高梁深根基因SbDR01的克隆及功能驗證

關(guān)鍵詞：高粱；SbDR01：基因克隆；生物信息學(xué)；抗旱；擬南芥

干旱作為一種最主要的非生物脅迫之一，嚴(yán)重限制作物的生長，是造成作物減產(chǎn)的最主要原因。人口的不斷增長和全球氣候的不斷變化對世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)足夠的糧食養(yǎng)活世界人民帶來了挑戰(zhàn)。中國作為農(nóng)業(yè)大國、人口大國．水資源問題更為嚴(yán)峻，自建國以來我國因干旱造成的土地受災(zāi)面積高達(dá)2106萬hm2。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗旱相關(guān)基因在作物中表達(dá)，是作物抗旱育種的一個重要方向。

植物在應(yīng)對干旱脅迫時涉及到一系列的基因表達(dá)調(diào)控，大致分為兩類：一類是調(diào)節(jié)基因，在干旱脅迫下調(diào)節(jié)基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如：DREB（dehydration responslve element binding）等轉(zhuǎn)錄因子家族基因積極參與植物抗旱調(diào)控：另一類是功能基因，在干旱脅迫下被誘導(dǎo)，通過基因表達(dá)量的升高或者降低提高植物抗旱能力，如ZmVPP1可以在干旱條件下提高玉米的光合效率，同時促進(jìn)根系的發(fā)育，使玉米吸收更多的水分來提高抗旱性。植物進(jìn)化過程中，在面臨干旱脅迫的情況下，進(jìn)化出一系列生理以及分子層面維持正常生長或提高自身抗旱性的防御機(jī)制。植物應(yīng)對干旱脅迫最重要的機(jī)制之一是通過深入和發(fā)達(dá)的根系統(tǒng)最大化的吸收水分。植物根系結(jié)構(gòu)和根的分布是植物在干旱條件下吸收養(yǎng)分和水分來維持莖的生長能力的關(guān)鍵因素。擁有發(fā)達(dá)根系的水稻在脅迫條件下能夠提高產(chǎn)量。日本研究人員發(fā)現(xiàn)一種能夠幫助水稻在干旱氣候中保產(chǎn)的基因，該基因可以顯著響應(yīng)重力作用，促進(jìn)水稻根系發(fā)育，從而使水稻能夠從地表更深層吸收水分，提高水稻在干旱條件下的產(chǎn)量，被稱為深根基因（deeper rooting 1，DR01）。通過研究發(fā)現(xiàn)，沒有DR01基因的水稻，在中等干旱條件下產(chǎn)量會減少60%，而攜帶該基因的水稻產(chǎn)量幾乎不受干旱影響。

高梁作為一種耐旱性較強(qiáng)的作物，挖掘其抗旱相關(guān)基因?qū)τ谧魑锟购蹈牧季哂兄匾囊饬x。本實驗在高梁cDNA文庫中篩選得到高梁的DR01基因，命名為SbDR01。對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其與水稻的DR01基因有較高的同源性，通過轉(zhuǎn)化擬南芥對其抗旱性進(jìn)行了驗證。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗旱相關(guān)基因的表達(dá)量，闡明SbDR01抗旱的分子機(jī)制，為作物抗旱遺傳改良提供基因資源。

1材料與方法

1.1植物材料與培養(yǎng)條件

高梁種子由小麥玉米國家工程研究中心保存。2021年，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)高梁幼苗，條件為23℃、濕度70%、16h光照/8h黑暗、正常澆水，在三葉一心期取樣，提取總RNA。擬南芥種子為哥倫比亞生態(tài)型（Columbia ecotype），野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥種植在相同條件下。

1.2載體、菌株

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10、克隆載體pZer-oBack/Blunt Vector均購于天根生化科技（北京）有限公司；農(nóng)桿菌GV1301和pCAMBIA3301載體由本實驗室保存。

1.3基因的篩選

本實驗室前期通過構(gòu)建高梁干旱脅迫誘導(dǎo)基因的全長cDNA文庫，將所有的全長cDNA構(gòu)建到含35S啟動子的過表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化擬南芥，通過干旱脅迫處理，篩選到一個具有抗旱功能的基因，通過測序得到cDNA全長，在NCBI中BLAST得到高梁的cDNA序列。

1.4生物信息學(xué)分析

根據(jù)BLAST結(jié)果對SbDR01基因和蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在http：//www. expasy.org/tools/protparam. html網(wǎng)站上利用Protparam工具預(yù)測蛋白的基本理化性質(zhì)。利用在線工具TM-HMM（http： //www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）預(yù)測SbDR01蛋白的跨膜區(qū)。蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析在http：//www.predictprotein.org網(wǎng)站上完成。利用在線工具SMART（http：//smart.embl-heidel-berg.de/）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。利用同源建模的分析工具SWISS-MODEL（http：//www. expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）分析蛋白3D結(jié)構(gòu)。利用DNAMAN軟件對SbDRO1蛋白序列做同源分析，MEGA5.1軟件構(gòu)建不同物種Sb-DR01同源基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5全長cDNA的克隆

取正常條件下生長到三葉一心期的高梁地上和地下部分，利用天根RNA提取試劑盒提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)在基因數(shù)據(jù)庫（Phytozome v9.1 Home）中搜索到的基因序列設(shè)計引物（表1），以高梁cDNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增目的基因全長cDNA序列，命名為Sb-DR01。

1.6表達(dá)載體的構(gòu)建

在目的基因序列兩端加上酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增得到的導(dǎo)入了BglⅡ和Pml I酶切位點(diǎn)的片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，長紫外燈下切膠回收，連接到克隆載體載體pZeroBack/Blunt Vector上后進(jìn)行雙酶切。同時載體pCAMBIA3301也用相同的酶進(jìn)行雙酶切。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，將重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上挑取單克隆進(jìn)行菌液檢測，選取鑒定正確的克隆搖菌，提取重組質(zhì)粒，完成表達(dá)載體構(gòu)建。

1.7轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定

將構(gòu)建好的pCAMBIA3301載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301，利用農(nóng)桿菌蘸花侵染法侵染正常生長至花蕾期的擬南芥。將正常收獲的T0代種子在含有除草劑的1/2MS培養(yǎng)基上種植，生長一周后選擇生長良好的陽性植株，移栽到土壤中繼續(xù)生長，重復(fù)篩選兩代，得到T3代純合轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行鑒定。種植T3代純合系植株和野生型植株，3周后，取轉(zhuǎn)基因和野生型單株，提取DNA，PCR擴(kuò)增，檢測目的條帶。

1.8轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱鑒定

將T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，分別轉(zhuǎn)移到含有300mmol/L和350mmol/L甘露醇的MS培養(yǎng)基上，觀察培養(yǎng)不同時間的表型。同時設(shè)置不含甘露醇的對照組，每個處理3個重復(fù)。干旱脅迫處理后取樣，樣品迅速放人液氮保存，以備提取RNA。

1.9脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)分析

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量PCR（qRT-PCR）引物（表1）。擬南芥內(nèi)參基因為Actin，測定擬南芥中生長素合成、運(yùn)輸及抗旱相關(guān)基因的表達(dá)。擴(kuò)增體系：SYBR Premix Ex共40個循環(huán)。

2結(jié)果與分析

2.1SbDR01基因生物信息學(xué)分析

通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)高梁中與水稻DR01同源的基因，命名為SbDR01，登錄號為XM一002462405.10序列分析顯示該段序列位于2號染色體上第6069738～60701737 bp，包含Sb-DR01基因的5'UTR、3'UTR，有5個外顯子和4個內(nèi)含子。

SbDR01基因CDS全長759 bp，編碼252個氨基酸，蛋白分子式為C1233 H1987 N361 0401 S10．分子量為28.6kDa，理論等電點(diǎn)為5.29。含基本氨基酸20種，谷氨酸（Glu）占比最高（11.1%），酪氨酸（Tyr）最低（0.4%）；46個殘基（Asp，Glu）含負(fù)電荷，39個殘基（Arg，Lys）含正電荷。不穩(wěn)定系數(shù)為62.85，屬不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)達(dá)到71.27。利用BioEdit分析該蛋白親水性，其親水系數(shù)為13（圖1A）。通過對SbDR01蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白擁有2個低復(fù)雜度的結(jié)構(gòu)域和1個螺旋卷曲區(qū)域（圖1B）。預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)如圖1C所示，有25.79%的螺旋，5.16%的折疊，69.05%的轉(zhuǎn)角。利用SWISS-MODEL工具對SbDR01蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，該蛋白具有明顯的6個螺旋結(jié)構(gòu)域（圖1D），基本符合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。

2.2不同物種間DR01蛋白同源性分析

通過同源比對，檢索不同物種中與SbDR01相似性較高的基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖2），可以發(fā)現(xiàn)SbDR01蛋白與玉米、水稻中DR01蛋白的同源性較高。其中水稻DR01基因已被報道，能夠促進(jìn)根系重力作用反應(yīng)，顯著促進(jìn)水稻根系的生長，有利于吸收更深層土壤中的水分，幫助水稻在干旱氣候下減少產(chǎn)量損失。SbDRO1蛋白與玉米DR01蛋白同源性最高，暗示兩蛋白可能具有相似的功能。

2.3高梁中SbDR01基因的克隆

根據(jù)數(shù)據(jù)庫序列設(shè)計引物（表1），PCR擴(kuò)增得到全長838bp片段（圖3），包含SbDR01編碼區(qū)序列759bp以及部分引物序列。測序結(jié)果表明，其序列與數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果完全一致。

2.4SbDR01過表達(dá)載體的構(gòu)建

對SbDR01基因編碼區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)，沒有BglⅡ（AGATCT）和Pml I（CACGTG）限制性酶切位點(diǎn)，可以在目的基因序列兩端加該酶切位點(diǎn)，并設(shè)計加酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物（表1）。對擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，利用T4DNA連接酶將SbDR01基因連接到pCAM-BIA3301雙元表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR鑒定結(jié)果與目的條帶一致，測序結(jié)果與目的序列一致，無堿基突變，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖4）。

2.5轉(zhuǎn)SbDR01基因擬南芥的獲得

將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染正常生長的擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥具有草甘膦（PPT）抗性，用含PPT的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。在含有PPT的MS培養(yǎng)基上種植T0代種子，選擇一周后長出兩片綠葉的幼苗為轉(zhuǎn)基因陽性植株（圖SA、B），移栽到育苗盆中，使其正常生長（圖5C）。單株收獲T0代種子，繼續(xù)種植篩選直到T3代純合單株。提取轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純合單株和野生型擬南芥的DNA，利用目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中成功檢測到目的基因（圖5D）。

2.6轉(zhuǎn)SbDR01基因擬南芥抗旱性鑒定

為鑒定轉(zhuǎn)SbDR01基因擬南芥的苗期抗旱性，對正常生長到4周的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對照進(jìn)行干旱處理。干旱處理12d后，轉(zhuǎn)基因擬南芥相比野生型其葉片持綠性較好，且野生型擬南芥花序萎蔫（圖6A）；對干旱處理12d的植株進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水后3d觀察植株生長狀況，轉(zhuǎn)基因擬南芥大部分存活，而野生型擬南芥大部分死亡（圖6B），轉(zhuǎn)基因擬南芥的存活率為74.1%，野生型僅為42.6%。表明，在擬南芥中過量表達(dá)Sb-DR01可以顯著提高其抗旱性。

進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)SbDR01擬南芥的抗旱機(jī)制，在含有不同濃度甘露醇的MS培養(yǎng)基上種植轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對照，觀察生長狀況。在正常MS培養(yǎng)基上生長的野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥生長23d和35d后均無明顯區(qū)別（圖6C、E）；在含有350mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基上生長18d（圖6D）和正常培養(yǎng)基上生長7d后移到含有300mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基上生長35d（圖6F）后觀察，野生型和轉(zhuǎn)基因植株生長狀況差異明顯。轉(zhuǎn)基因植株相對野生型植株根較長，且根系較發(fā)達(dá)，無死亡現(xiàn)象；野生型植株相對轉(zhuǎn)基因植株根較短，且出現(xiàn)黃葉，植株生長受到嚴(yán)重脅迫甚至枯萎。在甘露醇模擬的干旱條件下，轉(zhuǎn)SbDR01擬南芥相比于野生型顯示出較強(qiáng)的抗旱性，且在不同濃度甘露醇處理下，轉(zhuǎn)基因植株的根均顯著長于野生型，且根系明顯較發(fā)達(dá)（圖6G）。表明SbDR01基因在干旱脅迫下可能通過促進(jìn)擬南芥根的生長使植株吸收更多水分來提高其存活率。

2.7轉(zhuǎn)SbDR01擬南芥中抗逆相關(guān)基因的表達(dá)分析

為進(jìn)一步研究SbDR01轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性提高的分子機(jī)制，對ABI、DREB2A、P5CS1、RD29A4個抗旱相關(guān)基因在正常條件和甘露醇處理下的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖7）表明，正常生長條件下轉(zhuǎn)基因和野生型植株中各基因表達(dá)量無明顯差異，在300mmol/L甘露醇處理下的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其ABI、DREB2A、P5CS1、RD29A基因的表達(dá)量相對于野生型顯著提高。

由于在干旱脅迫下SbDR01轉(zhuǎn)基因擬南芥的根伸長量顯著高于野生型，對影響生長素合成和運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)基因進(jìn)行分析。

YUCCA家族基因主要負(fù)責(zé)生長素的合成，對該家族基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)基因擬南芥中YUC2．YUC4和YUC6表達(dá)量顯著高于野生型，暗示SbDR01轉(zhuǎn)基因擬南芥中合成的生長素可能相對于野生型較多。PIN基因家族在擬南芥中對生長素的極性運(yùn)輸中具有重要作用，對PIN家族基因在干旱脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)．SbDR01轉(zhuǎn)基因擬南芥中PIN1、PIN3、PIN6和PIN7表達(dá)量在甘露醇處理下相對于野生型均顯著提高，尤其PIN3在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)量比野生型高10倍，這有助于生長素在轉(zhuǎn)基因擬南芥根中積累。

以上結(jié)果表明，SbDR01的過量表達(dá)顯著促進(jìn)擬南芥中生長素合成、運(yùn)輸以及抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，從而有效提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性。

3討論與結(jié)論

植物根部可以感知非生物因素，如土壤含水量的變化、土壤容重、土壤氧含量以及土壤中營養(yǎng)成分的變化濃縮和損耗，對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收發(fā)揮著關(guān)鍵作用。植物發(fā)達(dá)的根系可以使植物從更深層的土壤中吸收水分來抵御干旱。因此，一些控制根系結(jié)構(gòu)基因的引入也是提高作物抗旱性的有效途徑。本研究篩選得到了一個控制高梁根系結(jié)構(gòu)的基因SbDR01，通過與不同物種中該基因的同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與水稻深根基因有較高的同源性。前人的研究已經(jīng)證實，水稻中DR01基因可以在中等干旱脅迫下提高水稻的抗旱性。

本研究中，SbDR01基因在擬南芥中過量表達(dá)可以顯著提高擬南芥在干旱條件下的存活率，這與水稻、小麥、馬鈴薯等作物中的DR01同源基因過量表達(dá)可提高植株抗旱性的結(jié)果一致。進(jìn)一步對干旱處理下擬南芥中P5CS1、DREB2A、ABI和RD29A4個抗旱相關(guān)基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)這些基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)量相比于野生型均顯著提高。因此，可能是由于SbDR01基因的過量表達(dá)，且在干旱脅迫的誘導(dǎo)下，使干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如DREB2A表達(dá)量提高，通過轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，使下游抗旱相關(guān)功能基因如P5CS1、RD29A等表達(dá)量提高，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因擬南芥中脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，使轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型擬南芥具有更強(qiáng)的抗旱能力。本研究中，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在正常MS培養(yǎng)基上的生長情況沒有明顯差異，而在含有甘露醇的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥根系較野生型發(fā)達(dá)。隨著甘露醇濃度的增加，差異顯著增加，這與水稻DR01基因研究不同，水稻DR01基因控制的是干旱條件下根的生長角度，能使根部進(jìn)入更深的土壤，吸收水分，從而提高了水稻的抗旱性。而在本研究中，轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型擬南芥的根伸長，根系較發(fā)達(dá)，根的生長角度差異不明顯。YUCCA家族基因是植物生長素合成的重要基因，PIN家族基因?qū)τ谥参锷L素的極性運(yùn)輸具有重要影響。本研究對擬南芥中YUCCA家族基因和PIN家族基因在干旱脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SbDR01轉(zhuǎn)基因擬南芥中部分該家族基因表達(dá)量顯著高于野生型。Sb-DR01轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱脅迫下根顯著伸長，可能是由于SbDR01的過表達(dá)促進(jìn)了YUC2、YUC4和YUC6基因的高表達(dá)，從而促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素的合成，并且在同樣高表達(dá)的PIN1、PIN3、PIN6和PIN7基因的協(xié)助下運(yùn)輸?shù)礁?，在根部積累較多的生長素，進(jìn)而促進(jìn)了根系的伸長和生長。因此，SbDR01基因在擬南芥中的過量表達(dá)，提高植物體在干旱脅迫條件下生長素的合成和運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥根系的發(fā)育，同時提高了抗旱相關(guān)基因的表達(dá)和響應(yīng)，從而顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性。

綜上．本研究在高梁的cDNA文庫中篩選出具有抗旱功能的SbDR01基因，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和克隆。在擬南芥中過表達(dá)SbDR01可以顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性：在甘露醇模擬干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根與野生型擬南芥相比較長，且較發(fā)達(dá)。SbDR01基因在擬南芥植株中過量表達(dá)，可使轉(zhuǎn)基因植株中DREB2A、ABI等抗旱相關(guān)基因和YUCCA、PIN家族中與生長素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)量顯著提高，促進(jìn)干旱條件下植株的根系發(fā)育，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性。