超聲輔助提取大蒜素工藝研究

摘 要：為探究優(yōu)化超聲輔助提取大蒜素的工藝條件，為大蒜的深加工提供依據(jù)，以大蒜素含量為檢測指標(biāo)，在傳統(tǒng)乙醇溶劑浸提的基礎(chǔ)上，采取超聲波輔助萃取技術(shù)，探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲功率3個因素對大蒜素含量的影響，并在此基礎(chǔ)上開展3因素3水平的正交試驗(yàn)，借助極差分析和方差分析，得出最佳的超聲輔助萃取工藝。結(jié)果表明，3個因素對大蒜素含量的影響均存在極顯著差異，3個因素對大蒜素含量的影響大小排序?yàn)槌暪β剩境晻r間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，同時得出了最佳提取工藝參數(shù)組合，即超聲輔助功率1 000 W、超聲萃取時間35 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%。

關(guān)鍵詞：大蒜素；有機(jī)溶劑；超聲輔助；正交試驗(yàn)

Study on Ultrasonic Assisted Extraction of Allicin

LI Wenhui， LYU Zhiyuan

（Xinjiang Huachun bio-pharmaceutical Co.， Ltd.， Urumqi 830000， China）

Abstract： In order to explore the optimization of the technological conditions of ultrasonic-assisted extraction of allicin and provide a basis for the deep processing of garlic， the content of allicin is taken as the detection index， and on the basis of traditional ethanol solvent extraction， ultrasonic assisted extraction technology is adopted to explore the influence of three factors： ethanol volume fraction， ultrasonic time and ultrasonic power on the content of allicin. On this basis， the orthogonal test of three factors and three levels is carried out， and the best ultrasonic-assisted extraction process is obtained by means of range analysis and variance analysis. The results show that the effects of the three factors on the content of allicin are significantly different， the order of influence of three factors on the content of allicin is ultrasonic power＞ultrasonic time＞ethanol volume fraction， and the optimal extraction parameters are obtained， that is， ultrasonic auxiliary power of 1 000 W， ultrasonic extraction time of 35 min and ethanol volume fraction of 75%.

Keywords： allicin; organic solvent; ultrasonic assisted; orthogonal experiment

大蒜（Allium sativum L.）性溫、味辛，是餐桌上最常見的食物之一，其可賦予食物辛辣氣味，同時其具有調(diào)節(jié)胰島素、抗癌、降低血脂和抗炎殺菌等功效，亦可入藥，是一種典型的食藥兩用植物[1]。

大蒜素（Allicin）是天然存在于大蒜鱗莖中的一種有機(jī)硫化合物，是蒜氨酸在蒜氨酸酶的催化下生成的硫代亞磺酸酯類化合物，為淡黃色油狀液體，學(xué)名為二烯丙基硫代亞磺酸酯。大蒜素是大蒜的重要生物活性物質(zhì)之一，且具有大蒜特有的辛辣刺激氣味，是國際公認(rèn)的具有保健作用和藥用價值的生物活性成分[2]?，F(xiàn)如今，國內(nèi)外學(xué)者對大蒜素藥理作用的研究越來越廣泛和深入。大量的科學(xué)研究表明，大蒜素易透過紅細(xì)胞膜及磷脂雙分子層，然后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與部分胞內(nèi)的巰基化合物發(fā)生反應(yīng)，發(fā)揮其獨(dú)特的藥理作用[3]。大蒜素對于細(xì)菌、真菌和病毒等多種病原性微生物有不同程度的抑制或殺滅作用，是一種廣譜抑菌藥，具有消炎殺菌、降壓降脂、防止動脈硬化、提高機(jī)體免疫力等生物學(xué)功能[4]。此外，大蒜素可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)，可以有效降低動物發(fā)病率，提高其生產(chǎn)性能，降低死亡率，提高生產(chǎn)養(yǎng)殖效益[5]。

目前，國內(nèi)外有關(guān)大蒜素的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法、雙水相萃取法和有機(jī)溶劑浸提法[6]。然而，這些方法各自都存在一些缺陷，如水蒸氣蒸餾法由于高溫提取導(dǎo)致蒜氨酸酶失去活性或被破壞，從而影響大蒜素的產(chǎn)率及產(chǎn)物中有效成分的含量；超臨界CO2萃取法則存在萃取產(chǎn)物與CO2分離困難等缺陷；傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提法存在提取率低、提取時間長等缺點(diǎn)[7]。

為了克服傳統(tǒng)提取方法的局限性，有研究者使用超聲波作為大蒜提取物的輔助提取工具[8]。因超聲波能夠有效地破碎植物組織細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞裂解，促使細(xì)胞內(nèi)容物釋放，使破碎更加徹底，同時加快擴(kuò)散速度，從而大大提高萃取效率[9]。因此，本研究在傳統(tǒng)乙醇溶劑浸提的基礎(chǔ)上，采取超聲波輔助萃取技術(shù)提取大蒜素，優(yōu)化提取工藝，得到最佳輔助提取條件，為大蒜的深加工及大蒜素新產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

市售新鮮大蒜；無水乙醇、二硫代硝基苯甲酸、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、L-半胱氨酸，均為分析純。試驗(yàn)中所用試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，型號BHS-1，福州泰美實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電子分析天平，型號BSA323S，賽多利斯儀器（北京）有限公司；組織搗碎機(jī)，型號JJ-2，常州市萬豐儀器制造有限公司；紫外分光光度計，型號756PC，上海菁華科技有限公司；臺式高速離心機(jī)，型號3H16RI，湖南赫西儀器裝備有限公司；超聲清洗儀，型號BILCN10-250，上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 大蒜素含量檢測方法

1.3.1 乙醇萃取大蒜素的工藝流程

乙醇萃取大蒜素的工藝流程為鮮蒜去皮處理→低溫?fù)v碎→制得蒜泥→恒溫酶解→有機(jī)溶劑（乙醇）萃取→離心分離→取上清液→減壓濃縮→蒜素粗提取液。具體操作為將市場購買的新鮮大蒜去皮洗凈，用組織搗碎機(jī)制成蒜泥，再將搗碎的蒜泥放置在恒溫水浴鍋，在38 ℃的恒溫條件下酶解20 min，之后用65%乙醇溶液作為萃取劑，以1∶4（g∶mL）的料液比，在30 ℃的恒溫環(huán)境中萃取40～60 min[10]。萃取結(jié)束后，取其上層有機(jī)相，放入離心機(jī)，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1的條件下離心10 min。離心完成取得上清液，設(shè)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀參數(shù)，在0.01 MPa、蒸餾溫度50 ℃、轉(zhuǎn)速70 r·min-1的條件下進(jìn)行減壓濃縮，最終制得大蒜素粗提取物[11]。

1.3.2 鮮蒜中大蒜素含量測定

（1）定量檢測原理（分光光度法）。將L-半胱氨酸溶液置于大蒜素粗提取液中，大蒜素可與L-半胱氨酸進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后剩余的L-半胱氨酸再與5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）進(jìn)行反應(yīng)，并生成呈色（淡黃色）物質(zhì)二硫代硝基苯甲酸[12-13]。該物質(zhì)在412 nm處有最大吸收波長。因此，可使用紫外可見分光光度計測定呈色物質(zhì)二硫代硝基苯甲酸在反應(yīng)前后于波長412 nm處吸光值的變化，由此得出L-半胱氨酸的減少量，從而計算大蒜素的含量[14]。

（2）測定方法。用移液槍準(zhǔn)確吸取5 mL濃度為10 mmol·L-1的L-半胱氨酸溶液于試管中，加入1 mL去離子水，充分混勻后吸取1 mL，將其稀釋100倍，定容至100 mL容量瓶中備用。準(zhǔn)確吸取4.5 mL上述制得的L-半胱氨酸稀釋液于試管中，同時加入濃度為1.5 mmol·L-1的5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）溶液0.5 mL，充分混勻后將樣液放置在恒溫水浴鍋中，26 ℃下恒溫水浴20 min，使體系充分反應(yīng)（試驗(yàn)所用試劑現(xiàn)用現(xiàn)配）。反應(yīng)結(jié)束后用分光光度計測得其在412 nm處的吸光值（A0），即L-半胱氨酸溶液的初始吸光值[15-16]。

用移液槍準(zhǔn)確吸取5 mL濃度為10 mmol·L-1的L-半胱氨酸溶液于試管中，加入1 mL上述制得的大蒜素粗提取液，充分混勻后吸取1 mL，將其稀釋100倍，定容至100 mL容量瓶中備用。準(zhǔn)確吸取4.5 mL上述制得的稀釋后混合液于試管中，同時加入濃度為1.5 mmol·L-1的5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）溶液0.5 mL，充分混勻后將樣液放置在恒溫水浴鍋中，26 ℃下恒溫水浴20 min，使體系充分反應(yīng)（試驗(yàn)所用試劑現(xiàn)用現(xiàn)配）。反應(yīng)結(jié)束后用分光光度計測得其在412 nm處的吸光值（A），即與大蒜素（硫代亞磺酸酯）反應(yīng)后L-半胱氨酸溶液的吸光值[16]。

大蒜素含量的計算公式[17]為

C=（A0-A）×d×162.26/（2×14 150）（1）

式中：C為大蒜素（硫代亞磺酸酯）的含量，mg·mL-1；A為與大蒜素發(fā)生反應(yīng)后L-半胱氨酸的吸光值；A0為L-半胱氨酸初始吸光值；d為L-半胱氨酸溶液總稀釋倍數(shù)；162.26為大蒜素相對分子質(zhì)量；14 150為5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）與L-半胱氨酸反應(yīng)后生成的二硫代硝基苯甲酸在1 cm光徑下的摩爾消光系數(shù)。

1.4 超聲輔助提取大蒜素工藝研究

1.4.1 單因素試驗(yàn)

采用超聲輔助提取大蒜素的工藝研究，重點(diǎn)探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲輔助功率和超聲提取時間這3個主要因素對大蒜素含量的影響[18]。

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對大蒜素含量的影響。將鮮蒜用組織搗碎機(jī)制成蒜泥，準(zhǔn)確稱量5份樣品，每份5 g，然后向這5份樣品中以1∶4（g∶mL）的料液比分別加入體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%和95%的乙醇溶液。將各組樣液均放置在溫度30 ℃下自然酶解30 min，結(jié)束后進(jìn)行超聲輔助提取，超聲清洗儀參數(shù)設(shè)置為工作2 s，間歇1 s；超聲功率800 W；輔助提取時間35 min。超聲輔助提取結(jié)束后，離心取上清液，再進(jìn)行減壓濃縮，根據(jù)1.3.2（2）大蒜素的含量測定方法，測定吸光值，每個水平重復(fù)3次，計算大蒜素的含量[19-20]。

（2）超聲時間對大蒜素含量的影響。將鮮蒜用組織搗碎機(jī)制成蒜泥，準(zhǔn)確稱量5份樣品，每份5 g，然后在這5份樣品中以1∶4（g∶mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，將各組樣液均放置在溫度30 ℃下自然酶解30 min，結(jié)束后進(jìn)行超聲輔助提取，設(shè)置本組樣液的超聲輔助提取時間分別為5 min、15 min、25 min、35 min和45 min，其他參數(shù)設(shè)置為工作2 s，間歇1 s；超聲功率800 W。超聲輔助提取結(jié)束后，離心取上清液，再進(jìn)行減壓濃縮，根據(jù)1.3.2（2）大蒜素的含量測定方法，測定吸光值，每個水平重復(fù)3次，計算大蒜素的含量。

（3）超聲功率對大蒜素含量的影響。將大蒜用搗碎機(jī)制成蒜泥，準(zhǔn)確稱量5份均為5 g的樣品，然后在這5份樣品中以1∶4（g∶mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，將各組樣液在30 ℃下酶解30 min，然后進(jìn)行超聲輔助。本組樣品超聲功率依次設(shè)定為200 W、400 W、600 W、800 W和1 000 W，其他參數(shù)設(shè)置為工作2 s，間歇1 s；輔助提取時間35 min。超聲輔助提取結(jié)束后，離心取上清液，再進(jìn)行減壓濃縮，根據(jù)1.3.2（2）大蒜素的含量測定方法，測定吸光值，每個水平重復(fù)3次，計算大蒜素的含量[21]。

1.4.2 正交試驗(yàn)

為取得更加可行的工藝參數(shù)，在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時間和超聲輔助功率這3個對大蒜素含量影響較為顯著的因素，每個因素分別選取3個較優(yōu)水平，對大蒜素含量進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，最終得出最佳的超聲輔助提取工藝參數(shù)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大蒜素含量的影響

由圖1可知，在超聲輔助提取大蒜素的試驗(yàn)過程中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在55%～75%時，大蒜素含量呈直線上升趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時大蒜素含量達(dá)到最高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%～85%時，大蒜素含量則隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈直線下降趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)提高到85%甚至更高后，大蒜素含量則呈緩慢下降趨勢。造成這一結(jié)果的原因可能是，過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)會影響樣品的酶解作用，或者對大蒜素分子產(chǎn)生了破壞分解的作用，導(dǎo)致大蒜素含量下降。

2.1.2 超聲時間對大蒜素含量的影響

由圖2可知，在超聲輔助提取大蒜素的試驗(yàn)過程中，超聲提取時間在5～35 min時大蒜素含量呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢；當(dāng)提取時間達(dá)到35 min時，提取效果最好，大蒜素含量最高；當(dāng)提取時間超過35 min后，大蒜素含量隨著時間的延長而呈下降趨勢。這可能是由于在超聲波環(huán)境下機(jī)體產(chǎn)生熱量，時間越長，產(chǎn)生的熱量越多，對反應(yīng)體系的影響也就越大。

2.1.3 超聲功率對大蒜素含量的影響

由圖3可知，在超聲輔助提取大蒜素的試驗(yàn)過程中，超聲功率在200～600 W時大蒜素含量呈先提高后下降的趨勢。這可能是在超聲過程中大蒜素分解所致，也可能是操作過程中對于機(jī)器沒有完全散熱就進(jìn)行提取所致。超聲功率在600～800 W時，大蒜素含量呈明顯上升趨勢，并且超聲功率在800 W時大蒜素含量達(dá)到最高。之后將超聲功率提高到1 000 W時，大蒜素含量則呈現(xiàn)下降趨勢。造成這一結(jié)果的原因可能是過高的功率致使部分大蒜素分子被破壞[23]。

2.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)的因素水平表如表1所示，極差分析結(jié)果如表2所示。由表2可知，由K值得到的最優(yōu)組合為A2B3C3，該組合未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)表中。故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到A2B3C3組合下的大蒜素含量為0.152 mg·mL-1，低于正交試驗(yàn)表中A2B2C3組合（0.157 mg·mL-1）。因此，最優(yōu)組合為A2B2C3。由極差值可得，3個因素對大蒜素含量的影響大小排序?yàn)槌暪β剩境晻r間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

以大蒜素含量為檢測指標(biāo)，通過方差分析做進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果得出乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間和超聲功率3個因素對大蒜素含量的影響均存在極顯著差異（P＜0.01）（表3）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助有機(jī)溶劑（乙醇）萃取大蒜素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲功率3個因素對大蒜素含量的影響，并在此基礎(chǔ)上開展3因素3水平的正交試驗(yàn)，借助極差分析和方差分析，得出最佳的超聲輔助萃取工藝。結(jié)果表明，3個因素對大蒜素含量的影響均存在極顯著差異，3個因素對蒜素含量的影響大小排序?yàn)槌暪β剩境晻r間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)；最佳提取工藝參數(shù)組合為超聲輔助功率1 000 W、超聲提取時間35 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%。需要注意的是，在此次試驗(yàn)過程中由于超聲波的作用，使得反應(yīng)體系的溫度難以把控，會一定程度上影響大蒜素含量，使得試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差，這一問題有待進(jìn)一步探討、解決。

參考文獻(xiàn)

[1]楊融輝，吳晗，張寧.大蒜素抗氧化活性及其生物效應(yīng)的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，34（6）：1037-1040.

[2]趙銘洋，王知斌，孫延平，等.大蒜中的有機(jī)硫化物及其生物活性研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2021，23（6）：565-571.

[3]劉麗珍，甄莉娜，崔乃忠，等.大蒜素的提取及抑菌效果研究[J].中國調(diào)味品，2021，46（2）：79-82.

[4]劉素君，陳小鳳，成英，等.大蒜中大蒜素提取工藝及含量測定研究[J].廣東化工，2020，47（17）：182-183.

[5]MATHIALAGAN R，MANSOR N，SHAMSUDDIN M R，et al.Optimisation of ultrasonic-assisted extraction （UAE） of allicin from garlic （Allium sativum L.）[J].Chemical Engineering Transactions，2017，56：1747-1750.

[6]張碧薇，楊峰，樊繼德.大蒜有機(jī)硫化物提取工藝研究進(jìn)展[J].中國調(diào)味品，2020，45（2）：197-200.

[7]陳敏，楊曉鳳，宋君.大蒜素的高效提取工藝研究[J].中國調(diào)味品，2018，43（8）：53-56.

[8]楊婷，楊欣偉，韓明金，等.超聲輔助萃取大蒜素工藝研究[J].洛陽理工學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，27（4）：1-5.

[9]何榮海，朱培培，張秀海，等.象蒜中蒜素的超聲輔助提取工藝研究及其成分GS/MS分析[J].食品工業(yè)，2015，36（8）：63-67.

[10]熊偉.大蒜素的提取工藝研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2006.

[11]FARIAS-CAMPOMANES A M，HORITA C N，POLLONIO M A R，et al.Allicin-rich extract obtained from garlic by pressurized liquid extraction：quantitative determination of allicin in garlic samples[J].Food and Public Health，2014，4（6）：272-278.

[12]ZHOU C L，HU X Y，CHAO C，et al.Quantitation of allicin in garlic-based products：comparisons among spectrophotometry，GC and HPLC[J].Advance Journal of Food Science and Technology，2015，9（4）：269-277.

[13]莫英杰，王靜，曹雁平，等.超聲輔助酶法制備大蒜素的工藝研究[J].食品科學(xué)，2009，30（10）：42-45.

[14]朱薿，應(yīng)惠芳.大蒜中大蒜素含量簡便測定法[J].食品科技，2008（8）：202-204.

[15]曾哲靈，熊偉，熊濤，等.大蒜素的提取工藝研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006（2）：121-123.

[16]何榮海，馬海樂.大蒜辣素超聲輔助提取的試驗(yàn)研究[J].食品科學(xué)，2006（2）：147-150.

[17]HAN J，LAWSON L，HAN G，et al.A spectrophotometric method for quantitative determination of allicin and total garlic thiosulfinates[J].Analytical Biochemistry，1995，225（1）：157-160.

[18]徐壽植.超聲輔助提取象蒜中大蒜素及其微膠囊化研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[19]王加祥.大蒜加工廢水中大蒜素的回收利用[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[20]盛曉婧，龐旭，張繼光，等.大蒜中有機(jī)硫化合物萃取技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2019（1）：49-54.

[21]TANONGKANKIT Y.Ultrasonic-assisted extraction of allicin and its stability during storage[J].Food and Applied Bioscience Journal，2019，7（3）：17-20.

[22]李利華.正交試驗(yàn)法優(yōu)化超聲輔助提取大蒜多糖工藝[J].中國調(diào)味品，2014，39（7）：70-73.

[23]柏冬星.大蒜氧化物對山羊瘤胃消化代謝及激素水平的影響[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2010.