紅芪HpC4H基因的克隆及其鐵鹽干預(yù)下的表達(dá)分析

摘要：肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育方面具有重要的作用。為探究紅芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.）黃酮類成分合成的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究以紅芪幼苗為材料，通過RACE技術(shù)，克隆HpC4H基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示：HpC4H基因全長(zhǎng)為1634 bp，編碼477個(gè)氨基酸，蛋白分子量為54.94 kD，不含有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，具有C4H保守功能區(qū)并屬于細(xì)胞色素P450超基因家族。序列分析發(fā)現(xiàn)，HpC4H氨基酸序列與檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom.）的相似性高達(dá)92.84%。qRT-PCR結(jié)果表明，HpC4H基因在紅芪不同組織中的表達(dá)模式為：根gt;莖gt;葉，同時(shí)，該基因的表達(dá)量在不同濃度鐵鹽干預(yù)下有上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)鐵鹽可能在調(diào)控紅芪HpC4H基因表達(dá)中發(fā)揮一定作用，且低濃度鐵鹽溶液作用顯著。

關(guān)鍵詞：紅芪；肉桂酸-4-羥化酶；基因克隆；鐵鹽溶液；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q946.5""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" "文章編號(hào)：1007-0435（2024）09-2749-10

收稿日期：2024-04-07；修回日期：2024-06-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目（82160730）；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（81860683）；甘肅省教育廳雙一流重大科研項(xiàng)目（GSSYLXM-05）資助

作者簡(jiǎn)介：

何軍剛（1993-），男，漢族，甘肅省天水人，博士研究生，主要從事中藥鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究，E-mail：1604360479@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：gslichengyi@163.com

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.09.008

引用格式：

何軍剛， 李昕蓉， 魏小成，等.紅芪HpC4H基因的克隆及其鐵鹽干預(yù)下的表達(dá)分析［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（9）：2749-2758

HE Jun-gang， LI Xin-rong， WEI Xiao-cheng，et al.Cloning and expression analysis of HpC4H in Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. with the intervention of iron salt［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（9）：2749-2758

Cloning and expression analysis of HpC4H in Hedysarum polybotrys

Hand.-Mazz. with the intervention of iron salt

HE Jun-gang1， LI Xin-rong2， WEI Xiao-cheng1， XIE Yao-hui1， XIE Xin-ming1， LI Cheng-yi1*

（1. College of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou， Gansu Provicne 730000， China; 2. College of Acupuncture

and Massage， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou， Gansu Provicne 730000， China）

Abstract：Cinnamate-4-hydroxylase （C4H） has an important role in the regulation of plant growth and development. To investigate the molecular regulatory mechanism of flavonoid synthesis in Hedysarum polybotrys，the HpC4H gene was cloned from Hedysarum polybotrys seedlings by the RACE technique，and its bioinformation and expression patterns were analyzed in this study. The results showed that the full length of HpC4H was 1634 bp in length which encodes 477 amino acids. The molecular weight of the HpC4H protein was 54.94 kD. The HpC4H protein structure did not contain signal peptides and transmembrane structural regions. Subcellular localization prediction showed that the HpC4H protein was located in the endoplasmic reticulum. It had a C4H-conserved functional region and belonged to the cytochrome P450 supergene family. The amino acid sequence of HpC4H showed the highest similarity of 92.84% with Caragana korshinskii. The results of qRT-PCR showed that the HpC4H gene was predominantly expressed in roots，followed by stems and leaves. At the same time，the expression of this gene was up-regulated under the intervention of different concentrations of iron salt. This study speculated that different concentrations of iron salts might play a certain role in regulating the expression of the HpC4H gene in Hedysarum polybotrys，and the low iron salt solution had a significant effect.

Key words：Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.;Cinnamate-4-hydroxylase;Gene clone;Iron salt solution;Gene expression

紅芪（Hedysari Radix）為豆科（Leguminosae）植物多序巖黃芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.）的干燥根，是甘肅省道地藥材。紅芪具有補(bǔ)氣生陽，利水消腫，生津養(yǎng)血等功效，臨床常用于治療氣虛水腫，血虛萎黃等病證［1］。研究表明，其主要含有多糖、黃酮、皂苷、氨基酸等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［2］。目前，紅芪研究主要集中在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定［3-4］、化學(xué)成分分離及分析［5-7］和新藥研發(fā)［8-10］等方面，其C4H基因的克隆及表達(dá)分析研究較少。微量元素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，植物可以通過多種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來調(diào)節(jié)養(yǎng)分的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配，從而維持細(xì)胞礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)平衡［11］。其中，鐵元素可以促進(jìn)葉綠素合成，提高相關(guān)酶活性［12］。研究表明，鐵元素在土壤中以Fe3+形式存在，難以被吸收，通常采用葉面噴施的方式以補(bǔ)充植物所需的鐵營(yíng)養(yǎng)［13］。鐵元素主要存在于葉綠體中，鐵缺失影響光合電子的傳遞，導(dǎo)致光化學(xué)損傷［14］；鐵過量影響植物根系的生長(zhǎng)，使得葉片出現(xiàn)黃褐色斑點(diǎn)［15］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度（0.5～8 mg·L-1）的鐵鹽溶液可以促進(jìn)紅芪主要有效成分（黃酮類）的累積，進(jìn)而可以提高紅芪質(zhì)量［16］。

在植物的次生代謝過程中，苯丙氨酸類代謝途徑形成黃酮類成分。研究發(fā)現(xiàn)［17］苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonia-lyase，PAL）、肉桂酸4-羥化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-ceoumarate：CoA ligase，4CL）和查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）是該代謝過程中的4個(gè)關(guān)鍵酶（圖1），其中C4H是苯丙烷代謝途徑中第一個(gè)羥化酶，該酶基因催化生成的4-羥基肉桂酸和對(duì)香豆酰-CoA是合成黃酮類化合物的重要底物。近年來，已從膜莢黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.）［18］、芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）［19］、獨(dú)行菜（Lepidium apetalum Willd.）［20］、華北紫丁香（Syringa oblate Lindl.）［21］、斑地錦（Euphorbia maculate L.）［22］、紫蘇（Perilla frutescens（L.） Britt.）［23］、甘薯（Ipomoea batatas （L.） Lam.）［24］、大豆（Glycine max （L.） Merr.）［25］等植物中克隆得到C4H基因，并展開相關(guān)研究。

基于此，本試驗(yàn)通過查找GenBank中的其他豆科植物C4H基因的CDS序列，進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)高度保守片段簡(jiǎn)并引物。采用PCR結(jié)合RACE技術(shù)從紅芪中克隆得到全長(zhǎng)C4H基因序列，通過生物信息學(xué)手段，對(duì)HpC4H蛋白的理化特性、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)及機(jī)構(gòu)功能區(qū)域等預(yù)測(cè)分析。同時(shí)分析了紅芪不同部位（根、莖、葉）及不同濃度鐵鹽溶液干預(yù)下紅芪根中C4H基因的相對(duì)表達(dá)量，旨在從基因水平研究紅芪中黃酮類化合物生物合成途徑及分子調(diào)控作用機(jī)制，為深入研究C4H家族蛋白的酶學(xué)特性提供理論依據(jù)［26］。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

將試驗(yàn)所用紅芪種子剝?nèi)デv膜，挑選種粒飽滿的種子作為培育材料。用體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸滅菌20 min，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的濃硫酸浸泡2～3 min打破種子休眠，之后流水沖洗干凈，最后置于帶有濾紙培養(yǎng)皿中，在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光照8 h/d，溫度25℃，濕度50%～70%［27］。幼苗用于盆栽試驗(yàn)，土培基質(zhì)由蛭石和珍珠巖（5∶1）組成，盆栽紅芪的營(yíng)養(yǎng)液配方為［28］：Ca（NO3）2·4H2O 945.000 mg，KNO3 607.000 mg，NH4H2PO4115.000 mg，MgSO4·7H2O493.000 mg，ZnSO4·7H2O 8.600 mg，H3BO3 6.200 mg，MnSO4 22.300 mg，Na2MoO40.250 mg，CuSO4·5H2O 0.080 mg，CoCl2 0.025 mg，溶于1 L蒸餾水中，pH值調(diào)為6.5。根據(jù)《藥用植物營(yíng)養(yǎng)與施肥技術(shù)》書中內(nèi)容結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置鐵鹽溶液濃度［29］，采用葉面噴施法，以3.67 mg·L-1（低濃度）、11.00 mg·L-1（高濃度）2個(gè)濃度進(jìn)行處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別在處理0，6，12和24 h后，取三株長(zhǎng)勢(shì)一致的紅芪幼苗，混合根組織，迅速置于液氮中冷凍，保存于-80℃超低溫冰箱，備用。

1.2" 試劑與儀器

植物總RNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司，Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒、ApexHF HS DNA聚合酶預(yù)混液-FS、qPCR試劑盒、引物合成，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，SMARTer RACE 5′/3′Kit試劑盒購自于TaKaRa公司，DEPC，50×TAE，DNA Marker DL5000和DL2000購自于北京BioTeke有限公司，渦旋振蕩混勻儀IKA WORKERS高速組織研磨器北京天根生化科技有限公司，瓊脂糖凝膠電泳儀EC250-90，北京六一電泳廠，實(shí)時(shí)qPCR儀FTC-8000，反轉(zhuǎn)錄PCR儀，超低溫冰箱DW-86L626，超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000C，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3" 試驗(yàn)方法

1.3.1" 紅芪總RNA的提取和cDNA的合成" 取紅芪幼苗100 mg，迅速置于液氮中研成細(xì)粉，按照植物總RNA試劑盒說明書步驟提取總RNA，并在超微量分光光度計(jì)上檢測(cè)其濃度和純度，于-80℃冰箱保存，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，若質(zhì)量符合要求，用Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒，參照說明書步驟將紅芪RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，產(chǎn)物于-20℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2" HpC4H基因的克隆" 在NCBI網(wǎng)上找到其他豆科植物的這C4H基因CDS序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出高度保守區(qū)段，利用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物見表1，以紅芪cDNA為模板，根據(jù)ApexHF HS DNA聚合酶預(yù)混液-FS試劑盒對(duì)HpC4H基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序的得到的序列片段設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE引物，3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA的合成具體操作按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系和程序按照說明書進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接pMD19-T Vertor、轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性菌液稀釋后，送至西安擎科生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNAMAN和BioEdit軟件對(duì)HpC4H基因序列進(jìn)行比對(duì)和拼接后，根據(jù)所得全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)克隆C4H編碼區(qū)全長(zhǎng)引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)檢測(cè)和測(cè)序獲得全長(zhǎng)序列。反應(yīng)結(jié)束得到的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)目的基因位置。

1.3.3" HpC4H基因的生物信息學(xué)分析" 將所測(cè)定的HpC4H基因序列在GenBank上通過Blast搜索核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，由DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，使用ORF Finder查找開放閱讀框。生物信息學(xué)分析主要采用一些網(wǎng)上在線軟件進(jìn)行分析，如采用ExPASy Protparam分析蛋白質(zhì)相對(duì)分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、氨基酸種類占比等；用ProtScale分析蛋白質(zhì)疏水性；SignalP4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析；使用TMHMM2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線工具Wolfpsor分析目的序列的亞細(xì)胞定位；分別用PRABI，SWISS-MODEL，NetPhos，SMART等預(yù)測(cè)分析編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、保守功能結(jié)構(gòu)域。同時(shí)運(yùn)用MEGA7.0將氨基酸序列與已鑒定功能的C4H氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建氨基酸同源樹。

1.3.4" HpC4H基因的表達(dá)水平分析" 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HpC4H基因的相對(duì)表達(dá)量。分別取約100 mg紅芪不同組織（根、莖、葉）和不同鐵鹽處理（0，6，12和24 h）的根部組織，使用植物組織RNA試劑盒快速提取總RNA，再用Evo M-MLV Plus cDNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)課題組前期克隆得到的紅芪actin基因序列［30］，運(yùn)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)用于qPCR的特異性引物（見表1），參照SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒的說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，求取三個(gè)平行管的Ct值，根據(jù)Ct值計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量n，公式為n=2-△△Ct［31］，使用GraphPad 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，使用SPSS（25.0）軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" HpC4H基因克隆與核苷酸序列分析

對(duì)紅芪根總RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得RNA質(zhì)量濃度為132 ng·μL-1，A260 /A280值為2.01，經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S RNA和18S RNA條帶清晰可見（圖2A），表明所提取的總RNA完整性和純度較好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。根據(jù)克隆得到的HpC4H基因片段（圖2B）序列設(shè)計(jì)引物，以紅芪RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用RACE結(jié)合PCR技術(shù)擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約為1634 bp的序列（圖2C），使用ORF Finder對(duì)HpC4H基因cDNA序列進(jìn)行分析，開放閱讀框?yàn)?155 bp，共編碼477個(gè)氨基酸，方框表示起始密碼子和終止密碼子，其中ATT為起始密碼子，TAA為終止密碼子（圖3）。將HpC4H核苷酸序列在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示，HpC4H與豆科的一些植物相似性較高，如與檸條錦雞兒（C. korshinskii Kom.）、蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.）、膜莢黃芪（A. membranaceus （Fisch.） Bge.）、黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala Bge.）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的核苷酸序列相似性分別在88.96%，85.86%，85.80%，85.42%，85.89%，與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）、紅車軸草（Trifolium pratense L.）、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）、鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）的相似性都在80%以上。比對(duì)結(jié)果表明所得基因?qū)儆贑4H家族。

2.2" HpC4H蛋白理化性質(zhì)分析

采用在線工具ExPASy對(duì)HpC4H蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果見表2可知，HpC4H多肽鏈具有20種氨基酸，其中數(shù)目最少的為半胱氨酸（Cys），只有5個(gè)，其中亮氨酸（Leu）數(shù)目最多，為52個(gè)，占整個(gè)氨基酸組成的10.9%。HpC4H蛋白分子式為C2482H3885N691O691S15，分子量為54.94 kD，等電點(diǎn)為8.75，氨基酸殘基中帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為60，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為65，不穩(wěn)定指數(shù)為47.14，脂溶指數(shù)為90.69，親水性平均指數(shù)（GRAVY）為-0.368，根據(jù)GRAVY值范圍在-2～2，正值表明此蛋白為疏水性蛋白，負(fù)值表明此蛋白為親水性蛋白，故推測(cè)HpC4H蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白。

2.3" HpC4H編碼蛋白信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析

通過Signal P4.1對(duì)HpC4H蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，如圖4A顯示，其中S值最大為0.196，表明HpC4H蛋白不存在信號(hào)肽。利用TMHMM2.0在線工具預(yù)測(cè)可知HpC4H蛋白跨膜螺旋數(shù)為0，結(jié)果見圖4B，可知此蛋白無跨膜區(qū)。使用在線工具Plant-mPLoc分析目的序列的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，HpC4H蛋白最有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.4" HpC4H蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)功能的預(yù)測(cè)分析

利用PRABI在線工具對(duì)HpC4H蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖5A），結(jié)果表明，HpC4H蛋白主要由α-螺旋（Alpha helix，圖中為藍(lán)色）占46.33%，β轉(zhuǎn)角（Beta turn，圖中為綠色）占4.40%、無規(guī)則卷曲（Random coil，圖中為紫色）占36.27%、延伸鏈（Extended strand，圖中為紅色）占13.00%。利用SWISS-MODEL對(duì)HpC4H蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，如圖5B所示，HpC4H蛋白的GMQE值和QMEAN值分別是0.92和-0.89，說明該模型可靠性較強(qiáng)。Conserved domains在線工具分析表明，HpC4H蛋白在1～472位，在保守區(qū)含有1個(gè)PLN02394（反式肉桂酸酯-4-單加氧酶）超家族保守結(jié)構(gòu)域，屬于CYP450超基因家族（圖5C）。

2.5" 磷酸化位點(diǎn)分析和糖基化修飾

利用在線工具NetPhos 3.1預(yù)測(cè)HpC4H蛋白磷酸化位點(diǎn)有3類氨基酸分別是Ser、Thr、Tyr，結(jié)果顯示HpC4H蛋白中存在48個(gè)潛在的氨基酸磷酸化位點(diǎn)，其中17個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，19個(gè)可能的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，12個(gè)可能的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，潛在的磷酸化對(duì)蛋白質(zhì)功能的正常發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用。通過NetNGlyc-1.0預(yù)測(cè)（圖6），處于34位的甘氨酸可能需要進(jìn)行N-糖基化修飾。

2.6" HpC4H的氨基酸序列同源比對(duì)分析

對(duì)HpC4H基因編碼的氨基酸序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果如圖7顯示，HpC4H氨基酸序列與豆科植物檸條錦雞兒（C. korshinskii Kom.）的相似性最高，達(dá)到了92.84%，與黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala Bge.）、蒙古黃芪（A. membranaceus（Fisch.）Bge.var.）、膜莢黃芪（A. membranaceus Bge.）、雙莢決明（Senna bicapsularis （L.） Roxb.）、洋甘草（Glycyrrhiza glabra L.）、甘草（G. uralensis Fisch.）、鷹嘴豆（C. arietinum L.）的相似性在90.57%～92.63%，相似度很高，可以推測(cè)此氨基酸序列就是HpC4H氨基酸序列。利用MEGA7.0軟件對(duì)HpC4H氨基酸序列與其他豆科植物進(jìn)行多序列比對(duì)，并進(jìn)行繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖8中可以看到，紅芪HpC4H蛋白序列與檸條錦雞兒、洋甘草和甘草屬于同一分支，且與同科植物的檸條錦雞兒在進(jìn)化關(guān)系上最為接近。

2.7" 紅芪HpC4H基因組織表達(dá)分析

選用生長(zhǎng)旺盛的紅芪根、莖、葉作為材料，運(yùn)用qRT-PCR分析HpC4H基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖9所示，HpC4H基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平由高到低依次根、莖、葉，表明HpC4H在紅芪不同組織中表達(dá)水平具有差異性（Plt;0.05）。

2.8" 鐵鹽干預(yù)下對(duì)HpC4H基因表達(dá)的影響分析

對(duì)紅芪幼苗進(jìn)行鐵鹽溶液干預(yù)，以不同時(shí)間的紅芪根部組織為材料進(jìn)行qRT-PCR分析HpC4H基因的相對(duì)表達(dá)量，圖10所示。經(jīng)鐵鹽干預(yù)后，與未干預(yù)相比，紅芪中HpC4H基因的表達(dá)水平提升，其中，在6 h達(dá)到最高峰，隨后逐漸降低。24 h后，低濃度干預(yù)組表達(dá)水平依為對(duì)照水平的1.75倍，高濃度干預(yù)組表達(dá)水平顯著低于對(duì)照水平；6～24 h低濃度鐵鹽干預(yù)組表達(dá)水平均比高濃度干預(yù)組高，在12 h時(shí)低濃度鐵鹽干預(yù)下的表達(dá)水平是高濃度干預(yù)的4.13倍。結(jié)果表明，不同濃度的鐵鹽溶液可以影響HpC4H基因的表達(dá)，且低濃度鐵鹽作用較顯著。

3" 討論

傳統(tǒng)生物學(xué)認(rèn)為蛋白質(zhì)的序列決定其結(jié)構(gòu)和功能［32］。基于生物信息學(xué)，通過計(jì)算機(jī)模擬和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，可對(duì)未知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能或其相關(guān)的輔助信息進(jìn)行全面的分析和預(yù)測(cè)。目前，C4H基因在大豆中研究比較深入［25］，但紅芪C4H基因研究較少。本研究克隆出紅芪的C4H基因全長(zhǎng)序列1634 bp，編碼477個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為54.94 kD。植物中的C4H基因可能以多拷貝數(shù)的形式存在，且有利于植物進(jìn)行復(fù)雜的代謝調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在桂花（Osmanthus fragrans（Thunb.） Lour.）［33］與膜莢黃芪［18］（A. membranaceus Bge.）中至少存在兩個(gè)C4H基因拷貝，在大豆［25］（G. max （L.） Merr.）中鑒定出了四個(gè)C4H基因，而在豌豆（Pisum sativum L.）［34］中只有一個(gè)C4H基因，本研究在紅芪根組織中克隆得到一個(gè)與其他物種同源性較高的C4H片段，紅芪中是否也存在C4H基因家族，仍需進(jìn)一步研究。

利用在線軟件對(duì)HpC4H蛋白進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HpC4H蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白，與龍州鳳仙花（Impatiens morsei Hook.f.）ImC4H基因［35］和楓香（Liquidambar formosana Hance）LfC4Hb基因［36］的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)HpC4H基因編碼的蛋白不存在信號(hào)肽且無跨膜結(jié)構(gòu)，與茶樹（Camellia sinensis （L.） O. Ktze.）C4H基因［37］的研究結(jié)果一致，推測(cè)該蛋白質(zhì)可能在細(xì)胞內(nèi)部執(zhí)行功能，如催化生化反應(yīng)、參與蛋白質(zhì)合成、調(diào)控基因表達(dá)等。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，HpC4H蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性最大。C4H的N-端有錨定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列，其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可能參與了電子鏈的化學(xué)傳遞［38］。研究發(fā)現(xiàn)，從毛竹（Phyllostachys edulis （Carrière） J. Houz.）［39］中鑒定出6個(gè)PeC4Hs，亞細(xì)胞定位均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，然而，高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）［40］的SbC4H1定位在細(xì)胞質(zhì)中，芒果（Mangifera indica L.）［41］的C4H蛋白則定位在線粒體中，因此，不同物種C4H定位存在差異。HpC4H蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)模型可靠性較強(qiáng)，與荸薺（Eleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.）［42］C4H基因的研究結(jié)果相似，具有C4H所特有的保守結(jié)構(gòu)域，屬于細(xì)胞色素P450超基因家族CYP73A亞家族中的一員［43］，細(xì)胞色素P450被認(rèn)為是一類超基因家族編碼的含有血紅素的氧化酶類，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，微粒體和線粒體內(nèi)膜上［44］。蛋白質(zhì)磷酸化作為一種最普遍和最重要的翻譯后修飾調(diào)控著幾乎所有的生命過程，磷酸化修飾常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的側(cè)鏈羥基［45］，與本研究預(yù)測(cè)HpC4H蛋白磷酸化位點(diǎn)3類氨基酸相一致，潛在的磷酸化可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。序列分析發(fā)現(xiàn)，HpC4H與其他豆科植物C4H基因的同源性較高，表明這些豆科植物C4H基因在進(jìn)化的過程中比較保守，預(yù)示著C4H基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用［42］。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)證實(shí)了C4H基因在不同器官組織中具有不同表達(dá)模式，研究發(fā)現(xiàn)，HpC4H在根莖葉中均有表達(dá)，推測(cè)HpC4H基因在根、莖、葉中均能發(fā)揮作用，影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育［46］。

當(dāng)植物受逆境脅迫下，可通過調(diào)節(jié)一系列合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影響其黃酮類的合成和積累［47］。其中，就包括C4H基因。Ryan［48］等在矮牽牛花中的研究發(fā)現(xiàn)，UV-B脅迫處理下，C4H等基因表達(dá)量的增加使得植物組織中總黃酮含量增加。Liu等［49］發(fā)現(xiàn)K離子缺乏誘導(dǎo)的菊花中C4H等基因的表達(dá)量減少，造成了該部位黃酮含量的降低。鐵是植物必需的微量元素之一，廣泛參與植物的葉綠素合成、光合作用、呼吸及電子傳遞等重要過程［50］。研究發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的鐵肥可以改善印度薺菜的品質(zhì)，并且促進(jìn)對(duì)Cd的吸收［51］；鐵脅迫有利于“碭山酥梨”葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收及相關(guān)基因的表達(dá)［52］；施用一定量的鐵和錳可以促進(jìn)隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA三種丹參酮類物質(zhì)的積累［53］。課題組前期通過施加適量鐵鹽溶液以提高紅芪中黃酮類化合物的含量［16］。本研究結(jié)果表明，不同濃度（0.5～8 mg·L-1）鐵鹽對(duì)紅芪根系HpC4H基因的表達(dá)均有影響，且低濃度鐵鹽影響顯著。基于此，推測(cè)鐵鹽可能通過調(diào)控HpC4H基因的表達(dá)，促進(jìn)紅芪異黃酮類成分的積累，進(jìn)而提高紅芪藥材質(zhì)量。

本研究?jī)H利用在線分析工具對(duì)HpC4H蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為進(jìn)一步探究HpC4H基因在紅芪中的生物學(xué)功能，后續(xù)可通過將HpC4H基因克隆質(zhì)粒與p1300-cYFP連接構(gòu)建過表達(dá)載體HpC4H-YFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染煙草，于激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位區(qū)域；采用蛋白印跡法驗(yàn)證HpC4H在煙草中的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證其蛋白分子量，為利用分子生物技術(shù)來提高紅芪品質(zhì)提供理論依據(jù)。

4" 結(jié)論

本研究成功克隆出紅芪HpC4H基因全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示，開放閱讀框?yàn)?155 bp，共編碼477個(gè)氨基酸，蛋白分子量為54.94 kD，不含有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。HpC4H序列中具有一個(gè)C4H保守結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位顯示該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。表達(dá)模式分析表明，HpC4H在不同組織中表達(dá)有差異，在根中最高，在葉片中最低，該基因表達(dá)量在不同濃度鐵鹽干預(yù)下，均在24 h內(nèi)先升高隨后逐漸降低，初步確定HpC4H基因在紅芪中參與鐵鹽脅迫應(yīng)答，為后續(xù)深入探究C4H基因在紅芪中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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