鉆喙蘭屬種質(zhì)資源鑒評與分子身份證構(gòu)建

摘""要：鉆喙蘭屬為蘭科的一類附生型蘭花，具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。本研究基于前期收集的鉆喙蘭屬3個常見種的10份不同種質(zhì)資源，采用熒光標(biāo)記毛細管電泳進行等位變異檢測，篩選出21對SSR多態(tài)性引物，其中13對引物位點呈高多態(tài)性，共擴增出47個等位基因，平均觀測等位基因數(shù)（Na）為2.238，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.860。21個位點的觀測雜合度（Ho）為0～0.778，均值為0.421，期望雜合度（He）為0.148～0.574，均值僅0.340，Shannon指數(shù)（I）為0.096～0.987，均值為0.567。10份種質(zhì)的聚類結(jié)果和PCoA分析與傳統(tǒng)植物學(xué)分類一致，可將10份種質(zhì)按種劃分成3個類群。在此基礎(chǔ)上篩選出4對核心引物構(gòu)建每份種質(zhì)的分子身份證。本研究為后續(xù)鉆喙蘭屬種質(zhì)資源的收集保存、鑒評和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鉆喙蘭屬；SSR；分子身份證

中圖分類號：S682.31""""""文獻標(biāo)志碼：A

Identification"of"Germplasm"Resources"and"Construction"of"Molecular"Identity"Card"for"Rhynchostylis

XIAO"Wenfang，"LI"Zuo，"CHEN"Heming，"LYU"Fubing*

Environmental"Horticulture"Research"Institute，"Guangdong"Academy"of"Agricultural"Sciences"/"Guangdong"Key"Lab"of"Ornamental"Plant"Germplasm"Innovation"and"Utilization，"Guangzhou，"Guangdong"510640，"China

Abstract："Rhynchostylis"is"an"epiphytic"orchid"belonging"to"the"Orchidaceae"family."It"possesses"high"ornamental"and"economic"value."In"this"study，"based"on"the"collection"of"10"different"germplasm"resources"from"three"common"species"of"Rhynchostylis，"21"pairs"of"SSR"polymorphic"primers"were"selected"using"fluorescent-labeled"capillary"electrophoresis"for"allele"variation"detection."Among"them，"13"primer"pairs"exhibited"high"polymorphism，"resulting"in"a"total"of"47"amplified"alleles."The"average"number"of"observed"alleles"（Na）"was"2.238，"and"the"average"number"of"effective"alleles"（Ne）"was"1.860."The"observed"heterozygosity"（Ho）"of"the"21"loci"ranged"from"0"to"0.778，"with"a"mean"of"0.421，"while"the"expected"heterozygosity"（He）"ranged"from"0.148"to"0.574，"with"a"mean"of"only"0.340."The"Shannon"index"（I）"ranged"from"0.096"to"0.987，"with"a"mean"of"0.567."The"clustering"results"and"PCoA"analyses"of"the"10"germplasm"were"consistent"with"the"traditional"botanical"classification，"and"all"the"germplasm"could"be"classified"into"three"taxa"by"species."On"this"basis，"four"pairs"of"core"primers"were"selected"to"construct"a"molecular"ID"for"each"germplasm."This"study"lays"a"foundation"for"the"collection，"conservation，"identification，"development"and"utilization"of"the"germplasm"resources"of"Rhynchostylis.

Keywords："Rhynchostylis;"SSR;"molecular"ID

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.007

鉆喙蘭屬（Rhynchostylis"Blume）為蘭科、樹蘭亞科、萬代蘭族、指甲蘭亞族的一類單軸生長型附生蘭花，具花多且密的總狀花序，因此又得名狐貍尾蘭。該屬目前僅發(fā)現(xiàn)和鑒定5個原生種，包括鉆喙蘭（R."retusa）、海南鉆喙蘭（R."gigantea）、立梗狐尾蘭（R."coelestis）、R."rieferi和R."cymifera，主要分布于我國的云南省、貴州省、海南島，以及印度、斯里蘭卡和東南亞各國[1]。該屬植物株型緊湊、花繁色艷且絕大多數(shù)具濃烈芳香，栽培管理簡單，耐熱性強，易雜交，具有較高的觀賞價值和開發(fā)應(yīng)用前景。從19世紀中葉開始，陸續(xù)有鉆喙蘭屬的種間雜交種、與近緣蘭科植物之間的屬間雜交種在英國皇家園藝學(xué)會（Royal"Horticultural"Society）登錄，截至2023年6月，登錄的鉆喙蘭屬原生種F1代雜交組合已達402個。泰國作為野生鉆喙蘭屬植物分布的中心地區(qū)之一，是最早開展鉆喙蘭屬植物育種、繁殖及栽培研究的國家之一，培育的品種在世界各地十分暢銷。我國最早于19世紀末20世紀初由臺灣企業(yè)從泰國引種栽培鉆喙蘭屬植物，并進行育種和栽培的相關(guān)研究，目前已培育出四倍體海南鉆喙蘭等極具特色的新品種，成為國內(nèi)外各大蘭展的獲獎熱門品種[2]。但我國大陸地區(qū)的市場尚未打開，鉆喙蘭屬植物鮮為消費者所知。

除傳統(tǒng)雜交育種工作外，鉆喙蘭屬植物的相關(guān)研究主要集中在組培快繁、栽培管理和野生資源分布及鑒定等方面[3-7]，分子生物學(xué)方面僅有極少量利用不同分子標(biāo)記或簡化基因組測序針對單獨的種進行遺傳多樣性等方面的分析。針對海南鉆喙蘭，目前僅利用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析來自海南島22個居群地的144份野生資源的遺傳多樣性[8]，發(fā)現(xiàn)海南鉆喙蘭的核型公式為2n=2x=36m+"2sm[9]，并利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)從海南鉆喙蘭中分離得到2個僅在生殖器官中表達的B類MADS-box基因RgAP3和RgPI[10]；針對鉆喙蘭，目前僅利用2個RAPD引物對包括鉆喙蘭在內(nèi)的9個不同的蘭科原生種進行了遺傳相似性分析[11]，利用13條RAPD引物和7條ISSR引物對采自印度7個不同地區(qū)的鉆喙蘭進行遺傳多樣性分析[12]，并利用ddRAD技術(shù)對包括鉆喙蘭在內(nèi)的4個蘭花原生種進行簡化基因組測序和遺傳多樣性分析[13]；針對立梗狐尾蘭構(gòu)建了包含10"600個BAC克隆的人工細菌染色體[14]以供后續(xù)進行基因組結(jié)構(gòu)分析。

基于鉆喙蘭屬植物本身的優(yōu)良特性，及其與蝴蝶蘭（Phalaenopsis"Blume）、萬代蘭（Vanda）、指甲蘭（Aerides"falcata"Lindl.）等能夠進行遠緣雜交創(chuàng)制跨屬雜交新種質(zhì)的優(yōu)勢，近年來受到越來越多育種工作者的關(guān)注，急需系統(tǒng)性開展鉆喙蘭屬種質(zhì)資源的開發(fā)、保護、保存與鑒評工作。TP-M13-SSR（simple"sequence"repeat"with"tailed"primer"M13）技術(shù)結(jié)合了SSR分子標(biāo)記技術(shù)和熒光測序技術(shù)，具有重復(fù)性高、結(jié)果準確等優(yōu)點，在較大程度上解決了傳統(tǒng)凝膠電泳分析通量較低、擴增產(chǎn)物檢測流程繁瑣、數(shù)據(jù)記錄工作量大等一系列問題[15]。目前TP-M13-SSR已在茶花[16]、百合[17]、桂花[18]、荷花[19]等各類觀賞花卉的種質(zhì)資源鑒定和指紋圖譜構(gòu)建方面得到應(yīng)用，在蘭科植物中已成功應(yīng)用于蝴蝶蘭的突變體鑒定[20]、建蘭（Cymbidium"ensifolium）的核心種質(zhì)構(gòu)建[21]、石斛蘭（Dendrobium"Sw.）原生種的鑒評[22]等方面。

為充分保護和利用鉆喙蘭屬資源的多樣性，本研究利用自主開發(fā)的鉆喙蘭屬基因組SSR引物和蘭科通用SSR引物，對鉆喙蘭屬常見3個種的10份種質(zhì)資源進行分析鑒評，從DNA水平揭示鉆喙蘭屬種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，分析其遺傳多樣性并建立種質(zhì)資源的分子身份證，為鉆喙蘭屬種質(zhì)資源的保護及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""材料

供試品種為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所收集保存的10份鉆喙蘭屬原生種資源，具體性狀信息見表1，均種植于廣東省農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化科技示范區(qū)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所溫室大棚內(nèi)，于2020年5月采集根尖，于液氮中速凍15"min后放入超低溫冰箱，備用。

1.2""方法

根據(jù)簡化基因組信息開發(fā)篩選出12對鉆喙蘭屬內(nèi)和12對鉆喙蘭屬與蝴蝶蘭屬通用引物（待發(fā)表），在不同樣品中進行單重PCR擴增，反應(yīng)體系總體積為10"μL，其中含50"ng/μL"DNA模板1.2"μL，10×Buffer"Ⅰ緩沖液1.0"μL，5"U/μL的TaKaRa"HS"Taq酶0.1"μL，5"μmol/L的上下游引物各0.3"μL，2.5"mmol/L的dNTP"0.8"μL，5"μmol/L的TP-M13"0.5"μL，去離子水5.8"μL。反應(yīng)程序為：95"℃預(yù)變性5"min；95"℃變性30"s，60"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，30個循環(huán)；95"℃變性30"s，53"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，10個循環(huán)；60"℃，30"min。

在96孔板中，每孔加入篩選引物的擴增產(chǎn)物1.0"μL，ROX-500分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5∶8.5）9"μL，95"℃變性3"min后，利用ABI"3730XL檢測儀進行檢測，1"kV電壓進樣10"s，電泳15"kV，30"min。將Data"Collection軟件收集的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到GeneMapper"3.2軟件中進行分析，將各峰值的位置與其泳道中的分子量內(nèi)標(biāo)予以比較，計算目標(biāo)DNA片段的準確大小。各熒光標(biāo)記座位上獨立進行3次重復(fù)的毛細管電泳檢測，取3次重復(fù)的平均值并四舍五入取整，作為試驗材料在該座位上的數(shù)據(jù)。

1.3""數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴增數(shù)據(jù)對10份鉆喙蘭屬種質(zhì)進行遺傳多樣性分析。運用GenAlEx"6.503軟件計算引物的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon指數(shù)（I）、觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He），并繪制PCoA圖，利用PowerMarker"V3.25軟件計算引物的多態(tài)性信息含量（PIC），利用NTSYS"2.10軟件進行聚類作圖。并根據(jù)引物的PIC及其在鉆喙蘭屬內(nèi)不同種間的通用性篩選核心引物，構(gòu)建每份種質(zhì)的分子身份證。

2""結(jié)果與分析

2.1""鉆喙蘭屬種質(zhì)資源概述

鉆喙蘭屬目前已發(fā)現(xiàn)和鑒定的原生種共5個，其中3個發(fā)現(xiàn)較早、分布廣泛、雜交利用率較高，3個種均已有雜交后代登錄，另2個原生種分布范圍狹窄、發(fā)現(xiàn)較晚，尚無育種利用和針對性研究。

2.1.1""海南鉆喙蘭（R."gigantea）""廣泛分布于中國海南島和中國黃海附近島嶼，緬甸仰光和東高附近以及北部的其他地方，泰國東部地區(qū)、西南地區(qū)的北碧府，新加坡及附近島嶼，老撾的萬象平原和波羅芬高地，柬埔寨的Camchay山，越南胡志明市和廣治省附近，婆羅洲，印度尼西亞的阿南巴斯島。該種的主要特點：花序下垂；花較大，花朵平均直徑為3.4"cm；唇瓣片前部明顯3裂；距狹圓錐形，底端銳尖；蕊柱足不明顯；芳香；花期冬季到春季[23]。山采株的花色主要為白底紅點、白底紅粗斑及純白色變種。目前不同品系間已雜交選育出純紅色變形，且臺灣地區(qū)利用粗斑帶橙色的突變個體已選育出橙色海南鉆喙蘭，并利用橙色個體與白色變種進行雜交選育偏綠色的海南鉆喙蘭。截至2023年6月，該種在英國皇家園藝學(xué)會登錄的雜交F1代有186個，其中海南鉆喙蘭作為父本的有156個，作為母本的有30個，可見其作為父本的雜交育性顯著高于作為母本的雜交育性。

2.1.2""立梗狐尾蘭（R."coelestis）"nbsp;廣泛分布于泰國北部、東北部、西部、西南部的山區(qū)和巴蜀省的低海拔地區(qū)，柬埔寨南部，越南大叻附近的山區(qū)，老撾。該種的主要特點：花序挺立斜生；花較小，花朵平均直徑為2.3"cm；唇瓣片前部明顯3裂；距狹圓錐形，底端銳尖下彎；蕊柱足明顯；芳香；花期春季到夏季[23]。山采株的花色為白底帶藍紫色暈、藍紫色唇瓣，也有白底帶紫紅色暈的變形和純白色的變形。目前中國臺灣地區(qū)利用多倍體育種技術(shù)已選育出四倍體的立梗藍狐尾。截至2023年4月，該種已在英國皇家園藝學(xué)會登錄的雜交F1代有174個，其中立梗狐尾蘭作為母本的有137個，作為父本的有37個，其作為父本的雜交育性顯著高于作為母本的雜交育性。

2.1.3""鉆喙蘭（R."retusa）""廣泛分布于中國云南省西南部和貴州省，斯里蘭卡，印度北部和南部，泰國，馬來西亞，爪哇島，菲律賓呂宋島的巴丹省、布拉干省、甲米地和黎剎省。該種的主要特點：花序下垂；花較小，花朵平均直徑為2.2"cm；唇瓣片不明顯3裂；距囊狀，兩側(cè)壓扁，底端鈍圓；蕊柱足明顯；無香或淡香；花期冬季到春季[23]。山采株的花色為白底紫紅點，已選育出純白色變形。截至2023年4月，該種已在英國皇家園藝學(xué)會登錄的雜交F1代有46個，其中鉆喙蘭作為母本的僅有2個，作為父本的有44個，其作為父本的雜交育性同樣顯著高于作為母本的雜交育性。

2.1.4""R."rieferi""僅分布于菲律賓。2009年發(fā)現(xiàn)并鑒定為鉆喙蘭屬新種，尚無育種利用等針對性的相關(guān)研究。該種的主要特點：花序下垂；花較小；唇瓣狹窄且小，急劇上翹；距較短；芳香[24]。

2.1.5""R."cymifera""僅分布于印度西南部Nilambur的常綠森林中。2018年發(fā)現(xiàn)并鑒定為鉆喙蘭屬新種，尚無育種利用等針對性的相關(guān)研究。該種的主要特點：花序下垂；花較??；斜菱形花瓣；方形漸變成倒卵形的唇瓣，先端微凹；長且尖的距；球形花粉塊；無香；花期春季到夏季[25]。

本研究共采用6個不同的海南鉆喙蘭原生種、3個不同的立梗狐尾蘭原生種和1個山采株色鉆喙蘭原生種，涵蓋鉆喙蘭屬常見3個種中目前發(fā)現(xiàn)和鑒定的所有變種和變型，具體性狀見表1。除花色外，海南鉆喙蘭與鉆喙蘭、立梗狐尾蘭最主要的性狀區(qū)別在于花梗的下垂與直立，而鉆喙蘭區(qū)別于海南鉆喙蘭和立梗狐尾蘭的性狀主要在于花香及花朵數(shù)，鉆喙蘭基本無香但花朵數(shù)可多達百朵，海南鉆喙蘭和立梗狐尾蘭均具濃香但花朵數(shù)較少。

2.2""遺傳多樣性及聚類分析

采用自主開發(fā)的12對鉆喙蘭屬特異引物和12對鉆喙蘭屬與蝴蝶蘭屬通用引物，對來自3個種的10份鉆喙蘭屬種質(zhì)進行檢測，其中3對引物擴增后不具多態(tài)性，其余21對引物共擴增出47個等位基因（表2），每對引物擴增出1～3個等位基因，Na均值為2.238，Ne均值為1.860。24個位點的Ho為0～0.778，均值為0.421，He為0.148～"0.574，均值僅0.340，I介于0.096～0.987之間，均值為0.567，表明供試種質(zhì)的雜合程度極低，遺傳多樣性不高，這與供試種質(zhì)均為原生種或其變型和變種有關(guān)。21對引物中有13對引物位點呈高多態(tài)性（PICgt;0.5）[26]，證明本研究所篩選出的多數(shù)引物適用于鉆喙蘭屬種質(zhì)鑒評。

根據(jù)Nei’s遺傳距離，對10份鉆喙蘭屬種質(zhì)資源構(gòu)建UPGMA遺傳關(guān)系聚類圖（圖1），如圖1所示，10份鉆喙蘭屬種質(zhì)被分為三大類，同一個種的種質(zhì)聚為一類，10份鉆喙蘭屬種質(zhì)的PCoA分析結(jié)果顯示，PCoA1和PCoA2分別占所有鉆喙蘭屬種質(zhì)總遺傳變異的32.63%和15.30%；PCoA分析同樣將10份種質(zhì)分為三大類，同一個種的種質(zhì)聚為一類（圖2）。聚類結(jié)果和PCoA分析結(jié)果與鉆喙蘭屬種質(zhì)植物學(xué)分類結(jié)果一致。

2.3""核心引物篩選及分子身份證構(gòu)建

根據(jù)引物多態(tài)性信息含量（PIC）及其在鉆喙蘭屬內(nèi)不同種間的通用性，從1對引物開始逐步增加引物數(shù)量篩選出可將供試種質(zhì)全部區(qū)分的引物組合，最終確定引物組合28-N1001301+2-"N10002234+43-N5725511能夠?qū)⑺袠悠穮^(qū)分開，但這3個引物的通用性均未達到100%，考慮到后續(xù)樣品的適用性，增加通用性100%的88-N1001036引物（PIC僅次于前3個引物）作為核心引物，最終確定28-N1001301+2-N10002234+"43-N5725511+8-N1001036作為今后鉆喙蘭屬種質(zhì)資源鑒定的核心引物組合，其他引物作為備選。

通過數(shù)據(jù)化編碼構(gòu)建鉆喙蘭屬種質(zhì)的分子身份證，其構(gòu)成包括2個部分。第1部分為前2位字母，表示物種信息，鉆喙蘭屬目前共5個種，包括海南鉆喙蘭（RG）、立梗狐尾蘭（RC）、鉆喙蘭（RR）、R."rieferi（RI）、R."cymifera（RC）。第2部分為后續(xù)的數(shù)字，代表4對核心引物擴增結(jié)果，2-N10002234、28-N1001301、43-N5725511、88-N10010364的擴增片段按分子量大小排列，從小到大以阿拉伯?dāng)?shù)字1～9標(biāo)注，若該位點在某個種質(zhì)中無擴增則記為0，每個引物占2位。如R01海南鉆喙蘭（R."gigantea"‘Shen’s"Suns’）的分子身份證為RG00334411，RG代表其為海南鉆喙蘭這個種的種質(zhì)資源，00334411為其通過核心引物擴增轉(zhuǎn)換而來的專屬編碼。最終構(gòu)建的10份鉆喙蘭屬種質(zhì)分子身份證代碼均不相同，能夠?qū)⑺蟹N質(zhì)區(qū)分開，并利用每個種質(zhì)資源的分子身份證編號，分別制作種質(zhì)特異的條形碼（圖1）。

3""討論

鉆喙蘭屬種質(zhì)資源雖不豐富，但作為蝴蝶蘭屬近緣物種，具有易雜交的特性，可與蝴蝶蘭進行跨屬遠緣雜交創(chuàng)制新種質(zhì)。因鉆喙蘭屬大多數(shù)種質(zhì)具濃香，可作為蝴蝶蘭新品種的香味性狀親本來源，目前鉆喙蘭屬常見3個種與蝴蝶蘭屬不同種質(zhì)均已有雜交新品種育成。且鉆喙蘭屬種質(zhì)具有蝴蝶蘭不具備的許多優(yōu)點，如栽培管理簡單粗放、抗性強，海南鉆喙蘭在廣東地區(qū)不用低溫催花可應(yīng)春節(jié)開花，因此鉆喙蘭屬種質(zhì)極具開發(fā)應(yīng)用潛力。雖然鉆喙蘭屬的育種工作起步較早，1825年已在野外發(fā)現(xiàn)鉆喙蘭這個原生種并命名，1935年在英國皇家園藝學(xué)會上登錄了第1個鉆喙蘭與鳳蝶蘭的跨屬雜交種Rhynchanthe"Bernardii，1970年在英國皇家園藝學(xué)會上登錄了第1個海南鉆喙蘭與鉆喙蘭間的種間雜交種R."Chorchalood，但與蝴蝶蘭屬、石斛屬、萬代蘭屬等其他大屬相比，其進展緩慢，目前國內(nèi)外僅個別蘭場栽培了少量單株作為稀有資源進行銷售，資源鑒評等相關(guān)研究相對十分匱乏，嚴重制約了鉆喙蘭屬種質(zhì)的保護和開發(fā)利用。

我國作為鉆喙蘭屬野生資源分布區(qū)，海南島分布大量海南鉆喙蘭，而云南和貴州則分布有鉆喙蘭野生資源，但目前針對相關(guān)資源僅進行了少量的分布調(diào)查[2，"7]、組培快繁和栽培管理[5-6，"27]等方面的簡單研究，資源鑒評方面僅利用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析了來自海南島22個居群地144份野生資源的遺傳多樣性[7]。SSR分子標(biāo)記是國際植物新品種保護聯(lián)盟指定的構(gòu)建植物DNA指紋圖譜的首選方法[28]，可檢測DNA序列的差異，穩(wěn)定性強、可重復(fù)性好，已廣泛應(yīng)用于蘭科植物的種質(zhì)鑒評[20-22，"29]。分子身份證是將目標(biāo)種質(zhì)的分子指紋圖譜進行編碼，形成種質(zhì)對應(yīng)的特異編號儲存其身份信息，對于數(shù)字化管理種質(zhì)和鑒別具有重要作用，已在石斛蘭[22]、石蒜屬[30]等花卉中成功應(yīng)用。本研究基于自有資源圃收集保存的鉆喙蘭屬3個常見種的10份不同種質(zhì)資源，利用自主開發(fā)的SSR引物，對其進行遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析和分子身份證構(gòu)建。根據(jù)SSR分子標(biāo)記分析的遺傳距離系數(shù)，利用UPGMA方法和PCoA分析可以將供試的10份鉆喙蘭屬種質(zhì)按照種劃分為3個類群，與傳統(tǒng)植物分類結(jié)果一致。根據(jù)引物多態(tài)性信息含量及其在鉆喙蘭屬內(nèi)不同種間的通用性篩選出的4對核心引物能夠?qū)?0份鉆喙蘭屬種質(zhì)完全區(qū)分開，為每份種質(zhì)建立了獨有的分子身份證。這充分說明本研究開發(fā)篩選的引物適用于鉆喙蘭屬種質(zhì)的鑒評，可用于野生資源的遺傳多樣性分析、品種資源的分類鑒定、資源圃的分類管理等，為今后鉆喙蘭屬種質(zhì)的收集保存和鑒定提供理論基礎(chǔ)。

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