海欖雌葉多糖的提取、結(jié)構表征及其抗氧化活性研究

多糖作為活性生物大分子已經(jīng)受到人們的廣泛關注。海欖雌作為民間用藥具有多種藥理活性，但對其多糖研究一直鮮有報道。對海欖雌葉多糖的提取、結(jié)構解析和抗氧化活性等進行研究，為有效開發(fā)和利用其藥理活性提供實驗依據(jù)和理論基礎。通過水提醇沉得到海欖雌葉中的多糖，高效液相色譜分析其單糖組成，紅外光譜分析其官能團，研究其抗氧化活性。液相色譜顯示單糖組成為：甘露糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖和阿拉伯糖。紅外光譜表明內(nèi)含吡喃糖環(huán)和α-糖苷鍵。以VC為對照，在濃度200μg/mL時，海欖雌葉多糖對DPPH的清除率為86.53%，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

廣東省湛江市沿海灘涂生產(chǎn)大片紅樹林群落，海欖雌是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的主要品種。長期受周期性潮水浸淹，其環(huán)境的特殊性（高鹽度，高壓，低氧，避光），使得其與陸地生物相比有著巨大的差異，往往能夠產(chǎn)生一些化學結(jié)構新穎、生物活性多樣且顯著的藥物先導化合物，為新藥研究與開發(fā)提供了大量的模式結(jié)構和藥物前體[1]。國內(nèi)外研究都集中在其生態(tài)特性上，對于海欖雌藥理活性成分的研究還較少。海欖雌作為民間用藥在哮喘、風濕、潰瘍等疾病治療上都有功效[2-8]。

植物多糖在國內(nèi)已經(jīng)有很多報道，作為植物體中生物活性分子，其是由多個單糖分子脫水縮合而成的，以糖苷鍵相連接串聯(lián)成大分子，常具有三維結(jié)構，具有多種生物活性，能預防疾病，抗衰老和增強免疫力[9]。然而對于海欖雌葉多糖還未見系統(tǒng)報道，本文首次對海欖葉多糖進行提取，并對其結(jié)構和活性進行研究。水提醇沉法試劑便宜、工序簡單，對設備要求不高[10]。因此，本文采用水提醇沉法提取得到的海欖雌葉粗多糖。多糖的脫蛋白方法主要有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。最常用的方法是Sevag法，是將正丁醇、氯仿按照一定的比例相互混勻，再以一定比例混合于多糖溶液中，離心除去混合液中的蛋白沉淀絮狀物[11]。三氟三氯乙烷法效率更高，但因為難揮發(fā)等缺點限制了它的應用[12]。張萍等[13]建立了一種柱前衍生高效液相色譜法測定石榴皮多糖的單糖組成分析方法，結(jié)果揭示本法測定單糖的線性范圍寬、重復性好、準確性高，測得石榴皮多糖組分含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等7種單糖。何源等[14]研究3種鹿茸多糖，紅外光譜顯示均具有典型的多糖結(jié)構，2 930 cm-1附近的CH的拉伸和彎曲振動吸收峰是多糖的特征吸收峰，次峰出現(xiàn)在2 854 cm-1處，表明存在亞甲基并含有硫酸根基團，屬糖胺聚糖。何婷婷等[15]利用紅外光譜表征蒲公英多糖為β-吡喃糖，1 072、779、618、541 cm-1為吡喃糖特征吸收峰之一。蔣文明等[16]通過提取椰子皮多糖，并對其生物活性進行研究，體外抗氧化試驗表明，椰子皮多糖對ABTS+自由基、DPPH自由基和O2-均有一定的清除效果，隨著椰子皮多糖濃度的增加清除能力逐漸增強。趙賽蕾等[17]總結(jié)了山藥多糖能清除活性氧，通過減少自由基進而延緩衰老和抗氧化。蔡永萍等[18]揭示薏苡仁多糖具有良好的抗氧化能力，對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制能力效果明顯，并且隨著濃度的增加，抑制率增加。

據(jù)此，本論文通過95%乙醇提取得到的海欖雌葉多糖，水提醇沉得到海欖雌葉中的多糖，高效液相色譜法研究其單糖組成，紅外光譜揭示其官能團，DPPH清除實驗研究其抗氧化活性，為海欖雌藥用價值開發(fā)利用提供科學的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

以湛江市南三島沿海采集的新鮮海欖雌葉條為實驗對象。裁剪新鮮碧綠的海欖雌葉，初步自然曬干，然后放入50℃恒溫烘箱烘干后，分別粉碎至40目大小，在干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩Ｋ迷噭┡c藥物：95%乙醇、丙酮、無水乙醇、PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）、三氟乙酸（TFA）、氫氧化鈉、甲醇、鹽酸、氯仿、DPPH藥品、磷酸二氫鈉、乙腈、D-葡萄糖醛酸、D-（+）-半乳糖醛酸、阿拉伯糖、無水葡萄糖、甘露糖、D-半乳糖、木糖、鼠李糖、維生素Vc（廣州賽國生物科技有限公司）。實驗所用藥物和試劑除D-葡萄糖醛酸、D-（+）-半乳糖醛酸、巖藻糖、阿拉伯糖、無水葡萄糖、甘露糖、D-半乳糖、木糖、鼠李糖（上海研域生物科技有限公司）為標準對照品外，其余均為分析純。

1.2儀器與設備

RD-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱（中譜紅）、沃特世2695高效液相色譜儀、CF12RX（日本日立）多用途冷凍離心機、754N紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、AUW220D電子分析天平（日本島津）、真空干燥箱、冰箱等儀器設備。

1.3實驗方法

1.3.1多糖成分的提取

將打碎過篩后得到的海欖雌葉粉末稱重后，平均分成3份，每份2 kg，分別填充至10 L蒸餾瓶內(nèi)，加入5 L超純水浸泡2 h，然后于80℃條件下蒸餾提取2 h，重復該過程1次，將2次提取所得溶液混合后于2 000 rpm、10 min條件下離心，去除海欖雌葉粉末殘渣，將上清液真空濃縮至100 mL。對應加入4倍體積的95%濃度乙醇進行沉淀；沉淀完全后于2 000 rpm、10 min條件下離心收集絮狀物，并分別用300 mL去離子水復溶，真空濃縮除去殘余乙醇，再將殘留液于2 000 rpm、10 min條件下離心除去不溶物；上清液真空濃縮，冷凍干燥后，依次用丙酮和無水乙醇洗滌3遍，最后一次洗滌后，置于通風櫥內(nèi)讓殘余的有機試劑自然揮發(fā)，待有機試劑揮發(fā)完后，提取到的海欖雌葉多糖（YAM），收集多糖固體，稱重備用。

1.3.2高效液相色譜法測定單糖組成

利用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化高效液相色譜法測定單糖組成。

1.3.2.1樣品的完全酸水解

稱取2 mg YAM固體，分別加到具塞試管中，之后加入2 mL 2 mol/L的三氟乙酸（TFA），120℃下油浴4 h，將酸水解后所得樣品溶液轉(zhuǎn)于蒸餾瓶內(nèi)，加入10 mL甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，此操作重復2次，去除TFA。用1 mL去離子水溶解，待衍生化。

1.3.2.2 PMP衍生化

分別吸取100μL的YAM水解液放入試管中，再分別取50μL 0.3 mol/L的NaOH溶液和0.5 mol/L PMP甲醇溶液混勻，70℃下水浴30 min，自然冷卻10 min。加入50μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL氯仿萃取3次，上層為水層，加100μL超純水混勻稀釋，0.22μm的微孔濾膜過濾后待進樣。

1.3.2.3 9種單糖標準品混合液的衍生化

取2 mmol/L單糖標準品D-葡萄糖醛酸、D-（+）-半乳糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、D-半乳糖、木糖、鼠李糖和巖藻糖各50μL，分別加入0.5 mol/L 50μL PMP甲醇溶液和0.3 mol/L 50μL NaOH溶液，70℃下水浴30 min，自然冷卻10 min。加入50μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL氯仿萃取3次，上層為水層，加100μL超純水混勻稀釋，待進樣。

1.3.2.4進樣分析

液相色譜條件：色譜柱：中譜紅RD-C18（250 nm×4.6 nm，5μm）；流動相：0.1 mol/L磷酸鹽（pH 6.7）、緩沖液-乙腈（體積比為83∶17）；柱溫：30℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：20μL。

1.3.3紅外光譜分析

取一定量干燥的多糖樣品，與干燥KBr粉末混勻后壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖。

1.3.4海欖雌葉多糖對DPPH的清除率測定

取多糖母液和VC母液，分別制得不同濃度2.5、5、10、20、50、75、100μg/mLYAM的多糖溶液和VC溶液，然后分別對應吸?。簻y定管：0.5 mL多糖溶液+3.5 mLDPPH液；空白管：0. 5 mL蒸餾水+3.5 mLDPPH液。渦旋混勻，在黑暗處放置30 min，1 cm光徑，517 nm，95%乙醇調(diào)零，測定各管吸光度值。通過下式計算海欖雌葉多糖對DPPH的清除率，結(jié)果如表1。

其中Y表示DPPH清除率，A1為測定管的吸光度，A0為空白管的吸光度。

2.2紅外結(jié)果分析

紅外結(jié)果如見圖3所示。在400～4 000 cm-1得到如下的吸收峰：3 271、2 928、1 745、1 463、1 085、1 023、931、716、624、504 cm-1。各峰歸屬如下：3 271 cm-1處的峰信號強且寬，為O-H伸縮振動引起的。2 928 cm-1出現(xiàn)的吸收峰為CH2或者CH3的C-H的伸縮振動。1 745 cm-1為乙酰胺基（-NHCOCH3）的C=O伸縮振動，說明多糖是一種含氨基的糖綴合物。1 463 cm-1處的吸收峰可能是C-H的變角運動引起的，1 085和

2結(jié)果分析

2.1單糖組成分析

高效液相色譜結(jié)果顯示如見圖1，各單糖分離度好，峰型尖銳，從左往右依次為甘露糖（19.636）、鼠李糖（26.763）、D -葡萄糖醛酸（30.328）、D -半乳糖醛酸（34.932）、葡萄糖（40.815）、D-半乳糖（46.337）、木糖（48.644）、阿拉伯糖（50.508）、巖藻糖（57.520）。海欖雌葉多糖液相色譜結(jié)果如見圖2，顯示該多糖由甘露糖（19.596）、鼠李糖（26.715）、D -半乳糖醛酸（34.859）、葡萄糖（40.728）、D-半乳糖（46.236）和阿拉伯糖（50.481）組成，摩爾比為1∶2∶1∶2∶1∶1。葡萄糖含量最高，甘露糖酸含量最低，單糖組成往往與多糖的生物活性息息相關。

1 023 cm-12處的吸收峰預示多糖內(nèi)含由于吡喃糖環(huán)。931 cm-1說明多糖可能含有β-D吡喃葡萄糖環(huán)。716 cm-1是α-吡喃環(huán)的彎曲振動特征峰，表示多糖結(jié)構中有α-糖苷鍵。584 cm-1則是O-H外平面振動峰[19-21]。

2.3 DPPH清除實驗結(jié)果分析

清除實驗結(jié)果見表1，表明海欖雌葉多糖具有良好的清除DPPH自由基的活性，且隨著濃度的增加，對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢，在濃度50 ug/mL時，清除活性達到85%左右，隨著濃度增加，清除活性趨于平緩。濃度增加，清除活性趨于平緩。

3結(jié)論與討論

隨著醫(yī)藥技術的不斷發(fā)展，生物醫(yī)藥開發(fā)不再滿足于已收錄的藥用植物名錄，海欖雌作為中國分布面積最大的紅樹林植物種類，研究其天然活性成分，充分挖掘其利用功能，有利于拓寬植物資源的開發(fā)利用范圍，創(chuàng)造新的生物制藥。海欖雌對多種疾病的治療存在良好藥效，多糖作為植物體中的主要活性成分，對海欖雌葉進行多糖提取，分析其多糖結(jié)構及研究其體外抗氧化活性，更利于探究海欖雌的藥用價值，對提高海欖雌整株的利用率具有重要意義。

本論文采用95%乙醇對海欖雌葉的多糖進行提取，利用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化高效液相色譜法（HPLC）測定其單糖組成，結(jié)果表明單糖組成為：甘露糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖和阿拉伯糖組成。紅外光譜說明多糖是一種含氨基的糖綴合物，內(nèi)含由于吡喃糖環(huán)、β-D吡喃葡萄糖環(huán)和α-糖苷鍵。通過DPPH自由基清除實驗，表明海欖雌葉多糖具有一定的抗氧化活性，為海欖雌的提取及進一步加工利用提供了一定的科學理論依據(jù)。

參考文獻

[1]向晨晨，周珊珊，柴樹茂，等.紅樹林鏈霉菌ZFSM1-146中抗菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)[J].微生物學通報，2021，48（7）：2329-2340.

[2]林鵬.我國藥用的紅樹植物[J].海洋藥物，1984，12（4）：231-237.

[3] MaeFarlane G R，Butcher M D.Toxicity，growth and accumulation relationships of copper lead and zinc in the grey mangrove Avicenna marina （Forsk.） Vierh[J]. Envi‐ronmental Research，2002（54）：65-84.

[4] Hibino T，Meng Y L，Kawamitsu Y. Molecular clon‐ing and functional characterization of two kinds of beta‐ine-aldehydedehydrngenaseinbetaine-accumulating mangrove Avicenna marina （Forsk.） Vierh[J].Plant Mo‐lecular Biology，2001（45）：353-363.

[5] Sharp H，Thomas D，Carrie F.Pinoresinol and syrin‐garesinol：two lignans from Avieennia germinans（Avicen‐niaceae） [J].Biochemical Systemsfics and Ecology，2001（29）：325-327.

[6] Suzuki M，Yasumoto E，Baba S.Effect of salt stress on the metabolism of ethenolamine and choline in leaves of the belaine-producing mangrove species Avicenna ma‐rina[J].Phytoehemistry，2003，（64）：941-948.

[7] Tian S，Saravanan K，Mothana R A，et al. Anti-cancer activity of biosynthesized silver nanoparticles using Avi‐cennia marina against A549 lung cancer cells through ROS/mitochondrial damages[J]. Saudi Journal of Biolog‐ical Sciences，2020，27（11）：3018-3024.

[8] Bell K H，Duewell H.Triterpenoids from the bark of Avicennia marina[J]. Australian Journal of Chemistry，1961（14）：662-663.

[9]張璐，楊瑩瑩.高效液相色譜法測定黨參多糖的單糖組成及含量[J].中國食品添加劑，2021，32（12）：163-169.

[10]陳亮，郝夢超，安超娜，等.淫羊藿多糖提取工藝及其藥理活性研究進展[J].江蘇調(diào)味副食品，2023（1）：5-8.

[11]Chen Y，Xie M，Nie S，et al. Purification， composi‐tion analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma atrum [J]. Food Chemistry，2008，107（1）：231-241.

[12]張巖，馬麗娜，王鵬，等.苦豆子多糖脫蛋白工藝比較[J].中國新藥雜志，2012（8）：921-925.

[13]張萍，陳燕，尚永輝，等.柱前衍生高效液相色譜法測定石榴皮多糖的單糖組成[J].分析試驗室，2019，38（5）：523-528.

[14]何源，王露露，張晶. 3種鹿源鹿茸多糖含量、紅外譜圖、抗氧化活性比較[J].中成藥，2022，44（3）：1028-1031.

[15]何婷婷，柴軍紅，鐘讀波，等.蒲公英活性成分提取工藝的優(yōu)化、多糖紅外表征及其抗氧化性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2018，46（11）：163-166.

[16]蔣文明，周石洋.椰子皮多糖的提取、結(jié)構表征及生物活性研究[J].中國食品添加劑，2023，34（5）：111-118.

[17]趙賽蕾，丁侃，胡玉龍，等.山藥多糖生物活性及構效關系研究進展[J].糧食與油脂，2023，36（5）：29-33.

[18]蔡永萍，李陽杰.薏苡仁多糖閃式提取工藝優(yōu)化及其生物活性[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（9）：164-170.

[19]賀婷.正紅菇多糖結(jié)構分析及其生物活性研究[D].廣州：華南理工大學，2015.

[20]韓銓.茶樹花多糖的提取、純化、結(jié)構鑒定及生物活性的研究[D].杭州：浙江大學，2011.

[21]彭光華，朱影，許倩兮.雪靈芝多糖的分離以及紅外光譜和氣相色譜分析[J].中國藥師雜志，2009，12（11）：1557-1560.

基金項目：海南省自然科學基金（221QN0923）[1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所陳吳海，羅成，葉劍芝（通信作者）；2云南農(nóng)業(yè)大學熱帶作物學院熊玉民，謝宇欣，楊佳麗]