常壓室溫等離子體誘變選育耐鹽產(chǎn)香酵母菌株

摘要：利用常壓室溫等離子體（ARTP）技術(shù)對(duì)魯氏酵母進(jìn)行誘變，確定40 s為誘變的最佳時(shí)間，此條件下菌株的致死率為98.9%。以耐鹽性為指標(biāo)對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行初步篩選，獲得一株耐鹽性較強(qiáng)的正突變菌株S3-26。將出發(fā)菌株及篩選菌株S3-26分別添加到18%鹽度的醬醪汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵后進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味成分對(duì)比分析。研究結(jié)果表明，出發(fā)菌株S組檢出59種風(fēng)味物質(zhì)，突變菌株S3-26組檢出63種，提高了6.78%。添加S3-26發(fā)酵的醬醪汁中醇類、醛類、酸類、酚類、酮類、呋喃類、吡嗪類和總風(fēng)味物質(zhì)含量均高于S組，其中醇類含量提高了28.50%，酚類含量提高了80.33%。OAV分析結(jié)果表明，S3-26組的典型風(fēng)味物質(zhì)含量高于S組，其中苯乙醛提高了45.91%，愈創(chuàng)木酚提高了47.59%，賦予了醬油花香和煙熏香，明顯增強(qiáng)了醬油的香氣品質(zhì)。此外，經(jīng)10次連續(xù)傳代測(cè)試，突變菌株S3-26具有良好的穩(wěn)定性，綜合結(jié)果表明選育菌株S3-26具有應(yīng)用于醬油發(fā)酵的潛力。

關(guān)鍵詞：魯氏酵母；常壓室溫等離子體誘變；耐鹽；發(fā)酵特性

中圖分類號(hào)：TS201.3""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）10-0039-04

Breeding of Salt-Tolerant and Aroma-Producing Zygosaccharomyces rouxii

Strains by Atmospheric and Room Temperature Plasma Mutagenesis

MO Fang-hua1， HE Jing2， XING Hao-ran1， TIAN Yu-tong1，

WANG Bing-hui1， WANG Chun-ling1*

（1.College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and Technology，

Tianjin 300457， China; 2.R ＆ D Center， COFCO-Oils Corporation， Beijing 100020， China）

Abstract： Zygosaccharomyces rouxii is mutagenized by atmospheric and room temperature plasma （ARTP） technology. It is determined that 40 s is the optimal mutagenesis time. Under such conditions， the fatality rate of the strain is 98.9%. With salt tolerance as the index， the mutagenized strains are preliminary screened， and a positive mutant strain S3-26 with strong salt tolerance is obtained. The original strain and selected strain S3-26 are added into the sauce mash medium with 18% salinity for cultivation. After fermentation， the comparative analysis of volatile flavor components is conducted. The results show that 59 flavor substances are detected in original strain S group and 63 flavor substances are detected in the mutant strain S3-26 group， increasing by 6.78%. The content of alcohols， aldehydes， acids， phenols， ketones， furans， pyrazines and total flavor substances in the fermented sauce mash added with S3-26 is higher than that of S group， among which， the content of alcohols increases by 28.50%， and the content of phenols increases by 80.33%. The results of OAV analysis show that the content of typical flavor substances in S3-26 group is higher than that in S group， with phenylacetaldehyde content increasing by 45.91% and guaiacol content increasing by 47.59%， giving soy sauce floral and smoky aroma， significantly enhancing the aroma quality of soy sauce. In addition， the mutant strain S3-26 shows good stability after 10 consecutive passage tests， and the comprehensive results show that the selected strain S3-26 has the potential to be applied in soy sauce fermentation.

Key words： Zygosaccharomyces rouxii; atmospheric and room temperature plasma mutagenesis; salt tolerance; fermentation characteristics

醬油是以蛋白質(zhì)（黃豆、脫脂大豆）、淀粉質(zhì)（炒小麥、面粉）為主要原料，在多種微生物的共同作用下將原料水解為氨基酸、游離酸等小分子物質(zhì)，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生化反應(yīng)，從而形成的一種香氣濃郁、味道鮮美、兼具一定保健功能的調(diào)味品[1-2]，是亞洲地區(qū)人們生活中廣泛使用的調(diào)味料，近年來(lái)因其特殊的風(fēng)味和顯著的提鮮作用而遠(yuǎn)銷世界各地[3-4]。

低鹽固態(tài)工藝和高鹽稀態(tài)工藝是目前國(guó)內(nèi)外常采用的醬油發(fā)酵工藝[5]，隨著人們對(duì)醬油品質(zhì)要求的逐漸提高，企業(yè)現(xiàn)大多采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝以生產(chǎn)品質(zhì)更優(yōu)的醬油。高鹽稀態(tài)工藝在發(fā)酵期間可以添加耐鹽酵母，酵母不僅可以加快醬油發(fā)酵的速度，而且能影響醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成，在醬油釀造中發(fā)揮著重要作用[6]。魯氏酵母是主要的耐鹽酵母之一，常被添加到醬油釀造過(guò)程中，是醬油釀造過(guò)程中主發(fā)酵期的增香酵母，能夠產(chǎn)生多種揮發(fā)性成分，主要包括醇類、糖醇類、呋喃酮類等，給醬油增添了醇厚的香氣[7]。因此，提升醬油風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵是選育發(fā)酵性能優(yōu)良的耐鹽酵母菌種[8]。

紫外誘變和化學(xué)誘變等傳統(tǒng)誘變手段是目前酵母誘變育種常采用的方法[9]。ARTP誘變育種技術(shù)是一種新型的誘變手段，相較于化學(xué)誘變和紫外誘變，具有突變性能優(yōu)越、操作便捷、樣品處理快速、安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，其技術(shù)相對(duì)成熟，在細(xì)菌、真菌等其他微生物的誘變育種中也得到廣泛應(yīng)用 [10-11]。

本研究將魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）作為出發(fā)菌株，采用 ARTP誘變手段對(duì)其進(jìn)行誘變處理，以耐鹽性為指標(biāo)對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行初步篩選，再通過(guò)突變菌株產(chǎn)香性能、遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)其發(fā)酵特性，以期為醬油釀造提供優(yōu)良菌株，從而提升醬油產(chǎn)品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：脫脂大豆、炒小麥；菌種：米曲霉滬釀3.042、魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；YPDN培養(yǎng)基：添加不同濃度的NaCl于YPD培養(yǎng)基中；NaCl：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；醬醪汁培養(yǎng)基：稱取豆粕120 g，炒小麥80 g，向豆粕中加入適量熱水浸泡30 min后拌入炒小麥，121 ℃滅菌20 min。滅菌后將其打散鋪平，降溫至30 ℃以下，接入成熟種曲0.6 g。于30 ℃培養(yǎng)箱中堆積培養(yǎng)，期間翻曲2次，在第一次翻曲后將大曲平鋪培養(yǎng)，42 h時(shí)大曲成熟。配制濃度為18%的鹽水，將成熟大曲與鹽水按1∶2.5的比例混勻，裝入發(fā)酵罐中，于30 ℃進(jìn)行發(fā)酵，每2～3 d攪拌一次，30 d后結(jié)束發(fā)酵。醬醪在8 000 r/min、4 ℃下離心10 min收集醬醪汁。

1.3 主要儀器與設(shè)備

ARTP常溫常壓等離子體誘變育種儀 北京思清源生物科技有限公司；BX51光學(xué)顯微鏡 日本SANYO公司；LDZX-75L高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；721型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （上海）舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；全溫?fù)u床 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LRH-250-A生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將魯氏酵母（S）作為出發(fā)菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，將其按2%的接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，得到活化菌株。

1.4.2 ARTP誘變條件的確定

用無(wú)菌生理鹽水洗滌經(jīng)離心的菌液，重復(fù)3次后重懸浮，并將其稀釋到菌液濃度為1.0×107個(gè)/mL [12]。在無(wú)菌金屬載片表面點(diǎn)涂10 μＬ上述菌液，隨即進(jìn)行誘變操作。ARTP誘變儀的工作氣體采用高純度（99.999%）氦氣（He），設(shè)置誘變儀參數(shù)，調(diào)節(jié)載片與工作氣體放射口之間的距離為2～3 mm、儀器功率為100 Ｗ、氣流量為10 L/min，等離子體射流的溫度低于30 ℃，在此操作條件下，ARTP的誘變劑量?jī)H與處理時(shí)間有關(guān)[13-14]。選擇不同時(shí)間進(jìn)行等離子體處理，將處理后的載片用無(wú)菌鑷子放置于棕色的EP管內(nèi)，吸取1 mL無(wú)菌生理鹽水加入其中，渦旋2 min，使菌體完全洗脫至管內(nèi)[15]。將上述洗脫的菌液避光靜置2 h后進(jìn)行稀釋處理，在YPD平板上涂布適量稀釋液，于30 ℃倒置培養(yǎng)直至菌落生長(zhǎng)。對(duì)照組是未經(jīng)ARTP處理的菌懸液。觀察菌株在平板上的生長(zhǎng)情況，計(jì)算菌落數(shù)與致死率。最后繪制致死曲線，橫坐標(biāo)為誘變時(shí)間，縱坐標(biāo)為其對(duì)應(yīng)的致死率 [16]。菌株致死率計(jì)算公式如下：

A（%）=（1－BC）×100%。

式中：A為菌株的致死率（%）；B為誘變處理后的平板所生長(zhǎng)的菌落數(shù)（個(gè)）；C為對(duì)照組的菌落數(shù)（個(gè)）。

1.4.3 耐鹽性突變菌株的篩選

在最佳誘變條件下對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，分別在含18%、20%、22% NaCl的YPDN平板上涂布100 μL誘變后的菌懸液，30 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，選出在含鹽平板上耐鹽性較高的菌落（即長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落）擴(kuò)大培養(yǎng)，并對(duì)菌株進(jìn)行保藏以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將出發(fā)菌株和擴(kuò)大培養(yǎng)的菌株活化后，測(cè)OD660 nm值，用YPD液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至1.0×107個(gè)/mL，再將其梯度稀釋至1.0×103個(gè)/mL，在含不同濃度NaCl的YPDN平板上分別滴2 μL不同稀釋度的菌液，在操作臺(tái)上晾干后，于30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

制備目的菌株種子液，取2%上述菌液接種至新的YPD液體培養(yǎng)基中，記為菌株傳代培養(yǎng)的第1代，之后每隔24 h進(jìn)行一次接種記為1次傳代，連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，并將第1，5，10代培養(yǎng)的菌株分別接種到18%鹽度的YPDN液體培養(yǎng)基中，接種量為106個(gè)/mL，于搖床中30 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定OD值及產(chǎn)特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量，以測(cè)試目的菌株的產(chǎn)香能力與其遺傳穩(wěn)定性。

1.4.5 突變菌株發(fā)酵特性

將魯氏酵母和目的菌株單菌落活化后，將菌液按接種量106個(gè)/mL分別接種到已離心過(guò)濾的含鹽量為18%的醬醪汁培養(yǎng)基中，在30 ℃ 150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，參考牛亞冰[17]的方法，采用SPME-GC-MS測(cè)定醬醪汁的揮發(fā)性香氣成分，在頂空瓶中加入6 mL醬醪汁，并加入1 g NaCl以及2 μL內(nèi)標(biāo)物。將頂空瓶水浴平衡20 min，條件設(shè)置為650 r/min、55 ℃。水浴結(jié)束后用萃取頭吸附30 min，將吸附結(jié)束的萃取頭推入儀器進(jìn)樣口，解吸25 min，按上述步驟重復(fù)測(cè)定其他樣品。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性定量分析：將檢測(cè)得到的質(zhì)譜圖與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比，鑒定樣品中的風(fēng)味物質(zhì)，確定醬油的香氣成分，并用面積歸一化法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線的測(cè)定

研究證明，為獲得最佳正向突變體，誘變致死率要超過(guò)95%，此時(shí)可獲得最高的正向突變率[18-19]，而且高致死率利于縮小突變文庫(kù)，有助于高效篩選。

由圖1可知，魯氏酵母（S）的誘變致死率隨著誘變時(shí)間的增加而上升，當(dāng)誘變時(shí)間為40 s時(shí)，S酵母的致死率達(dá)到98.9%；而當(dāng)誘變時(shí)間超過(guò)40 s時(shí)，致死率接近100%。故在其他參數(shù)固定的條件下，本實(shí)驗(yàn)的最佳誘變時(shí)間為40 s。

2.2 耐鹽性突變菌株的篩選

在最佳誘變條件下對(duì)魯氏酵母進(jìn)行誘變，在不同鹽度的YPDN培養(yǎng)基上涂布0.1 mL誘變后的菌懸液，選出耐鹽度較高的3個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，分別命名為S3-4、S3-9、S3-26。不同鹽濃度下各菌株的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖2。

由圖2可知，低濃度NaCl（0%～12%）脅迫對(duì)菌株正常生理功能的影響較小，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相近。當(dāng)NaCl濃度增加到18%時(shí)，其對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用明顯增強(qiáng)，菌株正常生長(zhǎng)繁殖能力明顯下降。但S3-26在18%和20%鹽度下生長(zhǎng)狀況較其他菌株好，其耐鹽性有一定程度增強(qiáng)，因此，S3-26是本實(shí)驗(yàn)篩選得到的目的菌株，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株應(yīng)具有較穩(wěn)定的遺傳特性，而酵母存在自我修復(fù)機(jī)制，因此需要對(duì)目的菌株S3-26進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。

由圖3可知，S3-26在進(jìn)行第1，5，10次傳代后的生物量與其所產(chǎn)的醇類含量略有波動(dòng)，但基于單因素方差分析結(jié)果可知，各代之間的生物量和產(chǎn)醇類物質(zhì)含量無(wú)顯著性差異（Pgt;0.05）。此結(jié)果驗(yàn)證了篩選得到的S3-26菌株具有良好的穩(wěn)定性，且具有較高的耐鹽性和產(chǎn)香性。

2.4 突變菌株發(fā)酵特性

醬油中的揮發(fā)性物質(zhì)為其帶來(lái)獨(dú)特的香味，這些揮發(fā)性物質(zhì)種類豐富，是衡量醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)。已知的醬油中的8類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)超過(guò)1 000種，包括醇類、酯類、酸類、醛類、酮類、酚類、呋喃類、吡嗪類。

分別添加出發(fā)菌株S和突變菌株S3-26發(fā)酵得到的醬醪汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，醬醪汁中共檢出66種風(fēng)味物質(zhì)，S組檢出59種風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類10種、酯類7種、醛類12種、酸類6種、酚類3種、酮類7種、呋喃類3種、吡嗪類11種；S3-26組檢出63種、包括12種醇類、8種酯類、12種醛類、7種酸類、4種酚類、7種酮類、2種呋喃類、11種吡嗪類。由此可知，添加S3-26發(fā)酵的醬醪汁在風(fēng)味物質(zhì)的種類上較S組提高了6.78%。魯氏酵母是一種典型醇香酵母，在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)生成一些特征的高級(jí)醇及芳香雜醇，主要有苯乙醇、異戊醇、異丁醇等，S3-26組醇類物質(zhì)種類比S組提高了20.00%。

醬醪汁中各風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量見(jiàn)圖5。

由圖5可知，醇類、酸類含量在兩組發(fā)酵的醬醪汁中占比最高，酯類次之，與添加S菌株發(fā)酵的醬醪汁相比，添加S3-26菌株發(fā)酵的醬醪汁總揮發(fā)性物質(zhì)含量提高了26.39%，并且醬醪汁中除了酯類外，其他7類揮發(fā)性物質(zhì)含量均有所提高，魯氏酵母作為醬油釀造過(guò)程中醇香型酵母，主要形成醇類化合物，含量提高了28.50%，同時(shí)，醛類提高了17.62%，酸類提高了26.84%，酚類提高了80.33%，酮類提高了22.29%，呋喃類提高了7.77%，吡嗪類提高了39.61%。

不僅風(fēng)味物質(zhì)含量可說(shuō)明對(duì)醬油總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，而且有研究表明其氣味閾值也具有一定的決定作用 [20]，化合物的OAV＞1表明該物質(zhì)的相對(duì)含量高于閾值，被認(rèn)為對(duì)醬油整體香氣的呈現(xiàn)具有貢獻(xiàn)作用，并且某種化合物的OAV越大說(shuō)明其對(duì)整體香氣的作用越明顯[21]，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，在添加S和S3-26發(fā)酵的醬醪汁中共發(fā)現(xiàn)6種OAVgt;1的典型風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類2種、醛類3種、酚類1種。相比于S組，S3-26組的典型風(fēng)味物質(zhì)含量提高了34.29%，除1-辛烯-3-醇外，S3-26組其他典型風(fēng)味物質(zhì)組分的含量均高于S組，其中苯乙醇提高了36.06%，2-甲基丁醛提高了1.64%，3-甲硫基丙醛提高了34.77%，苯乙醛提高了45.91%，愈創(chuàng)木酚提高了47.59%，為醬油增添了花香、煙熏香等香氣。結(jié)合以上耐鹽性篩選以及產(chǎn)香能力測(cè)定與典型風(fēng)味物質(zhì)分析的結(jié)果可知，S3-26是可以提升醬油風(fēng)味品質(zhì)的目的菌株。

3 結(jié)論

醬油釀造的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是篩選和培育優(yōu)質(zhì)的酵母菌株，為提升醬油香氣品質(zhì)，本研究進(jìn)行了耐鹽產(chǎn)香醬油酵母的選育。以魯氏酵母為出發(fā)菌株，經(jīng)ARTP誘變及篩選得到一株優(yōu)良菌株S3-26。對(duì)分別添加出發(fā)菌株和突變菌株的醬醪汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定及分析，結(jié)果表明，添加S3-26發(fā)酵的醬醪汁在風(fēng)味物質(zhì)的種類上比添加S的醬醪汁提高了6.78%。S3-26組總風(fēng)味物質(zhì)含量及醇類、醛類、酸類、酚類、酮類、呋喃類、吡嗪類含量均高于S組，其中醇類物質(zhì)含量提高了28.50%。結(jié)合OAV分析，明確了魯氏酵母影響醬醪汁風(fēng)味的6種典型揮發(fā)性化合物，其中S3-26組有5種典型揮發(fā)性化合物含量高于S組，這些化合物賦予了醬油花香及煙熏香等香氣，從而提升了醬油的香氣品質(zhì)。同時(shí)，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代測(cè)試，S3-26菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。本文的研究結(jié)果是在醬醪汁模擬發(fā)酵條件下得到的，由于醬醪汁發(fā)酵與真實(shí)醬醪發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)、溶氧等條件不同，還需通過(guò)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，從而對(duì)突變菌株的發(fā)酵特性進(jìn)一步分析，為大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

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收稿日期：2024-03-28

基金項(xiàng)目：天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20ZYJDJC00050）

作者簡(jiǎn)介：莫芳華（1998—），女，碩士，研究方向：公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)。

*通信作者：王春玲（1977—），女，教授，博士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。