相生和相克間作作物對(duì)豌豆根際微生物群落的影響

關(guān)鍵詞： 豌豆；香蔥；番茄；相生相克；微生物；間作

豌豆（Pisum sativum L.） 是世界第三大豆類作物，為豆科豌豆屬一年生攀援草本植物，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有抗菌、抗氧化、抗癌、降血壓、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等生理活性[1?2]。豌豆原產(chǎn)于亞洲西部和地中海沿岸地區(qū)，種植史至少要追溯到6000年以前[3]。豌豆工業(yè)化生產(chǎn)主要集中在淀粉與蛋白質(zhì)加工[4?5]，市場(chǎng)對(duì)豌豆產(chǎn)量、品質(zhì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的要求也越來越高。間作是在同一土地上同時(shí)種植兩種或多種作物[6]，對(duì)維持和提高土壤質(zhì)量十分重要[7]，具有提高土壤肥力和資源利用率[8]、增加產(chǎn)量[9?10]、減少病蟲害和雜草密度[11?12]、提高根際微生物多樣性等作用[13]。間作不僅有助于提高豌豆產(chǎn)量、品質(zhì)和降低生產(chǎn)成本，而且有助于提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，作物之間的相互影響不是既定的，有“相生”作用也有“相克”作用[14]?！跋嗌笔侵搁g作作物之間產(chǎn)生相互有益的作用，如減少病蟲害等；“相克”是指作物之間產(chǎn)生相互有害的作用，作物生長(zhǎng)受到抑制、病害發(fā)生加重等[15?17]。研究發(fā)現(xiàn)，豆科和茄科作物間作可以相互促進(jìn)生長(zhǎng)[18?20]，主要是由茄科作物根系分泌物（抗菌酚類物質(zhì)） 直接抑制或間接改變根際微生物組的組成來控制病原體，富集有益微生物[21?23]； 豆科和蔥屬作物則會(huì)相互抑制[24?26]，主要是因?yàn)槭[屬作物分泌物中化感物質(zhì)顯著抑制豆科種子萌發(fā)生長(zhǎng)，并對(duì)土壤中真菌和細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用[27?28]。

植物相生相克也叫化感作用，是指植物通過釋放化學(xué)物質(zhì)到環(huán)境中，進(jìn)而影響自身或其他有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，它是植物長(zhǎng)期進(jìn)化中為適應(yīng)自然競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生的一種機(jī)制[29]，而產(chǎn)生化感作用的化學(xué)物質(zhì)被稱為化感物質(zhì)[30]?；形镔|(zhì)影響植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程，包括光合與呼吸作用、水分與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝等生理生化過程[16]。土壤微生物在化感物質(zhì)的遷移轉(zhuǎn)化過程中起著至關(guān)重要的作用，其群落組成和結(jié)構(gòu)也受化感物質(zhì)影響[31]。研究表明，從樟屬植物的葉片、樹枝中提取的樟腦、芳樟醇、桉葉油素和萜類化合物等對(duì)農(nóng)作物、雜草或微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的化感作用[32]。鐮孢菌（Fusarium） 是引起百合枯萎病發(fā)生的典型病原真菌，而烏頭酸對(duì)尖鐮孢菌（F.oxysporum Schltdl.） 存在低促高抑的化感抑制效應(yīng)[33]。目前關(guān)于植物化感作用的研究較多，但基于相生相克化感作用對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響仍鮮見報(bào)道?？状谷A等[15]的植物化感作用研究中，提出植物主要通過根系分泌物和凋落物兩種途徑，改變土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分狀態(tài)和微生物群落結(jié)構(gòu)，從而造成土壤正或負(fù)的反饋?zhàn)饔?。但是微生物群落結(jié)構(gòu)的變化誘導(dǎo)植物發(fā)生化感現(xiàn)象的作用機(jī)制尚未清晰。為此，探究不同間作體系中豌豆發(fā)生相生相克現(xiàn)象的微生物學(xué)機(jī)制，為開發(fā)利用有益微生物、構(gòu)建豌豆生態(tài)種植模式提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

主栽豌豆品種為‘奇珍76 豌豆’，香蔥品種為‘上海四季小蔥819’，番茄品種為‘芳萱麗粉’番茄，均采購(gòu)于廣西壯族自治區(qū)南寧市蔬菜種子市場(chǎng)。

試驗(yàn)于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜基地（108°17′25″E，22°51′02″N） 進(jìn)行。試驗(yàn)地耕層土壤理化性質(zhì)如下：pH 5.68，有機(jī)質(zhì)8.92 g/kg，全氮0.55 g/kg，全磷0.67 g/kg，全鉀7.51 g/kg，堿解氮15.27 mg/kg，速效磷0.67 mg/kg，速效鉀82.8 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，1） PP：碗豆單作；2） PT：豌豆/番茄間作（相生）；3） PA：豌豆/香蔥間作（相克）；4） CK：不種植作物，每個(gè)處理重復(fù)5 次。盆的直徑、高度分別為60 cm、45 cm，裝土20 kg。間作處理為每種作物各2 株，4 株作物呈正方形， 在對(duì)角線方向栽培同種作物， 植株間距20 cm，植株與盆邊緣距離20 cm （圖1）；其中， 單作處理僅種植豌豆。豌豆水肥管理以及除草、病蟲害防治等各項(xiàng)管理措施均按照常規(guī)方法管理[34]。施用磷肥時(shí)混施農(nóng)家有機(jī)肥，生長(zhǎng)初期追施氮肥。開花期防止水分過多造成徒長(zhǎng)或過于干旱造成落花落莢。齊苗后淺松土1 次，1 周后再次中耕。豌豆株高30 cm 左右時(shí)支架。

1.3樣品采集與處理

作物定植50天后，選取不同處理?xiàng)l件下的優(yōu)良植株進(jìn)行采樣。采用抖根法[35]采集附著在植株根系上的土壤。具體操作如下：首先，使用75% 乙醇對(duì)工具消毒，使用鐵鍬松動(dòng)植株周圍土壤，緊握植株基部緩慢拔出植株根系，輕抖植株去除非根際土壤，然后采集根際土壤樣品裝入無菌袋帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm 篩備用。

1.4 微生物測(cè)序

土壤細(xì)菌高通量測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。按照FastDNA? Spin Kit for Soil 試劑盒（MP Biomedicals，U.S.） 說明書提取總DNA，使用NanoDrop2000 分光光度計(jì)（Thermo FisherScientific，U.S.） 檢測(cè)DNA 濃度和純度。在ABIGeneAmp?9700 上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， UnionCity，CA，USA） 進(jìn)行純化，混合后使用2% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)及回收，并利用Quantus?Fluorometer （Promega，USA） 對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫(kù)，利用Illumina 公司MiseqPE250 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序并且進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。

1.5 土壤微生物生物量分析

土壤樣品經(jīng)氯仿熏蒸浸提后，分別用容量分析法、茚三酮比色法、鉬藍(lán)比色法測(cè)定土壤微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）、磷（MBP）[36]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019 和IBM SPSS Statis-tics21 統(tǒng)計(jì)分析，利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger 云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物生物量

由表1可知，4個(gè)處理的MBC 和MBN 含量均無顯著差異，相生間作豌豆（PT） 根際土壤MBP 顯著高于相克間作（PA） 和碗豆單作（PP），PA 與PP 之間的MBP 含量差異不顯著。由此可知，相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系根際土壤中較高的微生物生物量磷，有助于保障土壤磷的供應(yīng)。

2.2 土壤細(xì)菌多樣性

由表2可知，97%水平下進(jìn)行聚類分析，共檢出45 門、146 綱、360 目、589 科、1114 屬、2221種、5619 個(gè)OTU，相生或相克間作體系不同程度地提高了豌豆根際土壤細(xì)菌門分類水平以外的各級(jí)分類水平數(shù)量。

由圖2可知，相生、相克、單作和空白土壤（CK）4個(gè)處理共有的細(xì)菌OTU數(shù)量為2787個(gè)，特有的細(xì)菌OTU 數(shù)量分別為234、226、181、289個(gè)；表明間作其它作物誘導(dǎo)豌豆根際土壤富集了更為多樣的細(xì)菌。

由表3可知，覆蓋率達(dá)到96% 以上，表明測(cè)序結(jié)果能夠客觀反映出土壤細(xì)菌群落多樣性。與相克（豌豆/香蔥，PA） 組合相比，相生（豌豆/番茄，PT）組合豌豆根際土壤細(xì)菌多樣性和豐富度均顯著降低。

由圖3可知，間作相生或相克作物，豌豆根際土壤細(xì)菌群落分別分布在不同象限中，組間相對(duì)距離較大，無交集；這表明間作誘導(dǎo)豌豆植株根際土壤細(xì)菌群落組成發(fā)生顯著變化（r=0.7747，P=0.0010）。

屬水平，相生間作體系（PT） 豌豆植株根際土壤中，檢測(cè)出14個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度占比gt;1%），相克（PA） 間作體系、單作（PP） 體系、空白（CK） 土壤分別檢出19、16、20 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（圖4）。相克（豌豆/香蔥，PA） 和豌豆單作（PP） 體系豌豆根際土壤的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬類糖單孢菌屬（Saccharomonospora）、交替紅桿菌屬 （ Alterery throbacter ）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、unclassified_f_Sphingomonadaceae、norank_f_Roseiflexaceae 屬等，在相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系豌豆植株根際土壤中缺失。

2.3 土壤真菌多樣性

由表4 可知，97% 水平下對(duì)豌豆植株根際土壤樣品序列進(jìn)行聚類分析，共檢測(cè)出15 門、44 綱、105 目、222 科、426 屬、686 種、1699 OTUs。與豌豆單作相比，相生或相克組合間作均提高了豌豆植株根際土壤真菌各分類水平的數(shù)量。

由圖5 可知，相生（PT）、相克（PA）、單作（PP）豌豆根際土壤和空白土壤（CK） 共有的真菌OTU 數(shù)量為422，特有的土壤真菌OTU 數(shù)目分別為155、163、110、244 個(gè)。

由表5 可知，測(cè)序覆蓋率達(dá)99% 以上，這表明測(cè)序結(jié)果能夠客觀反映土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性及豐富度。相生（豌豆/番茄，PT） 和相克（豌豆/香蔥，PA） 組合之間豌豆植株根際土壤中，表征土壤真菌多樣性的Shannon 和Simpson 指數(shù)，以及表征豐富度的Ace 和Chao 1 指數(shù)均無顯著差異，表明無論豌豆間作相生抑或相克作物，均未導(dǎo)致豌豆植株根際土壤真菌多樣性和豐富度發(fā)生顯著變化。

OTU 分類水平上，相生和相克間作體系中，豌豆根際土壤真菌組間相對(duì)距離較小，有交集，但與豌豆單作（PP） 組間相對(duì)距離較大，無交集（圖6）。這表明，間作顯著改變了豌豆根際土壤中真菌群落組成（r=0.6667，P=0.0010），且顯著程度受間作的作物種類影響。

在屬水平，相生（PT）、相克（PA）、單作（PP） 豌豆根際土壤以及空白（CK） 土壤中監(jiān)測(cè)到的優(yōu)勢(shì)真菌屬數(shù)量（相對(duì)豐度gt;1%） 分別為20、17、14和18 個(gè)（圖7）。由圖7 可知，小脆柄菇屬（Psathyrella） 和油壺菌屬（Olpidium） 真菌是PT 組合間作體系中特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬，而Albifimbria 屬和鐮刀菌屬（Fusarium）真菌是PA 間作體系中的優(yōu)勢(shì)真菌屬。

3 討論

土壤微生物對(duì)化感物質(zhì)的轉(zhuǎn)化發(fā)揮著決定性的作用，土壤微生物不僅能夠降解化感物質(zhì)，對(duì)釋放土壤吸附滯留的化感物質(zhì)亦發(fā)揮重要影響[14]。本研究結(jié)果顯示，豌豆間作相生作物（番茄）、間作相克作物（香蔥） 豌豆植株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。本研究與黃子粵[37]研究發(fā)現(xiàn)的合理間作能夠改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，減少病原微生物數(shù)量，增加有益微生物數(shù)量的結(jié)果類似。此外，Singh 等[38]研究表明，土壤微生物生物量是土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍的組分，其流動(dòng)周轉(zhuǎn)效率高，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和供應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，同樣也是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)。其中，土壤微生物生物量碳作為土壤中重要的碳源，體現(xiàn)微生物利用土壤碳源的能力[39]。

土壤微生物生物量氮是土壤中最活躍的組分，能夠反映土壤供氮能力[40]；土壤微生物生物量磷是土壤中磷素養(yǎng)分轉(zhuǎn)換和循環(huán)的重要參數(shù)[41]。土壤微生物生物量越多，土壤供給植物有效養(yǎng)分的能力就越強(qiáng)[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，相生（豌豆/番茄，PT） 組合間作體系中，土壤微生物生物量磷顯著高于其它間作組合，表明相生（豌豆/番茄） 組合間作具有提高土壤磷供給能力的作用。

另一方面，謝慶玲等[43]研究表明，豌豆和青稞可能對(duì)青刺尖油枯中揮發(fā)性物質(zhì)的化感反應(yīng)機(jī)制有差異，并在生長(zhǎng)過程中表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，這與本研究中相克作物（豌豆/香蔥） 間作產(chǎn)生相克現(xiàn)象類似。Kaur 等[44]研究亦表明，化感作用是植物化感物質(zhì)與其根際土壤微生物綜合作用的結(jié)果。尤其根際環(huán)境中，根系分泌物對(duì)某些微生物具有富集效應(yīng)，具有趨化性的細(xì)菌或真菌能夠在根際中大量聚集和繁殖。本研究中，糖單孢菌屬（Saccharomonospora）和硫桿菌屬（Thiobacillus） 細(xì)菌是豌豆相克（豌豆/香蔥，PA） 間作體系中，豌豆植株根際土壤中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。由于糖單孢菌屬（Saccharomonospora）細(xì)菌能夠分泌生物堿類、大環(huán)內(nèi)酯類、肽類、角環(huán)素等多種化感物質(zhì)[45]，其中可能存在抑制豌豆生長(zhǎng)的物質(zhì)；而硫桿菌屬（Thiobacillus） 細(xì)菌則是一種土壤中常見的無色硫細(xì)菌，無氧條件下會(huì)產(chǎn)生傷害植物根部的化學(xué)物質(zhì)[46]。由此推測(cè)，豌豆相克間作體系中，糖單孢菌屬和硫桿菌屬細(xì)菌的大量富集可能是導(dǎo)致作物相克的重要機(jī)制之一。

Lakshmanan 等[47]研究還發(fā)現(xiàn)，番茄葉片受到病原菌侵染后，可通過調(diào)節(jié)根系分泌物組分與含量，如增加根系蘋果酸分泌釋放量，使更多的蘋果酸進(jìn)入根際，從而招募更多的有益菌向根際聚集。本研究發(fā)現(xiàn)，與相克作物（豌豆/香蔥） 間作體系相比，油壺菌屬（Olpidiom） 真菌是相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系豌豆植株根際土壤中特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬；而鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌是相克作物（豌豆/香蔥） 間作體系中豌豆植株根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。研究已證實(shí)，油壺菌屬真菌相對(duì)豐度與速效磷含量呈正相關(guān)[48]；而鐮刀菌屬真菌是引起植物根腐病的主要病源菌，其能夠分泌毒素[49?50]。本研究發(fā)現(xiàn)，豌豆相生（豌豆/番茄，PT） 間作降低了鐮刀菌屬等有害真菌的豐度占比；與之相比，豌豆相克（豌豆/香蔥，PA） 間作則提高了鐮刀菌屬真菌等有害真菌的豐度占比，這一現(xiàn)象可能是豌豆間作不同作物產(chǎn)生相生相克現(xiàn)象的重要機(jī)制之一。

本研究闡明了豌豆間作相生和相克作物對(duì)豌豆植株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，可為今后人為組裝作物根際有益微生物群落提供參考，為提高作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

與間作相克作物（香蔥） 相比，間作相生作物（番茄） 豌豆根際土壤細(xì)菌和真菌的多樣性與豐富度沒有顯著變化，但土壤細(xì)菌和真菌群落組成發(fā)生了顯著變化。相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系下，豌豆根際土壤富集油壺菌屬（Olpidiom） 真菌，且鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌豐度占比下降；而相克（豌豆/香蔥，PA）間作體系下豌豆根際土壤富集了具有分泌抑制豌豆生長(zhǎng)化感物質(zhì)潛力的糖單孢菌屬（Saccharomonospora）和硫桿菌屬（Thiobacillus） 細(xì)菌，以及作為病原微生物的鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌。與相生作物（番茄） 間作，有助于豌豆根際富集具有促生功能的有益微生物種屬，與相克作物（香蔥） 間作則趨向于富集病原微生物。