接種根瘤菌對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根部轉(zhuǎn)錄水平的影響

摘要：為探究‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’（Trifolium ambiguum Bieb. ‘Mengnong No.1’）與根瘤菌共生過(guò)程中相關(guān)基因的分子機(jī)制及代謝通路，本研究選取了接種根瘤菌的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’以及未接種的對(duì)照組為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較了共生與非共生狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組差異。結(jié)果表明，與未接種組相比，接種組共篩選出1105個(gè)差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些DEGs涉及多個(gè)代謝通路和生物學(xué)過(guò)程，包括苯丙烷生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等。其中，677個(gè)基因上調(diào)，428個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)部分基因進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的可靠性。本研究揭示了‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’在根瘤菌共生狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組特征，為深入理解植物與根瘤菌共生機(jī)制提供了重要參考。

關(guān)鍵詞：‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’；接種根瘤菌；差異表達(dá)基因；轉(zhuǎn)錄組學(xué)

中圖分類號(hào)：S541.2""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）09-2759-10

收稿日期：2023-12-21；修回日期：2024-03-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31960353）資助

作者簡(jiǎn)介：

曹克璠（1998-），男，滿族，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，博士研究生，主要從事牧草種質(zhì)資源研究，E-mail：caokefan1003@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：wangmj_0540@163.com

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.09.009

引用格式：

曹克璠， 索榮臻， 張慧敏，等.接種根瘤菌對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根部轉(zhuǎn)錄水平的影響［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（9）：2759-2768

CAO Ke-fan， SUO Rong-zhen， ZHANG Hui-min，et al.The Impact of Rhizobium Inoculation on the Root Transcriptome of ‘Mengnong Clover No.1’［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（9）：2759-2768

The Impact of Rhizobium Inoculation on the Root Transcriptome of

‘Mengnong Clover No.1’

CAO Ke-fan1， SUO Rong-zhen1， ZHANG Hui-min1， MA Yi-ming1，

WU Qian1， BAO Li-gao2， WANG Ming-jiu1*

（1. College of Grassland and Resources and Environment/Key Laboratory of Grassland Resources of Ministry of Education，

Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018， China； 2. Inner Mongolia Agricultural and Animal

Husbandry Technology Extension Center， Hohhot， Inner Mongolia 010030， China）

Abstract：To explore the molecular mechanisms and metabolic pathways of genes related to the symbiotic relationship between ‘Mengnong Clover No.1’ （T. ambiguum Bieb. ‘Mengnong No.1’） and rhizobia，this study selected ‘Mengnong Clover No.1’ inoculated with rhizobia and an uninoculated control group as research subjects. Through transcriptomic sequencing，we compared the transcriptome differences between symbiotic and non-symbiotic states. The results showed that，compared with the uninoculated group，a total of 1105 differentially expressed genes （DEGs） were identified with significant changes of expression levels in all symbiotic samples. Among them，677 genes were upregulated and 428 genes were downregulated. The reliability of the transcriptomic sequencing was confirmed by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） for some of these genes. Further analysis revealed that these DEGs were involved in multiple metabolic pathways and biological processes，including biosynthesis of phenylpropanoids，metabolism of amino sugars and nucleotide sugars，as well as cysteine and methionine metabolism. This study reveals the transcriptomic characteristics of ‘Mengnong Clover No.1’ under symbiotic conditions with rhizobia，and provides important references for a deeper understanding of the symbiotic mechanisms between plants and rhizobia.

Key words：‘Mengnong Clover No. 1’;Rhizobium inoculation;Differentially expressed genes （DEGs）;Transcriptomics

在全球人口持續(xù)增長(zhǎng)的背景下，對(duì)高效且可持續(xù)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的需求變得尤為迫切［1］。特別是在維持土壤肥力和健康方面，土壤中的氮素作為促進(jìn)作物生長(zhǎng)的關(guān)鍵養(yǎng)分，其高效利用成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)［2］。在這種情況下，自然界中的生物固氮（Biological nitrogen fixation，BNF）過(guò)程提供了一個(gè)可持續(xù)的氮素獲取途徑［3］。特別是豆科植物與根瘤菌（Rhizobium）之間的共生關(guān)系，即共生固氮（Symbiotic nitrogen fixation，SNF），能夠?qū)⒋髿庵械牡獨(dú)廪D(zhuǎn)化為植物可直接利用的形式［4］，從而為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了一種不依賴化學(xué)肥料的氮源［5］。

高加索三葉草（Trifolium ambiguum M.Bieb.），也稱為小球三葉草或庫(kù)拉三葉草［6-7］。與其它豆科植物相比，高加索三葉草擁有更發(fā)達(dá)的主根和地下分蘗系統(tǒng)［8］，使其顯示出顯著的耐旱和耐寒能力，同時(shí)具備較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其是其較高的粗蛋白含量［9］。然而，種植高加索三葉草面臨的挑戰(zhàn)包括較低的種子產(chǎn)量和幼苗生長(zhǎng)的緩慢，特別是在非原產(chǎn)地區(qū)，高加索三葉草往往難以與固氮菌形成有效的共生關(guān)系［10］。2012年，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)培育出了‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’，作為中國(guó)首個(gè)自主培育的高加索三葉草品種，其展現(xiàn)了良好的抗旱、耐寒和耐澇性能［11］。‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’在內(nèi)蒙古地區(qū)表現(xiàn)出了結(jié)瘤固氮的能力，為探究其固氮能力的潛在變化，研究團(tuán)隊(duì)將‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’同樣移栽至青海省西寧市及青藏高原的高海拔地區(qū)。在這些新環(huán)境中，‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’顯示出了自發(fā)結(jié)瘤固氮的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步探究這種現(xiàn)象的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)從青海地區(qū)的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’中收集根瘤菌，進(jìn)行后續(xù)研究。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（High-throughput RNA sequencing，RNA-Seq）技術(shù)在探索根瘤菌與植物共生過(guò)程中差異基因的表達(dá)上發(fā)揮了關(guān)鍵作用。例如Yuan等人對(duì)大豆接種了兩個(gè)不同屬的根瘤菌（日本慢生根瘤菌和費(fèi)氏中華根瘤菌）后，大豆出現(xiàn)了較為明顯的轉(zhuǎn)錄水平的反應(yīng)［12］?？紤]到共生過(guò)程的復(fù)雜性，結(jié)瘤過(guò)程中的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯得尤為重要。Niyikiza等分析根瘤菌侵染12，22和36天的根瘤，鑒定出9669個(gè)差異表達(dá)基因，并發(fā)現(xiàn)根瘤菌通過(guò)調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成通路從而影響共生關(guān)系［13］。針對(duì)大豆根部，Hayashi等利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了野生根瘤菌和nodc-突變菌株侵染2天的大豆根部侵染區(qū)，鑒定出2915個(gè)受根瘤菌侵染調(diào)控的基因，其中包含一系列與赤霉素生物合成相關(guān)的基因［14］。Barros de Carvalho等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析了根瘤菌侵染10天的大豆根部材料，鑒定出3210個(gè)受根瘤菌侵染顯著調(diào)控的基因，通過(guò)富集分析，發(fā)現(xiàn)受調(diào)控的基因主要參與了代謝過(guò)程以及刺激反應(yīng)調(diào)控［15］。

本研究集中于探討‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’與根瘤菌共生關(guān)系的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，并對(duì)接種根瘤菌的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’和未接種根瘤菌的對(duì)照組進(jìn)行了細(xì)致的轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較分析，以揭示在共生固氮過(guò)程中發(fā)生的分子層面的變化。本研究旨在深入理解根瘤菌如何影響植物的基因表達(dá)，以及這種共生關(guān)系如何促進(jìn)植物在缺氮環(huán)境下的適應(yīng)和生長(zhǎng)。該研究加深了對(duì)植物與微生物間相互作用的認(rèn)識(shí)，并為發(fā)展更可持續(xù)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方法提供了關(guān)鍵的科學(xué)支持。

1" 材料與方法

1.1" 植物材料及處理

材料為2012年由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)培育而成的內(nèi)蒙古牧草新品種‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’（登記號(hào)：N010）。本試驗(yàn)的供試菌株是在前期試驗(yàn)中分離并鑒定出的一種根瘤菌菌株［9］。試驗(yàn)于2021年4月在內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室中進(jìn)行。選取籽粒飽滿的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’種子數(shù)粒，進(jìn)行表面消毒。將消毒后的種子置于鋪有濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，26℃避光培養(yǎng)3～4 d。將發(fā)芽后的種子根部移栽至裝滿蛭石（已滅菌）的10 cm×10 cm的黑色營(yíng)養(yǎng)缽中，置于28℃，16/8小時(shí)光照/黑暗循環(huán)、相對(duì)濕度70%的可控環(huán)境室中。每缽移栽3株，澆等量的Hoagland無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液（NS1010-N-50L），培養(yǎng)1 d。在無(wú)菌條件下用移液槍將根瘤菌菌懸液加入幼苗根部，每盆1 mL，并以未接種根瘤菌的幼苗為對(duì)照組。每盆每天定時(shí)補(bǔ)充10 mL營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)3 d后進(jìn)行根部取樣，并保存在—80℃冰箱備用。

1.2" ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’RNA提取及文庫(kù)的制備

采用Trizol法提取總RNA［16-17］，并用Nanodrop GX方法，RNAse-free H2O檢測(cè)RNA樣本的純度和濃度，以確保使用合格的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。RNA樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，以短片段mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（Random Hexamers）合成第一條cDNA鏈，再利用緩沖液、dNTPs，RNase H和DNA Polymerase I合成第二條cDNA鏈，通過(guò)AMPure XP beads純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)，cDNA文庫(kù)制備完成。使用Agilent 2100生物分析儀驗(yàn)證后，使用Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3" 轉(zhuǎn)錄組De novo組裝和功能注釋

為了保證信息分析質(zhì)量，對(duì)得到的原始序列數(shù)據(jù)（Raw reads）進(jìn)行過(guò)濾，去除里面含有帶接頭的（Adapter）、N比例大于10%以及低質(zhì)量的reads，得到過(guò)濾后序列數(shù)據(jù)（Clean reads）［18］。使用SOAPdenovo進(jìn)行拼接得到contig，組裝后得到unigene，將unigene序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG和GO做blast比對(duì)，結(jié)果被用于進(jìn)一步確定unigene的序列方向。如果不同數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果存在沖突，則按照NR，Swiss-Prot，Pfam，EggNOG，GO，KEGG優(yōu)先順序確定序列方向。與上述數(shù)據(jù)庫(kù)都比對(duì)不上的unigene，使用ESTScan軟件預(yù)測(cè)其編碼區(qū)域并確定其序列方向。利用Blasta2 go（http：//www.geneontology.org）獲得unigene的GO注釋，將unigene比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，最后進(jìn)行Pathway分析［19］。

1.4" 差異表達(dá)基因分析

采用DESeq2［20］進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，獲得兩個(gè)條件之間的差異表達(dá)基因集。在差異表達(dá)分析過(guò)程中采用了公認(rèn)有效的Benjamini-Hochberg方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性P值進(jìn)行校正，并最終采用校正后的P值，即假發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate，F(xiàn)DR）作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。利用GO和KEGG Pathway分析篩選出的基因，得到兩組樣本間差異表達(dá)基因的GO功能分類注釋、顯著性富集分析以及Pathway富集分析。

1.5" qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證差異表達(dá)基因的結(jié)果，隨機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)基因，通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行測(cè)量。利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。根據(jù)TB Green Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒（Takara公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為T(mén)B Green Premix Ex Taq TM Ⅱ 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free H2O 7 μL。使用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，所有基因的表達(dá)分析均設(shè)置了3次生物學(xué)重復(fù)［21］。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 短片段測(cè)序和組裝

本研究運(yùn)用IlluminaHiSeqTM2000平臺(tái)對(duì)接種根瘤菌組與對(duì)照組的6個(gè)樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，旨在深入探究植物根系在與根瘤菌互作過(guò)程中的基因表達(dá)變化。對(duì)于接種根瘤菌組，原始序列數(shù)據(jù)數(shù)量分別為43 469 000，42 533 232和42 563 226條。經(jīng)過(guò)去除低質(zhì)量的reads、帶接頭的reads以及重復(fù)冗余序列處理后，得到Clean reads數(shù)量分別為43 196 038，42 231 532和42 214 868條。對(duì)照組的Raw reads數(shù)量為42 821 958，42 543 248和42 467 922條，經(jīng)過(guò)相同處理步驟，得到Clean reads數(shù)量分別為42 459 818，42 038 840和42 020 092條。在對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)估中，結(jié)果表明，在接種根瘤菌組和對(duì)照組中，Q20（序列質(zhì)量得分超過(guò)20的百分比）均達(dá)到94%以上，GC含量均超過(guò)42%（表2）。這充分說(shuō)明本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的質(zhì)量符合國(guó)際水平，為后續(xù)的生物信息學(xué)分析提供了有力支持。在進(jìn)一步比較接種根瘤菌組和對(duì)照組的數(shù)據(jù)時(shí)，觀察到原始讀數(shù)（Raw reads）在接種根瘤菌組中略高于對(duì)照組。然而，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)清洗后，兩組的清洗讀數(shù)（Clean reads）趨向一致。這提示植物在與根瘤菌互作時(shí)可能發(fā)生了基因表達(dá)的激增，為進(jìn)一步探索植物與根瘤菌相互作用提供了引人深思的線索。

本研究生成的數(shù)據(jù)集可在NCBI序列讀取存檔（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，BioProject編號(hào)為PRJNA935687（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA935687）。

2.2" 基因功能注釋

將unigenes在NR，Swiss-Prot，Pfam，EggNOG，GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)，以預(yù)測(cè)unigene序列的功能。最終獲得96 844個(gè)unigenes注釋，EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的信息最多，共有36 519個(gè)unigenes獲得注釋，占所有unigenes的37.71%，其他數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果如表3所示。

GO（Geneontology）是一個(gè)基因功能分類體系，被劃分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別。對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行GO分類，可以確定基因行使的主要功能。利用GO共得到23 171個(gè)功能注釋，被劃歸到46個(gè)GO分類中。在分子功能的15個(gè)分類中，涉及催化活性和結(jié)合作用的最多；在細(xì)胞組分的12個(gè)分類中，大部分歸屬于膜部分、細(xì)胞部分與細(xì)胞器；在生物學(xué)過(guò)程的19個(gè)分類中，代謝過(guò)程與細(xì)胞過(guò)程涉及到的基因最多，種類與數(shù)量見(jiàn)圖1。

為鑒定三葉草中涉及的代謝通路，將測(cè)序所得的96 844條unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果共有18 007個(gè)unigenes得到注釋，參與20個(gè)代謝通路。其中，主要涉及翻譯（1886個(gè)）、碳水化合物代謝（1382個(gè)）、折疊、排序和降解（1266個(gè)）、氨基酸代謝（916個(gè)）和運(yùn)輸與分解代謝（895個(gè)），排名前20的代謝途徑見(jiàn)表4。

2.3" 差異表達(dá)基因鑒定

對(duì)獲取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，篩選差異表達(dá)基因（DEGs），unigene表達(dá)采用FPKM法計(jì)算，篩選閾值為FDR（False discovery rate）lt;0.001，|log2Ratio|≥1，選擇至少有兩倍差異的轉(zhuǎn)錄本，最后鑒定出1105個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因677個(gè)，下調(diào)基因428個(gè)（圖2）。

2.4" 差異表達(dá)基因功能注釋

為了探究差異表達(dá)基因的功能信息，通過(guò)BLAST軟件將篩選出來(lái)的1105條差異表達(dá)基因與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，能夠得到注釋信息的差異表達(dá)基因一共有79個(gè)?；蚬δ苤饕譃?個(gè)方面：細(xì)胞組分、分子功能以及生物過(guò)程（圖3）。其中，注釋到細(xì)胞組分方面的差異表達(dá)基因最多，共有62個(gè)分布在7個(gè)亞類中，主要富集于細(xì)胞組分、膜部分和膜；其次是注釋到生物過(guò)程方面共8個(gè)亞類的51個(gè)基因，主要富集于代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和對(duì)刺激的響應(yīng)；注釋到分子功能方面共4個(gè)亞類的基因有45個(gè)，主要富集在結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等。

2.5" 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

將篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析代謝途徑，結(jié)果顯示共有21個(gè)差異表達(dá)基因成功富集于22個(gè)代謝通路中。其中，6條（P≤0.05）通路被鑒定為顯著富集。苯丙烷類生物合成通路中注釋到了4個(gè)基因，氨基糖和核苷酸糖代謝通路中注釋到了3個(gè)基因，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝通路中注釋到了2個(gè)基因。核黃素代謝、異黃酮類物質(zhì)生物合成和磺胺素代謝通路中均富集到了1個(gè)差異表達(dá)基因。

2.6" 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq的數(shù)據(jù)一致性，利用qRT-PCR的技術(shù)對(duì)隨機(jī)選擇的15個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖5所示，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq的表達(dá)結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

3" 討論

近年來(lái)，RNA測(cè)序（RNA-seq）已被廣泛用于提升對(duì)基因調(diào)控和關(guān)鍵生物過(guò)程中信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的理解，成為研究生物基因表達(dá)調(diào)控的重要工具［22］。在本研究采用Illumina HiSeq技術(shù)對(duì)接種根瘤菌后的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’進(jìn)行全面的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)與未接種根瘤菌的對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果獲得了21.21Gb的Clean reads，其中Q20和Q30均大于90%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，為后續(xù)的深入分析提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

通過(guò)基因的表達(dá)差異分析，共鑒定到677個(gè)上調(diào)基因，428個(gè)下調(diào)基因，利用BLAST軟件與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞組成、膜部分和膜上。這一結(jié)果表明，根瘤菌侵染過(guò)程中，植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織定位發(fā)生了顯著的變化。這種變化可能是植物為了適應(yīng)共生菌的侵入和根瘤的形成而調(diào)整細(xì)胞壁和膜組成的結(jié)果［23］。細(xì)胞膜作為感知外界信號(hào)的重要部位，其上的受體和通道蛋白的表達(dá)變化，可能是對(duì)根瘤菌信號(hào)分子的直接響應(yīng)［24］。

在生物過(guò)程方面，差異表達(dá)基因主要富集在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和對(duì)刺激的響應(yīng)中。這表明固氮共生過(guò)程要求植物調(diào)整其代謝機(jī)制，以支持根瘤菌的生存和發(fā)育，同時(shí)也涉及到植物細(xì)胞分裂、分化以及程序性細(xì)胞死亡等一系列復(fù)雜過(guò)程的調(diào)整［25］。

在分子功能方面，本研究所鑒定的差異表達(dá)基因顯示出在結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等方面的顯著富集。這一發(fā)現(xiàn)揭示了根瘤菌感染過(guò)程中植物細(xì)胞在分子層面上的復(fù)雜調(diào)整和精細(xì)化反應(yīng)［26］。首先，結(jié)合活性的變化指出了植物細(xì)胞對(duì)根瘤菌感染作出反應(yīng)的分子機(jī)制。例如，一些蛋白質(zhì)可能增加了與特定信號(hào)分子的結(jié)合能力，這可能包括根瘤菌分泌的信號(hào)分子或植物自身產(chǎn)生的應(yīng)答分子。這種結(jié)合活性的改變可能是植物感知根瘤菌并啟動(dòng)相應(yīng)防御機(jī)制的關(guān)鍵步驟［27］。其次，催化活性的變化反映了植物代謝路徑的調(diào)整［28］。在固氮共生過(guò)程中，植物需要合成新的化合物以支持共生菌，或者調(diào)整現(xiàn)有的代謝途徑以適應(yīng)根瘤菌的需求［29］。因此，某些酶的活性可能會(huì)增加，以催化新的或改變的化學(xué)反應(yīng)。最后，轉(zhuǎn)運(yùn)活性的變化可能與植物細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)分子的運(yùn)輸需求增加有關(guān)。共生狀態(tài)要求植物和根瘤菌之間有有效的物質(zhì)交換，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、信號(hào)分子和其他小分子。因此，相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在這一過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，以確保共生菌的正常生長(zhǎng)和固氮活動(dòng)的順利進(jìn)行［30］。

在本研究中，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析旨在深入理解根瘤菌感染對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’代謝途徑的影響。通過(guò)這一分析，可以識(shí)別出在根瘤菌感染過(guò)程中被激活或調(diào)節(jié)的關(guān)鍵生物代謝通路，從而提供了對(duì)共生機(jī)制更深入的理解。

分析結(jié)果顯示，共有6個(gè)顯著富集的代謝通路，反映了植物在根瘤菌感染后的多方面代謝調(diào)整。其中，苯丙烷生物合成通路的顯著富集表明植物可能通過(guò)增強(qiáng)這一途徑來(lái)增加其抗逆性，尤其是在對(duì)生物脅迫的防御反應(yīng)中。特別關(guān)注的是該通路中的過(guò)氧化物酶（酶編號(hào)1.11.1.7）［31］。過(guò)氧化物酶在植物體中扮演著多種功能，尤其是在參與木質(zhì)素合成過(guò)程中。木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的重要組分，不僅增強(qiáng)了植物的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，而且在植物與微生物的互作中發(fā)揮著重要作用。根瘤菌感染初期，植物可能通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶的活性來(lái)管理與根瘤菌的相互作用，影響根瘤的形成和固氮能力［32］。這表明，苯丙烷代謝產(chǎn)物可能作為信號(hào)分子參與調(diào)控根瘤的形成，植物細(xì)胞壁的重構(gòu)過(guò)程中過(guò)氧化物酶可能起到關(guān)鍵作用。在植物與根瘤菌的互作中，1.11.1.7編碼的過(guò)氧化物酶的作用可能是雙重的：一方面，它被激活以調(diào)節(jié)根瘤的發(fā)育；另一方面，它可能被適度抑制以防止過(guò)度的防御反應(yīng)對(duì)共生關(guān)系造成損害［33］。

氨基糖和核苷酸糖的代謝通路也顯示出顯著變化，這些代謝途徑在細(xì)胞壁的構(gòu)建和能量轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用［34］。這一結(jié)果暗示，根瘤菌的接種可能激發(fā)了植物細(xì)胞壁重構(gòu)和能量代謝過(guò)程的調(diào)整，為根瘤的形成創(chuàng)造條件。此外，半胱氨酸和甲硫氨酸的代謝通路也被顯著富集，這兩種氨基酸在植物的抗氧化過(guò)程中具有重要作用。植物可能需要調(diào)整這些氨基酸的代謝來(lái)應(yīng)對(duì)由根瘤菌感染引起的氧化壓力，或?yàn)楣痰^(guò)程中的蛋白質(zhì)合成提供必要的構(gòu)建塊［35］。

異黃酮生物合成通路中，CYP81E酶的表達(dá)變化也值得關(guān)注。CYP81E屬于細(xì)胞色素P450家族，在植物的次生代謝過(guò)程中起著重要作用，包括在植物抗性和植物-微生物相互作用中的功能［36］。這種酶在植物與微生物的互作過(guò)程中可能上調(diào)，以合成相關(guān)的防御分子，如異黃酮，它們可能參與抑制病原菌的侵染或調(diào)節(jié)共生微生物的相互作用［37］。CYP81E家族成員催化的化合物可能直接影響根瘤的形態(tài)發(fā)育和功能，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)支持固氮活動(dòng)至關(guān)重要。這些變化可能是植物響應(yīng)共生菌信號(hào)、激活防御機(jī)制以及調(diào)節(jié)共生關(guān)系平衡的表現(xiàn)。本研究中發(fā)現(xiàn)的其他顯著富集通路，如核黃素代謝和磺胺素代謝，可能反映了根瘤菌接種對(duì)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、能量代謝和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等方面的影響。

總體而言，本研究揭示了植物與根瘤菌互作是一個(gè)涉及多層次的復(fù)雜相互調(diào)節(jié)過(guò)程。從根瘤的形成到固氮能力的激活，都涉及到細(xì)胞壁的重構(gòu)和分子功能的調(diào)整。植物與根瘤菌的共生關(guān)系在分子層面上呈現(xiàn)出復(fù)雜而微妙的相互作用，這些發(fā)現(xiàn)為未來(lái)深入理解植物與根瘤菌共生機(jī)制提供了寶貴的線索。

4" 結(jié)論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析揭示了‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’與根瘤菌共生關(guān)系中的關(guān)鍵分子變化，共篩選出1105個(gè)差異表達(dá)基因，其中677個(gè)基因上調(diào)，428個(gè)基因下調(diào)。這些基因的變化主要集中在細(xì)胞組成和膜部分，反映了植物細(xì)胞在共生狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)整，特別是苯丙烷生物合成通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝通路在共生固氮過(guò)程中顯著調(diào)整。這些發(fā)現(xiàn)為理解植物與根瘤菌共生機(jī)制提供了新的視角，強(qiáng)調(diào)了植物與微生物相互作用的復(fù)雜性。

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（責(zé)任編輯" 閔芝智）