To provide a technical basis for further improving the aseptic rapid propagation technology system of Polygonatum sibiricum. The seven leaf Polygonatum sibiricum rhizomes were selected as explant materials， the root and stem contamination rate and mortality rate of different disinfection treatments， as well as the germination rate of axillary buds in stem segments treated with different concentrations of 6-BA （6-Benzylminopurine） and NAA （1-Naphthalic acid） combinations were measured， a aseptic rapid propagation system had been established for the rhizomes of this plant. The results showed that the treatment effect was best when disinfected with an ultrasonic cleaning machine for 15"minutes， with a contamination rate of 20% and a mortality rate of 17%; The contamination rate and mortality rate of the constant temperature oscillator after 15"minutes of disinfection were 27% and 37%， respectively， and the optimal disinfection time was 15"minutes; MS was used as the basic medium， the C12-Y combination （2.0"mg/L 6-BA+0.5"mg/L NAA） showed the best treatment effect on stem segments with buds， with an average germination rate of 76.67% and an average germination rate of 56.67% for stem segments without buds.

Keywords" Polygonatum sibiricum; rhizome; aseptic rapid propagation system； disinfection treatment

黃精（Polygonatum sibiricum Redouté）為百合科多年生草本植物，以根莖入藥，是一味常用的補(bǔ)陰藥，應(yīng)用歷史悠久?！吨腥A人民共和國藥典》[1]（2020版）收載了3種植物來源的黃精，分別是滇黃精（Polygonatum kingianum Collett amp; Hemsl.）、黃精和多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），均以干燥根莖入藥，因其根莖形狀不同，分別稱為大黃精、雞頭黃精和姜形黃精[2]。據(jù)《中國植物志》[3]記載，滇黃精主產(chǎn)云南、四川和貴州等地；黃精主產(chǎn)黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、陜西和內(nèi)蒙古等地，多花黃精主產(chǎn)四川、貴州、湖南、湖北、河南（西、南部）和江西等地。

黃精根狀莖呈圓柱狀，結(jié)節(jié)處膨大，節(jié)間一端粗、一端細(xì)，較粗的一端有短分枝，該根狀莖類型所制成的藥材為雞頭黃精。其莖高50～90"cm，輪生葉，每輪4～6枚，條狀披針形，先端拳卷或彎曲成鉤。鐘子龍等[4]研究多花黃精根莖萌發(fā)新芽及生長(zhǎng)習(xí)性，表明該植物可選擇3年生的根莖切成種塊進(jìn)行苗木繁育。王海洋等[5]研究滇黃精離體快繁體系建立及優(yōu)化，表明該植物根狀莖誘導(dǎo)分化的最適培養(yǎng)基配方為1/2 MS（Murashige and skoog）+6-BA（6-Benzylminopurine）2.0"mg/L+2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid）0.2"mg/L+蔗糖30"g/L+瓊脂5.5"g/L。研究團(tuán)隊(duì)于2019年在遼寧營口、撫順等地開展黃精品種資源收集，通過野外定點(diǎn)鑒定和試驗(yàn)地人工栽培等方法，選育出若干株七葉輪生的黃精，并于2022年開花結(jié)實(shí)。本試驗(yàn)以選育的七葉黃精根狀莖作為外植體材料，測(cè)定不同消毒處理的根莖污染率、死亡率以及不同濃度6-BA與NAA（1-Naphthylacetic acid）組合對(duì)其莖段腋芽的萌芽率的影響，探索七葉黃精根狀莖無菌體系的建立，為進(jìn)一步完善七葉黃精無菌快繁技術(shù)體系提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院黃精種植基地，選取3年生生長(zhǎng)健壯且無病蟲害的七葉黃精根狀莖。6-BA、NAA均購于北京酷萊博生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同消毒處理對(duì)七葉黃精根莖滅菌效果的影響 將預(yù)處理后的植物材料放入裝有2.5%次氯酸鈉溶液的試管中，分別放置在恒溫振蕩器（型號(hào)ZD-85）和超聲波清洗機(jī)（型號(hào)KQ-500DM）中處理5、10、15和20"min，比較不同消毒設(shè)備和消毒時(shí)間對(duì)其滅菌效果的影響。每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次。

1.2.2 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA組合對(duì)七葉黃精莖段腋芽萌發(fā)的影響 該植物根狀莖分有芽和無芽?jī)煞N類型，獲得無菌材料后，比較其有芽和無芽根狀莖在13個(gè)濃度組合培養(yǎng)基上的腋芽萌發(fā)情況，每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)基設(shè)計(jì)見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根狀莖預(yù)處理 將挖取的根狀莖清洗干凈，選擇生長(zhǎng)健壯的白色或乳白色且無病斑的根狀莖，去除莖節(jié)處著生的須根，用75%乙醇棉球?qū)⒃囼?yàn)材料外表面擦拭干凈，將其切成3～5"cm莖段，置于流水下沖洗12"h。

1.3.2 外植體接種前滅菌處理 將沖洗后的根狀莖莖段置于超凈工作臺(tái)上，節(jié)的上下端各保留1.0～1.5"cm，最終莖段長(zhǎng)度在2～3"cm；將處理好的試驗(yàn)材料放入無菌小試管中（規(guī)格30"mm×80"mm），每個(gè)小試管中放2個(gè)外植體，用75%乙醇消毒30"s，將75%乙醇倒掉后再加入2.5%的次氯酸鈉溶液，溶液體積為試管容量的2/3，以保證外植體被完全浸沒，并加蓋密封；10個(gè)/捆，分別放入恒溫振蕩器（設(shè)定溫度25"℃、40 Hz）和超聲波清洗機(jī)（設(shè)定溫度25"℃、80 r/min）清洗5、10、15和20"min。

1.3.3 接種與過渡培養(yǎng) 消毒后，取出試管中的莖段，用無菌水漂洗3次，然后置于無菌濾紙上吸干其表面水分，置于無菌培養(yǎng)皿，將其切割成大小1"cm、節(jié)上保留1/3、節(jié)下保留2/3的短莖段，避免傷及芽，然后將其接種于添加30"g/L蔗糖、7"g/L瓊脂和pH 5.5～6.0 的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行過渡培養(yǎng)，每瓶接種1個(gè)外植體。置于25"℃暗環(huán)境下培養(yǎng)2"d，再轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度2 000 lx條件下培養(yǎng)，光周期12 L∶12 D，10"d后測(cè)定其污染率和死亡率。

1.3.4 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將經(jīng)過過渡培養(yǎng)的有芽和無芽莖段分別轉(zhuǎn)接于各芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種1個(gè)單芽段，重復(fù)3次。置于25"℃、光照強(qiáng)度2 000 lx條件下培養(yǎng)，光周期12 L∶12 D。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 無菌材料污染率與死亡率 滅菌效果指標(biāo)污染率和死亡率計(jì)算如式（1）～（2）。

污染率（%）=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

（1）

死亡率（%）=死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

（2）

1.4.2 不定芽誘導(dǎo)萌芽率 根狀莖在培養(yǎng)基上培養(yǎng)40"d后觀察腋芽萌發(fā)情況，有芽莖段以出現(xiàn)腋芽、無芽莖段以芽眼處有圓突狀萌芽點(diǎn)長(zhǎng)出視為萌發(fā)。萌芽率計(jì)算如式（3）。

萌芽率（%）=萌芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

（3）

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)根莖滅菌效果的影響

由表2可知，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種消毒設(shè)備處理下的污染率均呈遞減趨勢(shì)。采用恒溫振蕩器處理20"min的平均污染率（17%）低于處理15"min （27%），其平均死亡率較處理15"min高33百分點(diǎn)；采用超聲波清洗機(jī)處理15"min的平均污染率（20%）高于處理20"min （13%），其平均死亡率較處理20"min低60百分點(diǎn)；采用超聲波清洗機(jī)處理15"min的平均污染率和平均死亡率較采用恒溫振蕩器處理15"min分別低7和20百分點(diǎn)。綜合來看，采用超聲波清洗機(jī)處理15"min對(duì)七葉黃精根莖滅菌效果較好。

2.2 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)莖段腋芽萌發(fā)的影響

由表3可知，外植體有芽莖段的平均萌芽率普遍高于無芽莖段，隨著6-BA濃度的提高，平均萌芽率呈遞增趨勢(shì)，尤以C12-Y組合（2.0"mg/L 6-BA+0.5"mg/L NAA）有芽莖段的平均萌芽率最高，為76.67%，較CK1提升36.67百分點(diǎn)，與除C11-Y、C9-Y外組合差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001），無芽莖段的平均萌芽率56.67%；C9-Y組合（1.5"mg/L 6-BA+0.5"mg/L NAA）有芽莖段的平均萌芽率73.33%，無芽莖段的平均萌芽率53.33%，與對(duì)照組（CK1和CK2）差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）；C8-Y組合（1.5"mg/L 6-BA+0.1"mg/L NAA）有芽莖段的平均萌芽率也較高，為66.67%，與CK1差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），無芽莖段的平均萌芽率50.00%，與CK2差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）。綜合來看，使用有芽莖段對(duì)黃精莖段腋芽萌發(fā)效果較好，以C12-Y組合（2.0"mg/L 6-BA+0.5"mg/L NAA）處理的效果最好，對(duì)平均萌芽率提升有明顯的促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

七葉黃精的根狀莖長(zhǎng)期生長(zhǎng)在泥土中，附著較多的微生物，因此其根狀莖的消毒程度與無菌體系密切相關(guān)。本研究對(duì)七葉黃精根狀莖預(yù)處理后，分別用75%乙醇和2.5%的次氯酸鈉溶液消毒，采用恒溫振蕩器和超聲波清洗機(jī)消毒15"min效果最佳，采用超聲波清洗機(jī)的消毒效果最好，污染率為20%，這與劉紅美等[6]分別采用75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液消毒3次，每次5"min的多次短時(shí)滅菌法，消毒效果較好的結(jié)論相似。周新華等[7]用75%乙醇對(duì)多花黃精根狀莖進(jìn)行表面滅菌30"s，再用0.1%氯化汞滅菌10"min，其外植體材料無菌保存率達(dá)73.2%。本研究發(fā)現(xiàn)，使用同一消毒設(shè)備消毒不同時(shí)間對(duì)根莖外植體污染率和死亡率產(chǎn)生較大影響，當(dāng)消毒時(shí)間過長(zhǎng)，污染率降低的同時(shí)死亡率也升高，可能是因?yàn)橄緯r(shí)間過長(zhǎng)對(duì)外植體材料造成損傷，這與黨裳霓等[8]研究結(jié)果基本一致；而消毒時(shí)間過短導(dǎo)致污染率和死亡率均較高，可能是因?yàn)辄S精中多糖、氨基酸等營養(yǎng)成分促使雜菌迅速擴(kuò)增。

黃精腋芽的萌發(fā)情況與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、使用濃度及不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之間的組合配比有關(guān)。本研究以MS為培養(yǎng)基，通過研究6-BA和NAA的濃度配比對(duì)七葉黃精腋芽萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)6-BA和NAA濃度在0.5～2.0"mg/L組合配比均能誘導(dǎo)有芽、無芽莖段不定芽萌發(fā)，以2.0"mg/L 6-BA+0.5"mg/L NAA的效果最好，與農(nóng)艷豐等[9]以MS為培養(yǎng)基，2.0"mg/L 6-BA+0.2"mg/L NAA+0.5"mg/L 2，4-D組合誘導(dǎo)滇黃精根莖芽點(diǎn)萌芽率達(dá)62.9%的結(jié)果相似。劉紅美等[6]以MS培養(yǎng)基添加0.2"mg/L 2，4-D與2.0"mg/L 6-BA 誘導(dǎo)出不定芽，說明2.0"mg/L 6-BA有利于黃精不定芽的萌發(fā)；牟小翎等[10]研究發(fā)現(xiàn)，以MS為培養(yǎng)基，添加4.0"mg/L 6-BA對(duì)泰山野生黃精不定芽的誘導(dǎo)效果較佳，說明單一激素也能誘導(dǎo)黃精根狀莖不產(chǎn)生定芽；孫俊威等[11]以MS為培養(yǎng)基，添加1.0"mg/L ZT（Zeatin）與0.2"mg/L NAA多花黃精根狀莖不定誘導(dǎo)率為87.9%，說明其他激素對(duì)黃精根莖不定芽誘導(dǎo)也有較好的效果。

綜上，以超聲波清洗機(jī)消毒15"min的處理效果最好，污染率和死亡率分別為20%和17%；恒溫振蕩器消毒15"min的污染率和死亡率分別為27%和37%，最佳消毒時(shí)間為15"min。以MS為培養(yǎng)基，采用C12-Y組合（2.0"mg/L 6-BA+0.5"mg/L NAA）處理有芽莖段的效果最好，其平均萌芽率達(dá)76.67%，無芽莖段的平均萌芽率達(dá)56.67%。

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（責(zé)任編輯：吳思文）