基于熒光探針技術(shù)檢測(cè)糧油儲(chǔ)運(yùn)中的赭曲霉毒素A

摘 要：為實(shí)現(xiàn)糧油儲(chǔ)運(yùn)中真菌毒素的快速檢測(cè)，本文建立基于熒光探針技術(shù)檢測(cè)赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的熒光傳感方法。通過制備硫化銅納米顆粒（Copper Sulfide Nanoparticles，CuS NPs）以及在CuS NPs上修飾OTA單體克隆抗體（Antibody，Ab）形成硫化銅納米顆粒-OTA單克隆抗體免疫信號(hào)標(biāo)記物（CuS-Ab NPs）進(jìn)行熒光檢測(cè)，采用外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，OTA濃度在0.1～200.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.01 ng·mL-1，加標(biāo)回收率為93.89%～109.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～5.12%。該方法檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確性高、特異性好，適用于糧油儲(chǔ)運(yùn)中OTA的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：熒光探針技術(shù)；赭曲霉毒素A（OTA）；加標(biāo)回收率

Detection of Ochratoxin A in Grain and Oil Storage and Transportation Based on Fluorescence Probe Technology

DU Ruiting

（Hohhot Grain and Oil Quality Testing Center， Hohhot 010070， China）

Abstract： In order to realize the rapid detection of mycotoxins in grain and oil storage and transportation， a fluorescence sensing method based on fluorescence probe technology was established to detect ochratoxin A （OTA）. Copper sulfide nanoparticles （CuS NPs） were prepared and OTA monoclonal antibody （Ab） was modified on CuS NPs to form copper sulfide nanoparticles-OTA monoclonal antibody immune signal marker （CuS-Ab NPs） for fluorescence detection， and external standard method was used for quantification. The results showed that the linear relationship of OTA concentration was good in the range of 0.1 ng·mL-1 to 200.0 ng·mL-1， the detection limit of the method was 0.01 ng·mL-1， the recovery rate was 93.89% to 109.96%， and the relative standard deviation was 2.37% to 5.12%. This method has high sensitivity， accuracy and specificity， and is suitable for OTA detection in grain and oil storage and transportation.

Keywords： fluorescent probe technology; ochratoxin A （OTA）; spiked recovery rate

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及生活水平的提高，人們對(duì)糧油質(zhì)量的關(guān)注度日益增加[1]。綠色、無毒無害的食品不僅能夠滿足人們?nèi)粘Ｋ璧臓I(yíng)養(yǎng)膳食，且不會(huì)對(duì)人體造成任何傷害。然而，在糧油儲(chǔ)運(yùn)過程中，食品易受到真菌毒素、殺蟲劑等物質(zhì)的污染，對(duì)人們健康造成嚴(yán)重威脅[2]。因此，有必要采取有效的技術(shù)手段對(duì)糧油質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，從而確保糧油安全。糧油中最具代表性的毒素包括赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（Zearalenone，ZEN）、伏馬毒素（Fumonisin，F(xiàn)B1）、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）及黃曲霉毒素（Aflatoxin B1，AFB1）和T-2毒素等[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，OTA與動(dòng)物的腎毒性相關(guān)，并有可能造成動(dòng)物肝臟受損[4]，對(duì)人體健康產(chǎn)生極大威脅。目前，針對(duì)糧油中真菌毒素檢測(cè)常用的技術(shù)手段包括色譜分析、傳感器以及免疫分析[5]等。其中，基于熒光探針的檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、快速、樣品消耗低等優(yōu)點(diǎn)，但該方法在檢測(cè)OTA的應(yīng)用研究中鮮少報(bào)道。基于此，本文建立基于熒光探針技術(shù)檢測(cè)糧油儲(chǔ)運(yùn)中OTA的方法，以實(shí)現(xiàn)真菌毒素的快速、高效檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

玉米、咖啡和大豆，購(gòu)自某大型超市。

巰基乙酸，阿拉丁試劑有限公司；氯化銅，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaOH、濃硫酸，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硫代乙酰胺，天津博迪化工股份有限公司；戊二醛50%，天津市大茂化學(xué)試劑廠；2-嗎啉乙磺酸，天津渤化化學(xué)試劑有限公司；N-N二甲基甲酰胺，北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺、牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司。上述所有試劑均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品OTA（1 mg·mL-1）、ZEN（1 mg·mL-1）、FB1（5 mg·mL-1）、DON（5 mg·mL-1）、AFB1（10 mg·mL-1）和T-2毒素（10 mg·mL-1），北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；OTA單克隆抗體（5 mg·mL-1）、抗原（4 mg·mL-1），山東綠都科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

S210 pH計(jì)、AL240電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MK3酶標(biāo)儀、F1微量移液器、Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾公司；DHG-9245A恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科儀器有限公司；F97Pro熒光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；Mili-Q純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；LS13320激光粒度，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；JEM-2100F掃描電鏡、D/max 2500 X射線衍射儀，日本理學(xué)株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 納米顆粒及免疫信號(hào)標(biāo)記物的制備

（1）硫化銅納米顆粒（Copper Sulfide Nanoparticles，CuS NPs）的制備。在100 mL超純水中加入1.705 g CuCl2·2H2O和13.85 mL巰基乙酸，混合攪拌30 min，加入濃度為20 mg·mL-1的NaOH溶液，使溶液的pH值達(dá)到9.0。然后，加入0.751 g硫代乙酰胺，在50 ℃條件下反應(yīng)6 h并通入N2，以充分去除氧氣。最后用超濾離心管離心洗滌3次，并將其分散于超純水中，制備得到CuS NPs。

（2）硫化銅納米顆粒-OTA單克隆抗體免疫信號(hào)標(biāo)記物（CuS-Ab NPs）的制備。分別取100 μL濃度為32 mg·mL-1的N-羥基琥珀酰亞胺和濃度為20 mg·mL-1的N-N二甲基甲酰胺（用2-嗎啉乙磺酸緩沖液配制，pH=5.5）溶液，與1 mL CuS NPs懸浮液混合，活化CuS NPs表面的羧基，在25 ℃條件下反應(yīng)2 h，離心后去除上清液，再將1 mL濃度為220 μg·mL-1的OTA單克隆抗體加入其中，于4 ℃下振蕩孵育12 h，離心。最后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，制備得到CuS-Ab NPs。

1.3.2 定量檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

①對(duì)黑色聚苯乙烯微孔板的表面用200 μL濃度為2.5%的戊二醛（PBS緩沖液溶解）氨基活化2 h，之后使用PBS洗滌3次；②在活化后的微孔板上加入50 μL濃度為30 μg·mL-1的OTA抗原，37 ℃孵育2 h以固定OTA抗原，用PBS緩沖液洗滌3次后，再加入120 μL濃度為5%的牛血清白蛋白溶液，再次用PBS緩沖液洗滌3次；③將50 μL濃度為0.7 mg·mL-1的CuS-Ab NPs和不同濃度的OTA加入到固定有OTA抗原的微孔板中，37 ℃反應(yīng)60 min，并用PBS緩沖液洗滌3次；④為溶解CuS-Ab NPs免疫標(biāo)記物的Cu2+，將200 μL濃度為0.1 mol·L-1的鹽酸溶液加入到微孔板中，于37 ℃下振蕩反應(yīng)30 min；⑤加入5 μL濃度為0.5 mg·mL-1的銅離子熒光探針繼續(xù)振蕩45 min，進(jìn)行熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，用PBS緩沖液將OTA的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為不同濃度梯度（0.1 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1）的OTA，并依據(jù)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 特異性實(shí)驗(yàn)

在檢測(cè)中可能存在被多種真菌毒素污染的現(xiàn)象，因此選取AFB1、DON、ZEN、FB1以及T-2毒素等干擾物質(zhì)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。這些毒素與OTA單克隆抗體相結(jié)合時(shí)，會(huì)發(fā)生假陽性。在實(shí)驗(yàn)中，選取OTA濃度為1 ng·mL-1，其他毒素濃度為10 ng·mL-1，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 樣品前處理方法

分別稱取1 g大豆面、玉米面和咖啡面置于5 mL離心管中，加入2 mL濃度為10 ng·mL-1的OTA標(biāo)準(zhǔn)液，漩渦振蕩5 min，然后在轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液，并過0.45 μm微濾膜，最后用PBS緩沖液稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 CuS-Ab NPs濃度的優(yōu)化

通過研究不同濃度CuS-Ab NPs對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度的變化，可知CuS-Ab NPs濃度為0.5～0.7 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨CuS-Ab NPs濃度的增大而增強(qiáng)；當(dāng)濃度在0.7～0.9 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度基本不變。因此，選擇CuS-Ab NPs濃度為0.7 mg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 OTA抗原濃度的優(yōu)化

通過研究不同OTA抗原濃度下熒光強(qiáng)度的變化，可知OTA抗原濃度為10～30 μg·mL-1時(shí)，熒光強(qiáng)度隨OTA抗原濃度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)OTA抗原濃度為30～50 μg·mL-1時(shí)，熒光強(qiáng)度保持不變。因此，選擇OTA抗原濃度為30 μg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

通過研究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，可知在20～60 min，Cu2+探針發(fā)生開環(huán)導(dǎo)致水解反應(yīng)產(chǎn)物逐漸增多，且熒光強(qiáng)度增大；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過60 min后，CuS-Ab NPs和OTA抗原的濃度、熒光強(qiáng)度均降低。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為60 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.3.2項(xiàng)所示方法，進(jìn)行熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物在495 nm激發(fā)光極下發(fā)出508～650 nm的發(fā)射光，且與熒光強(qiáng)度成正比，熒光強(qiáng)度在554 nm處達(dá)到峰值。因此，選取在554 nm熒光強(qiáng)度下對(duì)OTA進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。以O(shè)TA濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=-5.211x+8 426，相關(guān)系數(shù)為R2=0.693 8，表明OTA濃度在0.1～200.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3 檢出限

以3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，計(jì)算得到檢出限為0.01 ng·mL-1，表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)糧油樣品中OTA的快速檢測(cè)，且靈敏度高。

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證基于熒光探針檢測(cè)糧油中毒素OTA的特異性，選取1.3.3項(xiàng)中提到的5種毒素作為干擾物質(zhì)，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。圖2中，縱坐標(biāo)為空白對(duì)照組（F0）/實(shí)驗(yàn)組（F）。當(dāng)只加入OTA時(shí)，F(xiàn)0/F值最大；當(dāng)加入5種干擾物時(shí)，F(xiàn)0/F值較小且相差較小，表明干擾物質(zhì)不能與OTA結(jié)合。結(jié)果表明，OTA和抗體間具有高結(jié)合作用，特異性良好。

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

選取被OTA污染的玉米、大豆和咖啡按照本研究中建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，以研究基于熒光探針技術(shù)對(duì)糧油中真菌毒素檢測(cè)的適用性。同時(shí)，采用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附方法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在0.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的加標(biāo)水平下，按照ELISA法測(cè)定不同樣品中OTA的加標(biāo)回收率為88.36%～109.00%，而按照本研究中建立方法所測(cè)定的結(jié)果為93.89%～109.96%；ELISA方法計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.35%～6.32%，而基于本研究中建立方法的結(jié)果為2.37%～5.12%。對(duì)比可知，兩種方法結(jié)果基本保持一致，表明基于熒光探針技術(shù)對(duì)糧油中OTA含量的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較高。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于熒光探針技術(shù)檢測(cè)OTA的熒光傳感方法。結(jié)果表明，OTA濃度在0.1～200 ng·mL-1線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.01 ng·mL-1，加標(biāo)回收率為93.89%～109.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～5.12%。該方法檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確性高、特異性好，適用于糧油儲(chǔ)運(yùn)中OTA的檢測(cè)。

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