清溪烏鱉肽緩解小鼠白細胞減少能力的研究

摘 要：目的：探究清溪烏鱉肽緩解小鼠白細胞數(shù)目減少的能力。方法：將15只SPF級C57BL/6J雄性小鼠隨機分為溶劑對照組，低劑量（2 mg·g-1）給藥組和高劑量（4 mg·g-1）給藥組，每組共5只，采用環(huán)磷酰胺腹腔注射干預21 d，構(gòu)建白細胞減少小鼠模型，觀察小鼠體重、主要器官病變狀態(tài)、白細胞數(shù)目變化。結(jié)果：實驗組和對照組小鼠之間體重沒有顯著差異；實驗組和對照組小鼠之間主要臟器未見明顯病變；以4 mg·g-1的劑量每日給小鼠灌胃清溪烏鱉肽，24 d后小鼠白細胞數(shù)目較對照組顯著升高。結(jié)論：與對照組相比，給藥組小鼠體重未見明顯變化，未產(chǎn)生不良反應(yīng)且主要器官未見明顯病變，清溪烏鱉肽給藥后有效緩解了小鼠白細胞數(shù)目的減少，并且這種效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。

關(guān)鍵詞：清溪烏鱉；清溪烏鱉肽；白細胞減少

The Ability of Qingxi" Black Soft-Shelled Turtle Peptides to Alleviate Leukopenia in Mice

LI Chang1， WANG Yunjie2， ZHAO Xinyue1， WANG Jingjing2， BIAN Xiaohong1

（1.China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China; 2.Zhejiang Qingxi Turtle Industry Co.， Ltd.， Huzhou 313219， China）

Abstract： Objective： To explore the ability of Qingxi black soft-shelled turtle peptides （QXBSTPs） to alleviate the decrease in mice. Method： Fifteen SPF grade C57BL/6J male mice were randomly divided into a solvent control group， In the low-dose （2 mg·g-1） administration group， high-dose （4 mg·g-1） administration group， with 5 mice in each group， after 21 days of the intervention， cyclophosphamide was intraperitoneally injected to construct a leukopenia mouse model. The changes of mouse body weight， lesions in the major organs， and the number of leukocytes in the mice were observed. Result： There was no significant difference in body weight between the experimental and the control groups. There were no significant lesions in the major organs between the experimental and control groups. The leukocyte counts of the mice were significantly higher than those of the control group after 24 days of gavage of QXBSTPs at a dose of 4 mg·g-1 daily. Conclusion： Compared with the control group， no significant changes in body weight， no adverse effects and no significant lesions in major organs were observed in the administered group. The administration of QXBSTPs effectively alleviated the reduction of leukocyte number in the mice， and this effect showed a dose-dependent pattern.

Keywords： Qingxi black soft-shelled turtle; Qingxi black soft-shelled turtle peptides; leukocytopenia

中華鱉隸屬于爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬，因其肉質(zhì)鮮美，具有高蛋白、低脂肪酸的特性同時兼具藥用保健價值[1-2]，已經(jīng)成為我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。清溪烏鱉是從中華鱉野生體色變異個體中基于體色黑化特定選育出的中華鱉類品種（系）[3]，是經(jīng)農(nóng)業(yè)部審定的國家水產(chǎn)新品種，品種登記號為G S0l-003-2008[4-5]。

目前，與清溪烏鱉的相關(guān)研究有烏鱉的養(yǎng)殖技術(shù)[6-9]，包括飼料投喂、親本選育、水質(zhì)以及溫室養(yǎng)殖[10]等內(nèi)容；清溪烏鱉營養(yǎng)成分研究包括營養(yǎng)學方面，研究發(fā)現(xiàn)烏鱉中的黑色素具有較強的光穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性，因其自身黑色素中含有穩(wěn)定的自由基，可以吸收可見光和紫外光的輻射[11]；烏鱉黑色素還具有較強的抗氧化能力，能夠提高人體免疫力，延緩衰老等功效[12]；烏鱉口服液具有明顯的抗疲勞作用和對腦缺血具有保護作用[13]；烏鱉返春口服液用于卵巢低儲備患者，對免疫降低引起的卵巢早衰有一定功效[14-15]。另有研究表明清溪花鱉可能通過降低血清中的炎癥因子，來改善尿酸鈉所導致痛風大鼠的病理變化[16]。清溪烏鱉肽是從清溪烏鱉中提取得到的蛋白水解產(chǎn)物，已有研究表明清溪烏鱉肽具有影響免疫力的作用[17]，從清溪烏鱉中獲取的清溪烏鱉肽，還具有較高的藥食價值，同時能夠提供人體所需的維生素、氨基酸、脂肪酸等，對免疫細胞數(shù)目的提高也具有一定的效果[18]。本文通過檢測清溪烏鱉肽對人體免疫細胞數(shù)目的影響，以探究清溪烏鱉肽緩解小鼠白細胞減少的能力。

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是一種烷化劑類抗腫瘤藥物，該藥物在合適的濃度時能夠在體內(nèi)代謝產(chǎn)生酰胺氮芥，其具有干擾核酸復制和蛋白合成的作用。本文利用環(huán)磷酰胺能使血細胞數(shù)量下降，免疫細胞功能降低的副作用，來構(gòu)建小鼠的白細胞減少模型[19]。通過對C57BL/6J小鼠進行腹腔注射，構(gòu)建白細胞減少小鼠模型，用清溪烏鱉肽對小鼠進行灌胃治療，通過監(jiān)測小鼠外周血中白細胞數(shù)目來評估該供試品緩解白細胞減少的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清溪烏鱉肽，A公司（批號20230401）；環(huán)磷酰胺，上海阿拉?。簧睇}水（生產(chǎn)批號20220802），安徽靚水亭醫(yī)療器械有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

普通冰箱，TCL集團；SQP電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Vortex-Genie 2渦旋混合儀器，Scientific Industries；小鼠飼養(yǎng)籠具，鄭州極碩科技有限公司；真空采血管，碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；血細胞計數(shù)板，鹽城市鹽都區(qū)永康實驗器材廠；載玻片，江蘇世泰實驗器材有限公司；血蓋片，江蘇世泰實驗器材有限公司；ADVIA 2120全自動血液分析儀，西門子；吸管，廣州潔特生物過濾股份有限公司。

1.3 實驗動物

使用SPF級C57BL/6J雄鼠，將小鼠放于溫度為20～26 ℃、濕度為40%～70%，12 h晝夜輪替的動物飼養(yǎng)房中進行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，鼠飼料為標準顆粒飼料。本實驗所有C57BL/6J小鼠均由江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2020-0009。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物實驗分組

將SPF級C57BL/6J雄性小鼠隨機分為3組，每組共5只，其中溶劑對照組5只，注射10 mg·mL-1生理鹽水溶液；低劑量給藥組5只，注射現(xiàn)配的200 mg·mL-1清溪烏鱉肽溶液；高劑量給藥組5只，注射現(xiàn)配的400 mg·mL-1清溪烏鱉肽溶液。

1.4.2 溶液制備

①供試品溶液。清溪烏鱉肽（批號20230401）淡黃色固體粉末，避光，密封于4 ℃保存。給藥前臨用臨配，以生理鹽水為溶劑，將清溪烏鱉肽配制成濃度為200 mg·mL-1、400 mg·mL-1的溶液。②環(huán)磷酰胺溶液。環(huán)磷酰胺，白色固體粉末，避光，密封于4 ℃保存。給藥前臨用臨配，以生理鹽水配制成10 mg·mL-1溶液。

1.4.3 模型構(gòu)建

在0 d時，通過向小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液（100 mg·kg-1）來建立白細胞減少的小鼠模型，在小鼠身上進行了為期21 d的預處理。隨后分別按照體重以2 mg·g-1、4 mg·g-1的劑量將清溪烏鱉肽灌胃給給藥組小鼠，對照組則灌胃等體積的生理鹽水，給藥按表1進行，每天1次。

1.4.4 白細胞計數(shù)

在24 d時，采用帶有抗凝劑的真空采血管收集小鼠血液，利用全自動血液分析儀檢測外周血白細胞總數(shù)。

1.4.5 指標采集

每天對處理后的小鼠進行體重檢測，并用帶有抗凝劑的離心管采集小鼠血液，檢測小鼠白細胞數(shù)目。隨后對小鼠進行安樂死，解剖觀察小鼠主要臟器的顏色、大小、是否有病變情況等。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 9.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重檢測結(jié)果分析

經(jīng)清溪烏鱉肽灌胃24 d后，均未出現(xiàn)小鼠死亡情況，在同一時間段記錄3組小鼠體重變化如圖1所示。高劑量給藥組（4 mg·g-1）與低劑量給藥組（2 mg·g-1）的組間未見顯著差異；各給藥組與對照組之間均無顯著差異（P＞0.05），各組小鼠整體上體重波動幅度接近。

2.2 小鼠解剖后臟器觀察

3組小鼠解剖后臟器的變化情況見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組小鼠的肺顏色、大小均無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)明顯病變；心臟顏色、大小均無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)明顯病變；肝臟顏色、大小均無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)明顯病變；胃顏色、大小均無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)明顯病變；腎臟顏色、大小均無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)明顯病變；部分脾臟有顏色變化，但未發(fā)現(xiàn)明顯病變。綜上，說明清溪烏鱉肽沒有對小鼠主要器官產(chǎn)生明顯影響。

2.3 小鼠外周血中白細胞數(shù)目檢測結(jié)果

使用帶有抗凝劑的真空采血管收集小鼠血液，并對其中的白細胞數(shù)目進行檢測。由圖3可知，高劑量組的小鼠白細胞數(shù)目顯著高于對照組的小鼠白細胞數(shù)目（P＜0.05），說明高劑量的清溪烏鱉肽具有緩解小鼠白細胞數(shù)目減少的能力。而低劑量組的小鼠白細胞數(shù)目與對照組相比則無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

當前抗腫瘤藥物、化療等治療手段大多為非特異性治療手段，抗腫瘤的同時也會殺死正常細胞，降低人體的免疫力。SAKAI等[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨著患者年齡的增長，這種治療方式造成的白細胞數(shù)目降低、免疫力降低等不良反應(yīng)也會越發(fā)嚴重。環(huán)磷酰胺通過干擾癌細胞的DNA合成和修復來抑制其增殖而被廣泛用于抗癌治療，本實驗利用環(huán)磷酰胺的毒副作用造成的外周血細胞減少，進而抑制正常免疫功能細胞數(shù)目，來構(gòu)建白細胞數(shù)目減少模型[21]。配制清溪烏鱉肽溶液灌胃處理，來檢測清溪烏鱉肽對小鼠白細胞數(shù)目減少的影響，具有一定的合理性。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，清溪烏鱉肽（4 mg·g-1）

具有顯著提高小鼠白細胞數(shù)目的能力，可在一定程度上緩解小鼠白細胞數(shù)目的減少。BERNADACH等[22]研究發(fā)現(xiàn)，化療手段、抗腫瘤藥物的使用會造成機體體重降低，腹瀉、食管吞咽困難、嘔吐等因素均與體重降低相關(guān)。心、肝、脾、肺、腎等器官在維持人體生命活動中發(fā)揮著重要作用，而化療藥物的使用會引起重要臟器毒性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)清溪烏鱉肽對小鼠體重、主要臟器沒有產(chǎn)生明顯影響。

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