超濾技術(shù)在動物疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用選擇與常見問題

摘要：超濾技術(shù)是當(dāng)前分離純化領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，既能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物分離目的，又能夠達(dá)成提升純度目的。本文首先對超濾技術(shù)及膜選擇原則進(jìn)行概述，綜述幾類重要的動物疫苗產(chǎn)品選擇超濾膜及其對產(chǎn)品質(zhì)量的提升效果，同時對超濾技術(shù)應(yīng)用過程中存在的問題與常見的解決措施進(jìn)行匯總，提出動物疫苗產(chǎn)品應(yīng)用超濾工藝的關(guān)注要點。

關(guān)鍵詞：超濾技術(shù)；動物疫苗；問題；解決措施

近年來，伴隨著動物養(yǎng)殖規(guī)模逐步轉(zhuǎn)向規(guī)?；?、集約化后，相關(guān)的養(yǎng)殖集團(tuán)、專業(yè)養(yǎng)殖戶等對動物疫病防控所使用的疫苗類產(chǎn)品提出了更高的要求，如更低的副反應(yīng)發(fā)生率、更高的抗體表達(dá)水平、更簡潔的免疫程序等，這些要求使得動物疫苗生產(chǎn)企業(yè)加快工藝升級與優(yōu)化來提升疫苗產(chǎn)品品質(zhì)。超濾技術(shù)不僅能應(yīng)用于早期的澄清工藝，又可以應(yīng)用于后期的濃縮純化工藝，使動物疫苗企業(yè)看到了其在動物疫苗生產(chǎn)工藝的應(yīng)用前景，不僅能夠有效地提升抗原濃度，又能大幅提升純度，可以解決疫苗因抗原含量低免疫效果差、純度低副反應(yīng)大及免疫后持續(xù)時間短等問題，同時超濾技術(shù)也能很好地與層析技術(shù)銜接，為疫苗定制化、高端化奠定基礎(chǔ)。本文對超濾技術(shù)概述、超濾膜孔徑選擇依據(jù)及在幾類重要的動物疫苗生產(chǎn)過程中應(yīng)用、常見問題與解決措施進(jìn)行匯總，為超濾技術(shù)在更多動物疫苗類產(chǎn)品應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 超濾技術(shù)概述

超濾技術(shù)，屬于膜分離技術(shù)中的一種，膜分離是以高分子薄膜為介質(zhì)，以泵或壓力為推動力，對不同組分的溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、提純和濃縮的技術(shù)。根據(jù)高分子膜的孔徑/截留分子量不同，可以得到不同大小的分離介質(zhì)，從而形成了微濾（MF）、超濾（UF）、納濾（NF）和反滲透（RO）等技術(shù)。超濾技術(shù)通常使用能保留0.001～0.2 μm大小的超濾膜實現(xiàn)蛋白質(zhì)、病毒、多糖、熱源、細(xì)菌、膠體等分級分離[1]。

超濾技術(shù)的優(yōu)勢在于：①條件溫和，室溫環(huán)境下即可操作，裝置簡單，產(chǎn)熱小；②具備減菌、除菌效果；③物理分離，無化學(xué)添加；④無相變，能耗低，工藝簡單[2]。

超濾技術(shù)在動物疫苗產(chǎn)品制備過程中應(yīng)用價值，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)疫苗產(chǎn)品的料液澄清、去除核酸、內(nèi)毒素等小分子雜質(zhì)的目的，還可以達(dá)到濃縮、洗濾、分級純化的要求[3]。

2 超濾膜的選擇依據(jù)

2.1 膜材質(zhì)選擇

超濾膜材質(zhì)較為豐富，常見種類有醋酸纖維素膜、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯等，或以這些材質(zhì)為基礎(chǔ)形成的共聚膜，膜材質(zhì)特點比較見表1[4]。

在動物疫苗產(chǎn)品中應(yīng)用較多的材質(zhì)通常為聚砜類，經(jīng)改性后其親水性更好，抗污能力更高。

2.2 孔徑選擇

超濾技術(shù)所使用的超濾膜孔徑約為1～100 nm，截留相對分子質(zhì)量（molecular weight cut off，MWCO） 為1×104～1×106，大部分的超濾膜生產(chǎn)廠家提供的資料顯示，超濾膜截留分子量與超濾膜的孔徑關(guān)系如表2，但在膜孔徑選擇時，往往是按照標(biāo)稱截留分子量（NMWC）分級。超濾膜孔徑的通用選擇標(biāo)準(zhǔn)：蛋白質(zhì)濃縮時，蛋白質(zhì)分子量應(yīng)為膜孔標(biāo)稱分子量的2～5倍，蛋白分子比膜孔越大，蛋白質(zhì)收率會越高；澄清時（微濾常見），蛋白質(zhì)透過膜孔時，膜孔徑與蛋白質(zhì)大小之間不低于一個數(shù)量級的差異，差異越大，收率會越高，但需要平衡澄清效果與蛋白質(zhì)收率關(guān)系。還需注意蛋白質(zhì)分子量雖然是選擇超濾膜孔徑的關(guān)鍵因素，但不可忽視的因素還有蛋白質(zhì)的形狀、在溶液中穩(wěn)定性等。對稱性越均一的球狀蛋白，相同孔徑的膜截留率越高。穩(wěn)定性越高的蛋白質(zhì)，溶液pH、鹽濃度等因素改變后對蛋白質(zhì)形狀的影響越低，在超濾過程中回收率才能越高。

動物疫苗類產(chǎn)品，目標(biāo)產(chǎn)物大多是球形顆粒，對于超濾膜的選擇依據(jù)通用選擇標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最優(yōu)的孔徑應(yīng)當(dāng)是在收率、純度、經(jīng)濟(jì)效益等方面平衡后的結(jié)果。

3 超濾技術(shù)在動物疫苗產(chǎn)品的應(yīng)用

1）口蹄疫疫苗?？谔阋撸╢oot and mouth disease，F(xiàn)MD）是WOAH規(guī)定的重要的病毒性烈性傳染病，是動物疫苗防控的重點，近年來，口蹄疫疫苗產(chǎn)品也在不斷引入超濾、層析等技術(shù)，使疫苗質(zhì)量有明顯提升。口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）顆粒直徑在28～30 nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，分子量為8.08×106 u[5]，目前國內(nèi)外多個廠家的中空纖維柱300/500 kDa產(chǎn)品均已成功應(yīng)用到口蹄疫疫苗生產(chǎn)的濃縮洗濾中，不同廠家產(chǎn)品資料數(shù)據(jù)顯示濃縮倍數(shù)在6～50倍之間，收率均可達(dá)到90%以上，經(jīng)過2～3倍洗濾后可以進(jìn)行進(jìn)一步的精純，可以用的層析方法有離子交換法、疏水法、凝膠過濾法及親和等方法。王繼華等[6]報告其使用二級過濾方式澄清病毒液后使用PALL公司切向流式超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮純化，在本動物上的抗體滴度和轉(zhuǎn)陽率表現(xiàn)上，濃縮疫苗明顯高于普通疫苗，疫苗攻毒保護(hù)試驗結(jié)果也顯示濃縮純化制備的疫苗明顯優(yōu)于普通滅活疫苗，具有更好的免疫效果。戎善東等[7]也分析比較了超濾濃縮疫苗與常規(guī)疫苗免疫效果差異，結(jié)果表明不同劑量組血清抗體水平較常規(guī)疫苗發(fā)生顯著升高（P＜0.05），陽轉(zhuǎn)率高于常規(guī)疫苗。

2）豬圓環(huán)疫苗。豬圓環(huán)病毒?。╬orcine circovirus desease，PCVD）已發(fā)展為嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的一種新的傳染病，疫苗防控對其意義重大。豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）顆粒直徑大約為17～20 nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)[8]，在全病毒滅活疫苗生產(chǎn)中，可以選用0.45 μm中空纖維柱澄清病毒收獲液，再選用100 kda中空纖維柱濃縮澄清液，配合洗濾去除雜蛋白。有個別廠家經(jīng)實驗摸索得出30 kDa中空纖維柱即可以完全截留豬圓環(huán)病毒，并且能達(dá)到去除雜蛋白的效果。

3）禽流感疫苗。禽流感（Avian influenza virus，AIV）屬于WOAH規(guī)定的甲類傳染病，可引起人致病，疫苗接種是當(dāng)前人類預(yù)防流感的首選措施。A型流感病毒呈多形性，其中球形直徑80～120 nm[9]，對于超濾工藝選擇時，需要關(guān)注到病毒的多形特性，在收率、純度、工藝時效之間進(jìn)行優(yōu)化選擇。羅丹[10]在MDCK細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗純化工藝研究中發(fā)現(xiàn)使用100 kDa膜包濃縮時，雜質(zhì)去除緩慢，膜包容易堵塞，病毒濃縮效果差；更換300 kDa的膜包后，濃縮效率提升明顯，病毒損失小，病毒回收率在90%～93%。超濾工藝選擇500～750 kDa中空纖維柱，可以實現(xiàn)去除雜蛋白效果。

4）豬繁殖與呼吸障礙綜合征疫苗。豬繁殖與呼吸障礙綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗稱藍(lán)耳病，以母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率為主要特征，免疫接種是控制該病的防治措施之一。其病毒粒子直徑48～83 nm，平均大小為60～65 nm的球形，核衣殼直徑為25～30 nm[11]。超濾工藝選擇100 kDa中空纖維柱，可以起到去除大部分雜蛋白，降低免疫時的副反應(yīng)。另也可使用其他方式澄清料液后，使用超濾濃縮方式提升病毒液效價，如任培森等[12]使用二級過濾（1.0～0.5 μm、0.45 μm）方式除去病毒液的雜蛋白后，再使用8 kDa膜包（PALLICON II超濾器）濃縮10倍后，雜蛋白去除率高達(dá)90%以上，濃縮10倍的疫苗病毒液效價較未濃縮純化病毒液效價高8.5倍。

5）豬瘟疫苗。豬瘟（Infection with classical swine fever virus，CSF）是一種高度急性、熱性、接觸性傳染病，免疫預(yù)防是控制豬瘟大面積流行的主要預(yù)防措施。豬瘟病毒（hogcholera virus，Swine fever virus）為有囊膜二十面體球狀病毒，病毒粒子直徑40～50 nm，核衣殼直徑約為19 nm[13]，在工藝開發(fā)階段，已有100 kDa中空纖維柱用于濃縮純化，可以起到去除大部分雜蛋白，起到降低免疫時的副反應(yīng)作用。

4 超濾膜應(yīng)用過程常見問題與解決方案

超濾膜在使用過程中無法避免濃差極化現(xiàn)象、膜污染、水通量降低、膜清洗、使用壽命、保存等問題。有效的預(yù)防控制不僅能提升超濾過程的效率，還能有助于膜的清洗及延長膜的壽命，目前針對上述存在的問題，主要解決途徑是在操作過程減緩不利現(xiàn)象發(fā)生，同時采取一些補(bǔ)救措施去改善不利現(xiàn)象發(fā)生后帶來的不利后果。

1）濃差極化現(xiàn)象。超濾過程中，在跨膜壓的作用下，在膜表面被截流的溶質(zhì)持續(xù)堆積，濃度逐漸增高形成高濃度區(qū)，即極化邊界區(qū)，其會造成可透過溶質(zhì)與水分子流通阻力增加，膜的通量下降，是超濾過程中產(chǎn)生的重要現(xiàn)象[14-15]。緩解濃差極化現(xiàn)象：①可以通過增加料液的流速提高膜表面的沖刷剪切力，減少邊界層厚度；②適當(dāng)降低跨膜壓，膜表面高濃度的溶質(zhì)會逆向擴(kuò)散到溶液中，消減濃差極化現(xiàn)象；③合理提高料液的溫度，通過降低料液黏度來加速膜表面高濃度溶質(zhì)反向擴(kuò)散至溶液內(nèi)，提升膜的通透性；④可以采用間歇運行方式，當(dāng)膜表面壓力差降為零時，經(jīng)過一定時間擴(kuò)散后，濃差極化現(xiàn)象就會有所好轉(zhuǎn)[16]。

2）膜污染。是由于膜孔隙內(nèi)部存在雜質(zhì)，其可能阻塞膜孔徑通道，使有效的膜孔徑數(shù)量和孔徑減少，導(dǎo)致透水通量下降[14，17]。緩解膜污染，最主要的途徑是減少料液中存在的膠體粒子、有機(jī)物、微生物、微生物污染等雜質(zhì)組分，通常在超濾前可對料液進(jìn)行預(yù)處理，常見方式有過濾、預(yù)絮凝離心、微濾等方式[18]。

3）水通量降低。反映的是膜孔在一定的跨膜壓加持下，膜的透過性能，往往在超濾前后用于評價膜清洗狀態(tài)，造成水通量降低的因素與膜孔堵塞情況、清洗條件、清洗質(zhì)量等有密切關(guān)系，膜水量下降是必定存在的現(xiàn)象，但做好清洗是延緩水通量下降最優(yōu)的選擇。

4）膜清洗。主要是以物理和化學(xué)清洗法為主，將膜表面及孔道內(nèi)的污染物清除，使膜的通量能有效地恢復(fù)。

物理清洗法時：①可以選擇等壓水沖洗法，關(guān)閉濾出端、全開回流端，使因壓力差黏附于膜表面的污垢松動，也可先使用緩沖鹽溶液增加蛋白溶解度，達(dá)到清洗膜表面的目的；②可借助水-氣界面效應(yīng)去除較堅實的雜質(zhì)[19]，將少量潔凈壓縮空氣與純化水同時通入超濾膜內(nèi)，水-氣混液在膜表面會存在劇烈攪運作用瓦解頑固雜質(zhì)；③30～40 ℃熱水（純化水）沖洗，對黏稠而又有熱溶性的雜質(zhì)去除效果明顯；④以極低的流速進(jìn)行反向沖洗，將嵌入孔道內(nèi)的雜質(zhì)沖洗出，但需控制好流速防止中空纖維的完整性遭到破壞。

化學(xué)清洗法：①根據(jù)膜材質(zhì)類型可以選用酸或堿清洗，去除無機(jī)鹽或蛋白、油脂類雜質(zhì)；②可以選用氧化性清洗劑，1%～3%過氧化氫、500～1 000 mg/L次氯酸鈉等水溶液可以去除有機(jī)物質(zhì)污染[20]；③加入酶洗滌劑，如0.5%～1.5%胃蛋白酶、胰蛋白酶，對去除蛋白質(zhì)、多糖、油污污染物質(zhì)有效。

5）使用壽命。超濾膜一般廠家都是質(zhì)保三年，但使用壽命往往與膜的使用頻次、清洗維護(hù)、操作條件等密切相關(guān)。達(dá)到延長使用壽命時，需要做好以下幾點：①在使用過程后要及時、充分清洗膜表面污染物，盡可能減少水通量下降現(xiàn)象；②膜組件避免暴曬或冷凍，儲存環(huán)境要適宜；③使用后的膜，杜絕干燥脫水現(xiàn)象發(fā)生；④膜組件使用前使用純化水清洗，使用溶液最好過濾，避免鋒利的細(xì)微物質(zhì)對膜的損傷。

6）保存。主要是保持膜濕潤，防止膜脫水收縮導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損壞，通透量下降。保存前必須徹底沖洗、清洗和漂洗。通常保存可分為短期保存和長期保存，短期保存一般是超濾膜在暫停使用后10 d以內(nèi)，可以使用15 ppm（ml/L）殺菌劑溶液充滿膜組件，關(guān)閉所有閥門，保持膜的密封與減菌作用。長期保存時，可以使用一些保護(hù)液后密封保存，如含甘油、亞硫酸氫鈉的混合水溶液。

5 結(jié)語與展望

隨著動物疫苗向著市場化發(fā)展，靠超濾技術(shù)來澄清和濃縮樣品會更加廣泛，其具備操作簡單、工藝經(jīng)濟(jì)且易于放大等特點為精制純化起到很好的過渡作用。筆者認(rèn)為動物類疫苗產(chǎn)品要想更好地發(fā)揮超濾工藝，需要對工藝進(jìn)行思考，注重對以下方面的重點關(guān)注：①對料液性質(zhì)有更清楚的認(rèn)知，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、病毒和細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)、合成培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基等應(yīng)用，使目標(biāo)產(chǎn)物與工藝相關(guān)雜質(zhì)逐漸變得更易區(qū)分，對各組分特性做深入的了解更有助于后續(xù)純化工藝設(shè)計與去除非目標(biāo)組分；②預(yù)處理模式的優(yōu)化，收獲產(chǎn)物為胞內(nèi)產(chǎn)物時，需要裂解細(xì)胞，使目的蛋白質(zhì)釋放到溶液中，而對于胞外產(chǎn)物則不需裂解，但對目的產(chǎn)物的澄清方式基本一致，包括離心、深層過濾、微濾等方式，每一種工藝方式都對細(xì)胞密度、剪切力敏感度、產(chǎn)物的穩(wěn)定性等有考量，因此需要對最優(yōu)條件工藝條件進(jìn)行摸索，在許多情況下，離心機(jī)和過濾的組合會是澄清的最優(yōu)選擇，當(dāng)然輔助澄清介質(zhì)（硅藻土、絮凝劑等）加入會對懸浮顆粒、膠體類和小顆粒物質(zhì)的去除更有效，對超濾工藝發(fā)揮其濃縮及洗濾目的更有益；③超濾工藝應(yīng)用，憑借良好的預(yù)處理超濾過程可以對工藝條件、運行參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化與組合，在傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗制備中，必定會有廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] 弗利金杰.工業(yè)生物技術(shù)下游收獲與純化[M].科學(xué)出版社，2019：408.

[2] 張露瀛，賈麗娜.超濾技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2017（12）：52-53.

[3] 李國軍，姜媛媛，王瑩，等.超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中應(yīng)用[J].生物技術(shù)世界，2016（3）：227.

[4] 黃凱楠，吉學(xué)智，王飛，等.超濾膜技術(shù)概述[J].化工進(jìn)展，2021（S2）：219-225.

[5] 劉湘濤，張強(qiáng)，郭建宏.口蹄疫[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：43.

[6] 王繼華，邵明，施程洪，等.抗原濃縮純化工藝對口蹄疫滅活疫苗免疫效果評價[J].中國獸醫(yī)學(xué)報.2011（5）：684-686.

[7] 戎善東，莫巖.超濾純化工藝對口蹄疫滅活疫苗免疫效果的影響分析[J].中國畜禽種業(yè)，2014（6）：43-44.

[8] 汲全柱.豬圓環(huán)病毒病的防控措施[J].養(yǎng)殖與飼料，2017（1）：75-76.

[9] 尹馨.H7N9亞型禽流感病毒的進(jìn)化監(jiān)測及關(guān)鍵生物表型的分子機(jī)制研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2021.

[10] 羅丹.MDCK細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗純化工藝研究[D].武漢生物制品研究所，2021.

[11] 李陽，潘文，徐宗香，等.豬繁殖與呼吸障礙綜合征的研究進(jìn)展[J].中國豬業(yè)，2013，8（6）：54-57.

[12] 任培森，呂文靜，丁壯.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗純化濃縮效果的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013（2）：103-106.

[13] 陳艷新，李志偉.豬瘟病毒致病機(jī)制及豬瘟診斷防控措施[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010（5）：153-156.

[14] 郭立安.蛋白質(zhì)色譜分離技術(shù)[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2011：32-37.

[15] ABHINAV A SHUKLA， MARK R ETZEL， SHISHIR GADAM.生物制藥工業(yè)中生產(chǎn)規(guī)模的生物分離[M].中國輕工業(yè)出版社，2011：203

[16] 李學(xué)恭，王維民.微濾膜分離過程中的濃差極化現(xiàn)象及其減弱措施[C].2007中國農(nóng)業(yè)工程學(xué)會農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程分會學(xué)術(shù)年會暨中國中部地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)學(xué)研研討會論文集：204-206.

[17] ZEMAN L J， ZYDNEY A L. Microfiltration and Ultrafiltration： Principles and Applications[M].CRC" Press，2017.

[18] 于媚清，林英姿.超濾膜污染的預(yù)防與控制現(xiàn)狀[J].中國資源綜合利用.2014，32（1）：25-27

[19] 何攀，何鳳華，王海燕，等.操作條件對浸沒式超濾膜污染影響的中試研究[J].給水排水，2010（3）：12-17.

[20] 劉珂.次氯酸鈉化學(xué)清洗對超濾膜性能影響的研究[D].哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2020.

收稿日期：2023-09-13

作者簡介：杜曉杰（1989— ），中級獸醫(yī)師，碩士，從事動物疫苗純化工藝開發(fā)與應(yīng)用工作，E-mail：duixiaojie@tecon-bio.com。

*通信作者：賀筍，E-mail：hesun@tecon-bio.com。