藍莓自花和異花授粉花柱轉錄組SSR位點分析

摘要 為鑒定藍莓自交不親和基因，本研究對“杰兔”藍莓品種自花和異花授粉花柱進行了轉錄組測序，對簡單重復序列（SSR）位點進行分析，對含SSR位點且差異表達的非冗余序列（Unigene）進行基因本體論（GO）功能富集和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）注釋分析，并開展SSR標見引物設計。結果表明，藍莓花柱轉錄組共獲得85 890條Unigene，其中有21 962個Unigene含有26 557個SSR位點，發(fā)生頻率為25.57%。在所有SSR位點中包含有297種重復基元，以單核苷酸和二核苷酸重復為主要重復類型，占總SSR的89.52%；其中A/T類型和AG/CT類型SSR位點數(shù)占SSR總數(shù)的83.44%。針對所有SSR位點，共設計出17 212對引物，成功率78.37%。差異轉錄組篩選到58、27、16、3、2和1條含有SSR位點的差異表達Unigene，分別與植物激素信號轉導、細胞骨架、蛋白質泛素化、花粉管生長、核糖核酸酶T2家族和細胞程序化死亡等代謝途徑相關。本研究豐富了藍莓的EST-SSR分子標記，為藍莓自交不親和的分子機制研究提供了參考。

關鍵詞 藍莓；自花授粉；異花授粉；花柱；轉錄組；簡單重復序列

中圖分類號 S603.2" "文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）11-0033-09

Analysis of SSR loci in blueberry self-pollinated and cross-pollinated styles transcriptome

YANG Qin1，2" " FU Yan3" " DENG Jie1，2" " ZHANG Tingting1，2" " LIU Yalan1，2

（1Key Laboratory of Molecular Breeding and Variety Creation of Horticultural Plants for Mountain Featuresnbsp;in Guizhou Province， Kaili 556000， China;"2Development Planning Division， Kaili University， Kaili 556000， China;3Qiandongnan Vocational and Technical College， Kaili 556000， China）

Abstract In order to carry out the identification of self-incompatibility genes in blueberry， transcriptome sequencing was performed on the self-pollinated and cross-pollinated styles of blueberry cultivar “Premier” in this study， and simple repeat sequence （SSR） loci were analyzed. On this basis， SSR loci of assembled and redundant Unigene were analyzed， as well as it was conducted that the significant enrichment analysis of GO and KEGG for the differential expression of unigenes containing SSR， and the SSR primers were designed. The results showed that a total of 85 890 unigenes were obtained from the blueberry styles transcriptome， of that 21 962 Unigene were found to contain 26 557 SSR loci， with a frequency of 25.57%. The mononucleotide and dinucleotide repeats were the main repeat types of the 297 kinds of repeat motif in all SSR loci， accounting for 89.52% of the total SSR， of which the number of A/T and AG/CT SSR locations accounted for 83.44% of the total number of SSR locations. A total of 17 212 pairs of primers were designed for all SSR loci， with a success rate of 78.37%. The differential transcripome combined with SSR loci information showed that 58， 27， 16， 3， 2 and 1 unigene with SSR sites were screened， which were related to plant hormone signal transduction， cytoskeleton， protein ubiquitination， pollen tube growth， ribonucnase T2 family， and programmed cell death， respectively. This study not only enriched EST-SSR markers of blueberry， but also laid a foundation for molecular mechanism of self-incompatibility in blueberry.

Keywords blueberry; self-pollination; cross-pollination; styles;transcriptome; simple sequence repeat

簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）是指1～6個核苷酸為基本單元經多次重復而組成的一段核苷酸序列，其廣泛分布于真核生物和原核生物基因組中[1]。與其他分子標記相比，該序列為共顯性標記，具有數(shù)量豐富，等位基因變異較大，共顯性、特異性、多態(tài)性和穩(wěn)定性高，重復性好、覆蓋面廣等優(yōu)點[1-2]。目前，SSR分子標記被廣泛應用于果樹植物的親緣關系鑒定[3]、遺傳多樣性分析[4-5]、親本分析和分子標記輔助育種[6-7]以及特異性狀鑒定[8-9]中。隨著生物技術的發(fā)展，SSR根據(jù)來源可分為基因組SSR和表達序列標簽SSR（EST-SSR）[10]，與基因組SSR相比，EST-SSR標記對分子標記輔助選擇更有價值，其與果實大小、果實形狀和果皮顏色等農藝性狀基因座相關[11]。近年來，相關學者研究分析了薄殼山核桃雌雄花序[1]、黑莓果實[2]、梨果皮[11]、柿雌雄花芽[12]、黑果枸杞經干旱脅迫的葉和根[13]以及枇杷花[14]等轉錄組數(shù)據(jù)的SSR特征，并在此基礎上開發(fā)了SSR引物，為這些果樹的遺傳多樣性分析、種質鑒定、QTL定位和分子標記輔助育種等工作提供了豐富的EST-SSR標記。

藍莓是一種多年生常綠或落葉灌木類經濟小漿果作物[15-16]，藍莓果實酸甜適度、口感細膩，富含花色苷、維生素、氨基酸和多酚等活性成分，具有抗氧化、調節(jié)腸道菌群和增強視力等功能[17]。藍莓被認為是優(yōu)化人類膳食結構的重要鮮食果品之一，也是較具發(fā)展?jié)摿Φ乃籟18]。相關研究表明，高叢藍莓、兔眼藍莓和矮叢藍莓三大栽培類型[19]的多數(shù)品種自花授粉結實率較低，表現(xiàn)出一定的自交不親和性[20-23]。目前，關于藍莓自交不親和的研究主要集中在其自交不親和的表型觀察與評價上，如花粉在柱頭上的水合萌發(fā)，花粉管在花柱中的生長情況[22]，坐果率與品質差異等[20，24]，而關于其形成的分子機制研究較少。SSR分子標記可以有效地鑒定枇杷[25]、紅樹莓[9]以及油橄欖[26]等的自交不親和性及S等位基因。目前關于藍莓EST-SSR分子標記的開發(fā)較為有限，部分學者利用藍莓花芽[27]、葉片[28]、花粉[16]和果實[29]的轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了一些EST-SSR標記，而關于利用藍莓花柱轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR以及利用EST-SSR標記開展自交不親和基因鑒定的研究報道較少。本研究對藍莓自花和異花授粉的花柱進行轉錄組測序，分析其SSR位點，對含SSR位點且差異表達的非冗余序列（Unigene）進行基因本體論（GO）功能富集和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）注釋分析，并開展引物設計，目的在于為藍莓自交不親和基因鑒定，親和性品種的分子標記輔助育種以及自交不親和的分子機制研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以兔眼藍莓品種“杰兔”為研究對象，選取60棵植株作為供試材料；異花授粉的花粉來源于“燦爛”和“粉藍”兩個兔眼藍莓品種；參試各品種材料均種植于凱里學院卓越農林人才培養(yǎng)實訓基地內，為生長健壯且無病蟲害的8年生植株。

1.2 授粉與取材

初花期，按照楊芩等[30]的藍莓結果枝分類標準，選取“杰兔”參試植株樹冠外圍生長健壯且無病蟲害的中結果枝和長結果枝，用鑷子將1 500朵花蕾期花去雄后，采用尼龍網(wǎng) （100目） 對去雄后的結果枝進行套袋隔離處理，然后掛牌標記各結果枝的去雄時間和花朵數(shù)，其余已開放或太小的花均去除。在去雄后的第3天，分別采集“粉藍”“燦爛”和“杰兔”的花粉，并立即實施異花授粉和自花授粉[23]?！敖芡谩薄痢胺鬯{”、“杰兔”ד燦爛”以及“杰兔”ד杰兔”3個處理分別授粉450朵花，余下的150朵未授粉花的花柱為對照材料。分別取未授粉花及自花授粉和異花授粉后24、48和96 h的花，取后立即用液氮速凍并保存，帶回實驗室將材料置于經液氮預冷的無菌磁盤中，用手術刀將花柱從基部與子房分離，分離的花柱立即放入裝滿液氮和已標記相應處理標記的5 mL離心管中；各處理每分離50枚花柱即移入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 轉錄組測序及Unigene組裝

委托生物科技公司采用Illumina NovaSeq 6000 platform（San Diego）平臺對“杰兔”未授粉的花柱，以及自花和異花授粉后24、48和96 h的花柱，共10個不同處理的花柱進行轉錄組測序，獲得10個藍莓花柱轉錄組的Raw Reads數(shù)據(jù)。通過去除含有接頭的Reads；去除N的比例大于10%的Reads；去除質量值Q≤10的堿基數(shù)占整條Reads 50%以上的Reads進行質量控制，獲得高質量的序列，之后按照Beedanagari等[31]的方法利用Trinity組裝軟件對其進行Denovo拼接，得到Unigene；然后采用序列聚類軟件對不同樣品組裝得到的Unigene進行進一步的序列拼接和去冗余處理，進而得到盡可能長的非冗余Unigene[1]。

1.4 SSR鑒定及含SSR的Unigene功能注釋

采用MISA軟件對1 kb以上的Unigene進行SSR序列鑒定，通過Blastx將篩選的含SSR的差異表達Unigene比對NR、SwissProt、KEGG、GO和COG/KOG數(shù)據(jù)庫，獲得含SSR的差異表達Unigene的GO基因功能、KOG分類和KEGG代謝途徑[32]。以含SSR的差異表達Unigene功能富集分析為基礎，以配子體自交不親和花粉管信號轉導過程為線索篩選藍莓花柱自交不親和及花粉管信號轉導相關的SSR位點。

1.5 SSR位點信息的發(fā)掘與引物設計

按照楊芩等[16]的方法，采用MIcroSAtellite（MISA）工具進行SSR的識別鑒定，其最小單位數(shù)搜索設置條件分別為10、6、5、5、5和5個重復序列，通過對Unigene序列的SSR分析，鑒定出SSR 6的重復類型；在此基礎上參照Yang等[33]的默認參數(shù)設置，采用Primer 3軟件對獲得的SSR進行引物設計。

2 結果與分析

2.1 藍莓自花和異花授粉花柱轉錄組中SSR位點的分布特點

完成“杰兔”未授粉的花柱、自花和異花授粉后24、48和96 h花柱的轉錄組測序，各處理轉錄組的Clean Data均達到6.21 Gb以上，共獲得67.12 Gb的Clean Data。10個處理的花柱轉錄組的Q30堿基百分比在94.35%以上。如表1所示，組裝后共獲得總長度82 908 720 bp的Unigene 85 890個，其中26 956條Unigene的長度在1 kb以上；N50長度1 547 bp，其中絕大多數(shù)Unigene的G+C含量46.09%～46.48%。搜索結果表明，共發(fā)現(xiàn)26 557個SSR位點，擁有SSR位點的Unigene 21 962個，即85 890個Unigene中SSR的發(fā)生頻率25.57%。此外，在擁有SSR位點的21 962個Unigene中，有1 366個Unigene含有3個及以上的SSR位點，含有2個SSR位點的Unigene有709個。

如表2所示，單核苷酸重復SSR出現(xiàn)頻率最高（17.89%），所占的比例最大（57.85%）；二核苷酸重復SSR次之，其出現(xiàn)頻率和占比分別為9.79%和31.67%；兩者出現(xiàn)的頻率之和為27.68%，所占總SSR的比例之和為89.52%。即藍莓花柱轉錄組中SSR的主要重復類型是單核苷酸重復SSR和二核苷酸重復SSR。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復SSR的數(shù)量較少，三者所占的比例總計0.56%，三者出現(xiàn)的頻率分別為0.14%、0.02%和0.01%。

不同類型核苷酸重復SSR的平均分布距離與其出現(xiàn)頻率密切相關，總體表現(xiàn)為出現(xiàn)頻率越低，分布平均距離越大的趨勢。六核苷酸重復SSR的出現(xiàn)頻率最低（0.01%），其分布平均距離最大（6 909.06 kb）；單核苷酸重復SSR的出現(xiàn)頻率最高（17.89%），其分布的平均距離最?。?.40 kb）。五核苷酸、四核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重復SSR的分布平均距離分別為5 922.05、679.58、31.46和9.86 kb。

2.2 藍莓自花和異花授粉的花柱轉錄組SSR重復基元特點

如圖1所示，26 557個藍莓自花和異花授粉的花柱轉錄組SSR的重復基元共有297種。重復基元的種類多少與SSR的重復類型和出現(xiàn)頻率有著密切聯(lián)系，五核苷酸和六核苷酸重復SSR的重復基元出現(xiàn)頻率均在0.50%以下，其重復基元種類最少，均只有9種。單核苷酸重復SSR的重復基元種類相較五核苷酸和六核苷酸有所增加，為36種，其中A/T的重復基元在分布上占比最高，出現(xiàn)頻率57.50%；二核苷酸重復SSR的重復基元種類相較單核苷酸重復SSR的增加19種，以AG/CT為重復基元的SSR出現(xiàn)頻率最高，為25.94%。在6種核苷酸重復SSR類型中，三核苷酸重復SSR的重復基元共有147種，其中有721個SSR以AAG/CTT為重復基元，其出現(xiàn)頻率在三核苷酸重復SSR中最高，為2.71%；其次是以ACC/GGT為重復基元的三核苷酸重復SSR，有451個，出現(xiàn)頻率1.70%；再次是以AGG/CCT為重復基元的三核苷酸重復SSR，有380個，出現(xiàn)頻率1.43%。

2.3 藍莓自花和異花授粉的花柱轉錄組中SSR的重復次數(shù)和基序長度

如表3所示，在10～22的SSR重復次數(shù)范圍內，藍莓自花和異花授粉花柱轉錄組6種類型SSR隨著重復次數(shù)的增加，其總計數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。藍莓自花和異花授粉花柱轉錄組SSR重復5～22次，大多重復5～16次。同時，重復10次的6種核苷酸重復SSR共有5 452個，出現(xiàn)頻率最高，為20.53%；重復6次的6種核苷酸重復SSR有3 689個，占總數(shù)的13.89%；重復11次的6種核苷酸重復SSR有3 017個，占總數(shù)的11.36%。此外，有2 167個SSR的重復基元重復12次，占總數(shù)的8.16%；有1 438個SSR的重復基元重復13次，占總數(shù)的5.41%；6種核苷酸重復SSR，共有3 511個SSR的重復基元重復14次及以上，占總數(shù)的13.22%。

如圖2所示，藍莓自花和異花授粉的花柱轉錄組中有93.67%的SSR的基序長度12～20 bp，表明藍莓花柱轉錄組SSR的基序長度以12～20 bp為主，長度21～60的基序占比3.21%，超過61 bp的基序長度占比3.12%。

如圖3所示，對含SSR的差異表達Unigene進行GO功能富集分析表明，在21 962個具SSR位點的Unigene中，有2 126個含有SSR位點的差異表達Unigene被富集到生物學、分子和細胞組分3個Ontology類別的34個GO Term中。細胞組分涉及的GO Term在3類Ontology中最少，為3個（8.82%），分子功能涉及的GO Term較多，為12個（35.29%），而生物過程涉及的GO Term最多，為19個（55.89%）。在生物過程中，代謝過程和細胞過程富集具有SSR位點的差異表達Unigene分別為1 183和1 097個，余下的代謝類別中，定位、生物調節(jié)和刺激反應3類代謝過程富集具有SSR位點的差異表達Unigene數(shù)量分別為291、279和275個；余下的代謝類別富集具有SSR位點的差異表達Unigene均未超過100個。在分子過程中，催化活性和綁定兩類代謝過程富集具有SSR位點的差異表達Unigene較為豐富，分別有1 266和936個。在細胞組分相關代謝中，僅有細胞內部分、蛋白復合體和細胞解剖實體三類代謝過程富集到具有SSR位點的差異表達Unigene，其中細胞解剖實體代謝過程富集的具有SSR位點的差異表達Unigene有1 375個。

如圖4所示，對含SSR位點的差異表達Unigene進行KEGG功能富集分析表明，共有659個含SSR位點的差異表達Unigene被富集到112個代謝途徑中，其中被明顯（qvaluelt;0.02）富集的代謝途徑有12個，包括苯丙類生物合成（ko00940），植物激素信號轉導（ko04075），類黃酮生物合成（ko00941），類胡蘿卜素生物合成（ko00906），氮代謝（ko00910），苯丙氨酸代謝（ko00360），谷胱甘肽代謝（ko00480），苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成（ko00400），異喹啉生物堿生物合成（ko00950），植物晝夜節(jié)律（ko04712），二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成（ko00945），糖和葡萄糖酸鹽相互轉化（ko00040）。58個含有SSR位點的差異表達Unigene被富集到植物激素信號轉導途徑，其中與生長素合成信號轉導相關的有23個，與細胞分裂素信號轉導相關的有5個，與赤霉素信號轉導相關的有3個，與脫落酸信號轉導相關的有10個，與乙烯信號轉導相關的有5個，與油菜素內酯信號轉導相關的有4個，與茉莉酸信號轉導相關的有6個，與水楊酸信號轉導相關的有4個。同時，進一步篩選獲得與蛋白質泛素化、花粉管生長、核糖核酸酶T2家族以及細胞程序化死亡等相關的含有SSR位點的差異表達Unigene分別有16、3、2和1個。此外，KOG功能富集分析篩選出27個與細胞骨架相關的含有SSR位點的差異表達Unigene。

2.5 藍莓自花授粉和異花授粉花柱轉錄組SSR的引物設計

如表4所示，對21 962個含有SSR位點的Unigene采用Primer 3進行引物設計，成功率78.37%，共設計長度20～25 bp的SSR引物17 212對，預測這些引物擴增產物的大小100～280 bp。在成功設計的17 212對SSR引物中，預測的擴增產物為單核苷酸重復的引物占比最高，為55.86%，有9 614對；有4 415對引物的預測擴增產物為二核苷酸重復，占比25.65%；有1 986對引物的預測擴增產物為三核苷酸重復，占比11.54%。預測擴增產物為四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的引物占比均未超過1.00%。此外，在17 212對SSR引物中，有1 098對引物的預測擴展產物為復雜重復類型，占比6.38%。

3 結論與討論

本研究通過對兔眼藍莓“杰兔”未授粉花柱，自花和異花授粉花柱轉錄組總長82.91 Mb的85 890條序列進行檢測，共獲得26 557個SSR位點，SSR在所檢測序列中的出現(xiàn)頻率30.92%。SSR位點在“杰兔”花柱轉錄組序列中出現(xiàn)的頻率，高于藍莓花芽（12.67%）[27]、藍莓葉片（21.32%）[28]和藍莓果實（20.81%）[29]，略低于藍莓花粉（35.28%）[16]，這可能是因為轉錄組測序所選取的器官不同。同時，本研究中藍莓花柱轉錄組中SSR的出現(xiàn)頻率高于黑莓果實（11.29%）[2]、梨果皮（12.45%）[11]、薄殼山核桃（21.29%）[1]、白掌（22.06%）[32]、黑果枸杞（26.36%）[13]，低于油梨花和小果（35.05%）[3]、柿雌雄花（38.49%）[12和枇杷花（47.51%）[14]，這可能與自花授粉和異花授粉后花柱中的一些基因具有時空表達和組織表達特性，也可能與不同植物的基因結構差異或設置的SSR搜索參數(shù)不同有關[2]。

SSR的重復次數(shù)和基本重復基元具有高度變異性，兩者的變化均能導致SSR位點長度變化，進而使SSR擁有較強的多態(tài)性[2，14]。本研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸和二核苷酸重復SSR是藍莓花柱轉錄組SSR的主要重復類型，兩者占總SSR的89.52%，出現(xiàn)頻率27.68%；研究結果與在枇杷花[14]、薄殼山核桃[1]和藍莓花粉[16]中研究的結果一致，但與藍莓花芽和葉片轉錄組SSR分析結果不完全一致[27]，藍莓花芽和葉片的轉錄組SSR的主要重復類型為二核苷酸和三核苷酸重復，這可能與材料不同有關。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，單核苷酸和二核苷酸重復序列的優(yōu)勢基元分別為A/T和AG/CT，這與在藍莓花芽[27]、葉片[28]、果實[29]和花粉[16]轉錄組SSR信息位點優(yōu)勢基元分布的結果基本一致，這可能與AT鍵因能量較GC鍵低容易波動和斷裂有關[14]。

SSR分子標記的基元重復次數(shù)和序列片段長度對其多態(tài)性高低程度有著重要的影響，一般來說，SSR基元的重復次數(shù)越高，其含多態(tài)性的位點越多，表明其開發(fā)多態(tài)性SSR分子標記的潛力越大[2]。本研究中藍莓自花和異花授粉后花柱轉錄組的SSR重復5～22次，其中有26.79%的SSR重復12次以上；同時，藍莓自花和異花授粉的花柱轉錄組中有93.67%的SSR的基序長度12～20 bp，基序長度≥20 bp的SSR占比6.33%，這表明藍莓自花和異花授粉花柱轉錄組SSR的重復次數(shù)較高，具有良好的多態(tài)性潛能。此外，針對含有SSR位點的21 962個Unigene開展引物設計，共成功設計獲得17 212對SSR引物，成功率78.37%，這與藍莓花粉[16]、梨果皮[11]轉錄組開發(fā)SSR引物的成功率相近。

植物在包含時間和空間限定下的特定環(huán)境中發(fā)生的生理應激反應會引起某些特異功能基因的時空差異表達和組織差異表達，進而導致其生長和生理等表型特征發(fā)生變化。因此，開展不同處理及處理后不同時間材料的轉錄組測序能夠高效篩選研究對象的功能基因，在此基礎上進一步開展含SSR位點的差異表達基因篩選及SSR引物的設計，可能獲得與目標性狀直接相關聯(lián)的定向標記[32]。自交不親和是果樹植物優(yōu)質高產的重要性狀之一，相關研究表明，藍莓自花授粉和異花授粉后花粉管在花柱中的生長有明顯差異，自花授粉的花粉管易出現(xiàn)在花柱中下部停止生長，表現(xiàn)出自交不親和的現(xiàn)象[22-23]。本研究基于“杰兔”自花授粉、異花授粉后第24、48和96 h的花柱，及未授粉花柱共10個轉錄組數(shù)據(jù)的KEGG和KOG功能富集分析顯示，659個具有SSR位點的差異表達基因被富集到112個代謝途徑中，其中58、16、3、2、1和27個含SSR 位點的差異表達基因分別與植物激素信號轉導、蛋白質泛素化、花粉管生長、核糖核酸酶T2家族、細胞程序化死亡以及細胞骨架等與植物自交不親和、花粉管信號轉導代謝途徑相關[33]。

綜上，本研究從高質量的藍莓轉錄組中獲得21 962個Unigene含有26 557個SSR位點，針對所有SSR位點，共設計17 212對引物，成功率78.37%。同時，篩選出107個與自交不親和及花粉管生長信號轉導等相關聯(lián)的SSR功能位點，這不僅豐富了藍莓的EST-SSR分子標記，而且為藍莓種質鑒定、親和性品種的分子標記輔助育種、自交不親和基因鑒定以及自交不親和的分子機制等研究提供了參考。

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（責編：李 媛）