紫花苜蓿不育系與保持系線粒體全基因組比較分析

摘要：細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS），它可以極大地減少人工去雄所帶來(lái)的人工成本。本試驗(yàn)以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）不育系MSGN-1A及其保持系MSGN-1B為試驗(yàn)材料，采用二代Illumina Hiseq測(cè)序技術(shù)結(jié)合三代PacBio測(cè)序技術(shù)，并以三代Naopore測(cè)序作為輔助進(jìn)行g(shù)ap補(bǔ)平，對(duì)2份材料的線粒體基因組測(cè)序后進(jìn)行組裝，并比較分析不育系和保持系的線粒體基因組結(jié)構(gòu)和基因差異。結(jié)果顯示紫花苜蓿MSGN-1A和MSGN-1B線粒體基因組大小分別為297 940 bp和310 534 bp，兩份材料均注釋到蛋白編碼基因31個(gè)，tRNA基因分別為18個(gè)和17個(gè)，均注釋到3個(gè)rRNA基因。不育系和保持系對(duì)比發(fā)現(xiàn)存在大量的SNPs和InDels，導(dǎo)致部分蛋白編碼基因的編碼產(chǎn)物發(fā)生變化。預(yù)測(cè)編碼開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORFs）分別為67個(gè)和71個(gè)，預(yù)測(cè)到不育系特有的ORFs為20個(gè)，其中8個(gè)含有跨膜結(jié)構(gòu)域。最終篩選出atp8，nad4，rps3，ccmFn四個(gè)蛋白編碼基因和orf145a，orf135b兩個(gè)ORFs，可能與紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿;細(xì)胞質(zhì)雄性不育;線粒體基因組;差異基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S812""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）09-2737-12

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.09.007

引用格式：

賈" 雪， 蔡回彩， 于" 瀾，等.紫花苜蓿不育系與保持系線粒體全基因組比較分析［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（9）：2737-2748

JIA Xue， CAI Hui-cai， YU Lan，et al.Comparison of Mitochondrial Genome Between Sterile Line and Maintainer Line of Medicago sativa L.［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（9）：2737-2748

Comparison of Mitochondrial Genome Between Sterile Line and

Maintainer Line of Medicago sativa L.

JIA Xue， CAI Hui-cai， YU Lan， LI Pei， XU Bo*

（College of Forestry and Grass Science， Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin Province 130118， China）

Abstract：Cytoplasmic male sterility （CMS） can significantly reduce the labor costs associated with artificial emasculation. In this study，the sterile alfalfa line MSGN-1A and its maintainer line MSGN-1B were utilized as experimental materials. The second-generation Illumina Hiseq sequencing technology，combined with third-generation PacBio sequencing technology and third-generation Naopore sequencing was employed to assist filling the gap. The mitochondrial genomes of the two materials were sequenced and assembled. Subsequently，a comparison and analysis of the mitochondrial genome structure and gene differences between the sterile line and the maintainer line were conducted.The results revealed that the mitochondrial genome sizes of MSGN-1A and MSGN-1B were 297 940 bp and 310 534 bp，respectively. Additionally，31 protein-coding genes，18 tRNA genes，and 3 rRNA genes were annotated in both materials. A significant number of SNPs and InDels were identified in both sterile lines and maintainers，which lead to the changes in the coding products of certain protein-coding genes. Furthermore，67 coded Open Reading Frames （ORFs） were predicted for MSGN-1A，while 71 ORFs were predicted for MSGN-1B. Among these ORFs，20 were specific to sterility lines with eight containing transmembrane domains.Finally，four protein-coding genes （atp8，nad4，rps3，and ccmFn） along with two ORFs （orf145a and orf135b） were identified as potential candidates related to cytoplasmic male sterility in alfalfa.

Key words：Alfalfa （Medicago sativa L.）;Cytoplasmic male sterility;Mitochondrial genome;Differential genes

收稿日期：2024-02-29;修回日期：2024-04-19

基金項(xiàng)目：科技創(chuàng)新2030-重大項(xiàng)目（2022ZD04012）資助

作者簡(jiǎn)介：

賈雪（1999-），女，漢族，遼寧沈陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事草種質(zhì)資源與遺傳育種研究，E-mail：1658380989@qq.com;* 通信作者Author for correspondence，E-mail：xubo0308@126.com

紫花苜蓿（Medicago sativa L.），是一種優(yōu)良的多年生的豆科牧草，堪稱(chēng)“牧草之王”，其具有良好的適口性、較高的蛋白質(zhì)含量和優(yōu)良的草種品質(zhì)被作為優(yōu)質(zhì)飼草在全世界許多地區(qū)廣泛種植?？梢岳秒s種優(yōu)勢(shì)增加紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)［1］，但是對(duì)于紫花苜蓿這類(lèi)雌雄同花，有性生殖且異花授粉的植物來(lái)說(shuō)，如何防止外源花粉的入侵和自花授粉則是這一類(lèi)植物進(jìn)行雜交育種的一個(gè)重要問(wèn)題［2］，利用雄性不育系進(jìn)行雜交制種則為紫花苜蓿的雜種優(yōu)勢(shì)利用開(kāi)辟了新途徑［3］。雄性不育系普遍存在于高等植物中，目前已經(jīng)在小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa L.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、棉花（Gossypium spp.）和甜菜（Beta vulgaris L.）等在內(nèi)的43科162屬617種或種間，發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象［4］。雄性不育系作為遺傳育種研究中的重要資源，利用其作為母本獲得雜交種子，不僅可以提高制種效率，提高種子產(chǎn)量，還可以極大的縮短育種年限。

目前通常會(huì)將雄性不育分成兩類(lèi)，一類(lèi)是由細(xì)胞核調(diào)控的雄性不育，我們稱(chēng)之為核不育型（nucleus male sterility，GMS）；另一類(lèi)是由細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)共同作用進(jìn)行調(diào)控的雄性不育，即核質(zhì)互作不育型（Cytoplasmic male sterility，CMS），也叫細(xì)胞質(zhì)雄性不育。細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性主要是由胞質(zhì)中的基因調(diào)控的，而在高等植物的細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞器中，線粒體作為供能中心，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量。與此同時(shí)線粒體的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以對(duì)外來(lái)的基因進(jìn)行整合，依據(jù)之前細(xì)胞質(zhì)基因組的研究結(jié)果表明，不育基因主要存在與線粒體上，一部分嵌合基因的改變或是形成了特有的ORF（Open reading frame，ORFs）都會(huì)影響植物的育性［5］。目前的研究先后發(fā)現(xiàn)了玉米中的orf346［6］，棉花中的orf610［7］，orf160a基因［8］，油菜中的orf138，orf288［9］，orf224基因［10］，小麥中的orf79基因和orf182基因［11］等多個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因，基于以上的研究人們也推測(cè)，植物的CMS主要是由線粒體DNA的突變和重組引起的，與重排產(chǎn)生的特異性前和基因密切相關(guān)，但對(duì)于紫花苜蓿線粒體與其細(xì)胞質(zhì)雄性不育之間的關(guān)聯(lián)卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用現(xiàn)有的紫花苜蓿不育系MSGN-1A和保持系MSGN-1B作為試驗(yàn)材料。對(duì)兩份材料的線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序并加以組裝和注釋?zhuān)治鰞上稻€粒體基因組的差異和線粒體基因組結(jié)構(gòu)上的變異，并篩選可能與紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的編碼基因及ORFs，為進(jìn)一步在分子水平上解釋紫花苜蓿雄性不育的敗育機(jī)理提供依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

用于進(jìn)行線粒體基因組測(cè)序和比較分析的MSGN-1A為紫花苜蓿雄性不育系，MSGN-1B為其對(duì)應(yīng)的保持系。均為2008年于洪柱等人［12］在紫花苜蓿品種‘公農(nóng)1號(hào)’‘公農(nóng)3號(hào)’和‘公農(nóng)3號(hào)’的衛(wèi)星搭載的后代中發(fā)現(xiàn)的紫花苜蓿雄性不育的新材料MS-GN品種的子代，將紫花苜蓿不育系及保持系的花蕾按照如圖1的狀態(tài)進(jìn)行時(shí)期的區(qū)分，保留花藥，用于提取RNA，MSGN-1A和MSGN-1B兩份材料種子及花蕾均獲取于吉林省長(zhǎng)春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)試驗(yàn)田。

1.2" 紫花苜蓿不育系及保持系測(cè)序材料的準(zhǔn)備

選取籽粒飽滿的干凈的紫花苜蓿不育系及保持系的種子，經(jīng)消毒后放置于MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗培養(yǎng)，培養(yǎng)至兩片子葉完全展開(kāi)時(shí)，剪下子葉置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，最后選取長(zhǎng)勢(shì)良好且無(wú)綠色芽點(diǎn)的愈傷組織分別混合后，經(jīng)液氮速凍，置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)樣品的送測(cè)。

1.3" 紫花苜蓿不育系及保持系線粒體基因組測(cè)序及組裝

研究采用全基因組鳥(niǎo)槍法（Whole Genome Shotgun，WGS）策略，建立了不同插入片段的文庫(kù)。使用了第二代測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS），采用Illumina Novaseq測(cè)序平臺(tái)。同時(shí)，還運(yùn)用了第三代單分子測(cè)序技術(shù)，使用PacBio測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并結(jié)合第三代Nanopore測(cè)序?qū)ap進(jìn)行填補(bǔ)。每個(gè)樣本分別構(gòu)建了3種文庫(kù)（見(jiàn)表1）。最終，根據(jù)參考基因組，確定了紫花苜蓿線粒體的起始位置和方向，得到了最終的紫花苜蓿線粒體基因組序列。這些測(cè)序服務(wù)均由南京派森諾基因科技有限公司完成。

1.4" 紫花苜蓿線粒體基因組組分分析

利用同源預(yù)測(cè)、tRNAscan-SE v2.0.7等軟件，對(duì)基因組中包含的ncRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過(guò)同源比對(duì)預(yù)測(cè)的方式，對(duì)樣本基因組進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。在NCBI上對(duì)線粒體參考基因組的蛋白序列進(jìn)行快速比對(duì)到樣本基因組。過(guò)濾不好的比對(duì)結(jié)果，去冗余，然后進(jìn)行人工過(guò)濾不好的比對(duì)結(jié)果，獲得高準(zhǔn)確性的保守基因集。使用getorf軟件對(duì)植物線粒體進(jìn)行全基因組ORFs掃描，設(shè)置的參數(shù)是：-table 1 -minsize 300（長(zhǎng)度閾值為100 aa）。使用軟件OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）將基因預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行可視化分析。利用軟件TMhmm 2.0，對(duì)ORFs的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.5" 紫花苜蓿線粒體基因功能注釋

在線粒體中預(yù)測(cè)得到的蛋白編碼基因與各種數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的蛋白質(zhì)進(jìn)行blastp比較，若該蛋白質(zhì)和數(shù)據(jù)中的某一蛋白質(zhì)具有顯著的序列相似性，則可以初步確定該蛋白具有和數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)具有相似甚至是相同的功能。常見(jiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)主要包括：NR庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），以及SwissProt庫(kù)（http：//www.ebi.ac.uk/uniprot/），eggNOG庫(kù)（http：//eggnogdb.embl.de/），外加KEGG庫(kù)（http：//genome.jp/kegg/）和GO庫(kù)（http：//geneontology.org/）。

1.6" 線粒體全基因組共線性、SNPs和InDels分析分析

用MUMmer v3.23軟件對(duì)MSGN-1A和MSGN-1B線粒體基因組進(jìn)行共線性分析，確定兩者間大范圍的共線性關(guān)系。找出潛在的SNP位點(diǎn)，再使用LASTZ軟件對(duì)兩份材料的線粒體基因組進(jìn)行比對(duì)，得到可能存在的InDel位點(diǎn)，并確定其易位區(qū)，倒置區(qū)及易位+倒置區(qū)。

1.7" 6個(gè)候選基因在紫花苜蓿花藥發(fā)育不同時(shí)期的qRT-PCR分析

使用Bio-rad CFX96 Touch PCR（Hamburg，Germany）和SYBR Green Realtime PCR Master Mix （Toyobo，日本）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析。以β-Actin基因作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)的基因表達(dá)水平。每個(gè)時(shí)期的樣品進(jìn)行三個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)，實(shí)時(shí)熒光定量引物見(jiàn)表2。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 紫花苜蓿線粒體基因組測(cè)序結(jié)果

2.1.1" 紫花苜蓿線粒體基因組序列分析" 對(duì)不育系MSGN-1A和保持系MSGN-1B的線粒體基因組分別進(jìn)行了測(cè)序。首先通過(guò)Illumina NovaSeq 6000測(cè)序，從MSGN-1A和MSGN-1B分別獲得3797.6 Mb和2535.3 Mb的過(guò)濾數(shù)據(jù)，在測(cè)序的原始數(shù)據(jù)占比96.37%和94.32%。MSGN-1A和MSGN-1B的Q30值分別為90.95%和89.92%。在而后的PacBio測(cè)序結(jié)果顯示，MSGN-1A和MSGN-1B過(guò)濾后的subreads數(shù)量分別為133 489和117 419，總大小分別為1 345 587 352 bp和1 377 144 050 bp。MSGN-1A的N50和N90分別為14 394 bp和6854 bp，subreads的平均長(zhǎng)度為11 728 bp，最長(zhǎng)的大小為47 555 bp；MSGN-1B的N50和N90分別為12 991 bp和5647 bp，subreads的平均長(zhǎng)度為10 080 bp，最長(zhǎng)的大小為42 670 bp。利用生物學(xué)軟件OGDRAW將MSGN-1A和MSGN-1B的線粒體基因組進(jìn)行組裝，分別得到大小為297 940 bp和310 534 bp的環(huán)狀基因組，GC含量分別為45.43%和45.21%（表3），經(jīng)可視化分析后，分別組裝成兩個(gè)沒(méi)有間隙的環(huán)狀基因組圈圖（圖2）。

2.1.2" 紫花苜蓿線粒體基因組注釋" 利用五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩份材料的線粒體基因組進(jìn)行注釋?zhuān)鍌€(gè)參考數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果顯示：NR和Swiss-Prot注釋的基因數(shù)量最多，GO和KEGG注釋到的基因數(shù)量最少，但注釋到的基因數(shù)目相同。GO注釋的結(jié)果如圖所示（圖3A，3B），兩份材料的大部分的基因均被聚類(lèi)到了生物的代謝過(guò)程中。而后利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩份材料的線粒體基因組進(jìn)行富集，結(jié)果顯示兩份材料大部分基因除富集到人類(lèi)疾病的基因外，其余基本都被富集到氧化磷酸化和代謝通路（圖3C，3D）。KOG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示絕大多數(shù)的基因功能注釋主要集中在能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換的過(guò)程中（圖3E，3F）。

2.1.3" 線粒體基因組組分分析" 經(jīng)過(guò)注釋后，在MSGN-1A中，共識(shí)別了31個(gè)蛋白編碼基因，67個(gè)orfs和21個(gè)非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNAs），在MSGN-1B中識(shí)別了31個(gè)編碼基因，71個(gè)orfs和20個(gè)ncRNAs，兩份材料識(shí)別到的這些ORFs都編碼超過(guò)100個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與此同時(shí)，通過(guò)注釋結(jié)果顯示二者均鑒定出相同的31個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（表4）。此外，MSGN-1A的線粒體基因組和MSGN-1B中分別預(yù)測(cè)出11個(gè)和20個(gè)特有的orfs。MSGN-1A線粒體基因組和MSGN-1B線粒體基因組的大多數(shù)基因參與編碼NADH-泛醌氧化還原酶、細(xì)胞色素bc1、細(xì)胞色素c氧化酶、ATP合酶、核糖體大亞基蛋白基因、胞嘧啶C基因、成熟酶基因和編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。

2.2" 紫花苜蓿線粒體基因組比較分析

2.2.1" 重復(fù)序列分析" 在紫花苜蓿不育系MSGN-1A和保持系MSGN-1B中都存在著大量的重復(fù)序列，其中以30～40 bp的重復(fù)序列數(shù)目最多，其次才是41～50 bp，101～500 bp，51～60 bp的重復(fù)序列（圖4），雖然短序列片段不存在有較高的活性，也引起不了基因組結(jié)構(gòu)和大小上過(guò)多的變化，但是它們卻也往往可以導(dǎo)致重組的產(chǎn)生。與此同時(shí)，小于100 bp的重復(fù)序列數(shù)目在不育系和保持系中差別不大，但二者在超過(guò)100 bp的重復(fù)序列的數(shù)量上存在著很大的差別。

利用軟件SSR Hunter，搜索不育系MSGN-1A和保持系MSGN-1B線粒體基因組中的存在的SSR點(diǎn)位，兩份試驗(yàn)材料線粒體基因組中的SSR數(shù)量為60～72個(gè)，其中兩堿基的重復(fù)在2份材料中差別不大，且它們均不存在五堿基的重復(fù)。而其他重復(fù)不育系則明顯少于保持系（圖5）。

2.2.2" 紫花苜蓿不育系及保持系序列共線性分析" 通過(guò)對(duì)不育系MSGN-1A和保持系MSGN-1B進(jìn)行了比較分析。在基因組大小方面，發(fā)現(xiàn)MSGN-1A的基因組大小比MSGN-1B小12 594 bp。共鑒定出20個(gè)共線序列塊，其中6個(gè)序列塊在MSGN-1A與MSGN-1B之間發(fā)生了反轉(zhuǎn)。排列順序發(fā)生了很多改變，MSGN-1B的長(zhǎng)度稍短。不育系相較保持系存在一定片段缺失。通過(guò)圖6的結(jié)果顯示，盡管兩者線粒體基因組的組成非常相似，但在不育系細(xì)胞質(zhì)和保持系細(xì)胞質(zhì)之間的線粒體基因組結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。

2.3" 紫花苜蓿線粒體基因組差異基因分析

2.3.1" SNPs和InDel統(tǒng)計(jì)及差異蛋白編碼基因分析" 通過(guò)對(duì)不育系MSGN-1A線粒體基因組和保持系MSGN-1B線粒體基因組中的蛋白編碼基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在MSGN-1A中鑒定出336個(gè)SNPs，有24個(gè)SNPs位于16個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，包括17個(gè)同義突變和7個(gè)非同義突變；312個(gè)SNPs位于非編碼區(qū)，蛋白質(zhì)編碼基因中的同義突變占總SNP的4.761，9%，非同義占總SNP的2.083 3%。rps10，atp8，nad4，rps3，ccmFn這五個(gè)基因包含5個(gè)非同義突變，cox1，ccmFc，rpl16，matR，nad3，rps4，rpl5，cob和rpl16這9個(gè)基因包含11個(gè)同義突變。與此同時(shí)，atp6和rps1包含的SNP最多，atp6包含4個(gè)同義突變，rps1包含1個(gè)非同義突變和2個(gè)同義突變。在所有的SNPs中，36.4%的SNPs都是A-G發(fā)生了顛換。以上的基因中，通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白的編碼基因更容易發(fā)生突變（表5）。

對(duì)MSGN-1A的線粒體基因組的InDel分析的結(jié)果顯示，共存在89個(gè)InDels，在蛋白質(zhì)編碼區(qū)存在一個(gè)InDel，為rps10基因的58 bp處存在一個(gè)6堿基的缺失，導(dǎo)致該基因的蛋白編碼產(chǎn)物缺少一個(gè)天冬酰胺和一個(gè)苯丙氨酸。其余88個(gè)InDels存在于非編碼區(qū)。其中53個(gè)為插入，35個(gè)為缺失。與此同時(shí)，對(duì)以上基因利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)atp8，nad4，rps3和ccmFn這4個(gè)基因具有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖7）。

2.3.2" 線粒體基因組ORFs預(yù)測(cè)" 預(yù)測(cè)不育系及保持系線粒體基因組的全部ORFs（≥300 bp）發(fā)現(xiàn)，MSGN-1A線粒體基因組中共預(yù)測(cè)到67個(gè)ORFs，MSGN-1B線粒體基因組共預(yù)測(cè)到71個(gè)ORFs，其中46個(gè)ORFs為MSGN-1A和MSGN-1B所共有（圖8A）；20個(gè)ORF為MSGN-1A所特有的；24個(gè)ORFs為MSGN-1B所特有的.其中，在保持系MSGN-1B中單拷貝69個(gè)，雙拷貝1個(gè)，不育系MSGN-1A中單拷貝66個(gè)，雙拷貝1個(gè)，兩份材料間的拷貝數(shù)相差不大（圖8B）。

2.3.3" 差異ORFs分析" 對(duì)于差異的ORFs的分析發(fā)現(xiàn)，由表6可知，測(cè)序結(jié)果顯示不育系包括20個(gè)獨(dú)特的orfs，而不育基因往往來(lái)源于不育系特有的ORFs。在20個(gè)不育系特有的ORFs中僅orf103d，orf217a，orf259a，orf145a，orf124b，orf112a，orf135b和orf387a以上8個(gè)orfs都具有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖10），其中orf145a和orf135b存在著嵌合結(jié)構(gòu)。orf145a在末端嵌合了154 bp的已知蛋白編碼基因nad2的序列，orf135b的基因組序列在44 bp處嵌合了168 bp的orf150a序列，與此同時(shí)該基因的357～408 bp與orf167a的前端重疊（圖9）。

2.3.4" 紫花苜蓿雄性不育候選基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析" 為了驗(yàn)證以上的4個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和2個(gè)orfs在紫花苜蓿不育系和保持系花藥各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式，對(duì)它們進(jìn)行了qRT-PCR的檢測(cè)，結(jié)果如圖11所示，對(duì)于4個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，除nad4基因在二時(shí)期的保持系的表達(dá)量高于不育系外，其余三個(gè)基因在不育系中的表達(dá)量均在不同時(shí)期高于保持系（以一時(shí)期作為空白對(duì)照）。測(cè)序得到的不育系特有orfs經(jīng)篩選后的得到的兩個(gè)orf135b和orf145a，qRT-PCR的結(jié)果顯示，二者在保持系的各時(shí)期中雖然也存在一定的低量表達(dá)或是不表達(dá)，但是在不育系中，均為呈現(xiàn)高表達(dá)。因此可以推測(cè)以上的6個(gè)基因可能是導(dǎo)致紫花苜蓿不育系MSGN-1A發(fā)生CMS的候選基因。

3" 討論

植物中的細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是作物形成雜交種的重要方式之一，大量的分子生物學(xué)研究指出CMS在一定程度上是線粒體基因組中序列的重組與重排引起的［13］。高等植物的線粒體基因組非常龐大的，而且不同物種之間的基因組大小也是從200 kb到2500 kb不等［14-15］。線粒體自己具有一整套獨(dú)立的基因組，可以與細(xì)胞核內(nèi)的基因共同調(diào)控和編碼線粒體自身所需要的各種蛋白和酶類(lèi)，線粒體也是細(xì)胞中的主要供能場(chǎng)所，有性生殖植物的花粉粒的發(fā)育過(guò)程中都需要很多能量來(lái)維持，如果線粒體的功能發(fā)生了問(wèn)題，就會(huì)導(dǎo)致無(wú)法供能或是過(guò)度產(chǎn)能問(wèn)題，而這些問(wèn)題都可能導(dǎo)致花粉出現(xiàn)敗育的情況。同時(shí)在CMS特殊區(qū)域中的線粒體基因組的重排與重組，也會(huì)產(chǎn)生許多新的開(kāi)放閱讀框（ORFs）、嵌合結(jié)構(gòu)或者與已知的基因產(chǎn)生共轉(zhuǎn)錄，而這些新的ORFs通常也會(huì)影響線粒體的正常代謝功能，這通常也是導(dǎo)致植物發(fā)生CMS的常見(jiàn)原因之一［16］。本研究通對(duì)紫花苜蓿雄性不育系MSGN-1A及其對(duì)應(yīng)的保持系MSGN-1B進(jìn)行了線粒體全基因組測(cè)序并對(duì)其進(jìn)行組裝，分別獲得了297 940 bp和310 534 bp的線粒體全基因組。然后對(duì)兩個(gè)基因組進(jìn)行比對(duì)。篩選出了一部分可能與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的候選開(kāi)放閱讀框（ORFs）和已知的編碼基因。

高等植物的線粒體基因組具有節(jié)奏相對(duì)較快，重排率較高的特點(diǎn)。這個(gè)特點(diǎn)表明線粒體的結(jié)構(gòu)變換頻率和重排率要遠(yuǎn)高于葉綠體甚至是其他動(dòng)物的線粒體，甚至是在植物的不同亞種之間的線粒體基因組結(jié)構(gòu)之間也會(huì)有著很大的差別，存在著一些非常明顯的分子間和分子內(nèi)重組［17］。這也使得線粒體基因組哪怕是在同一物種的不育系和同源保持系之間也可能存在著一定的差異。因此本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)MSGN-1A及其保持系MSGN-1B的線粒體基因組進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)二者的基因組在大小上存在著一定的差異，還有一定的序列排列順序的改變以及反轉(zhuǎn)等，不育系的線粒體基因組較保持系基因組稍小，可能與二者間存在著許多的InDels以及ORFs基因類(lèi)型的差異有關(guān)，與此同時(shí)在不育系MSGN-1A的31個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中鑒定出7個(gè)非同義突變SNPs，分別位于6個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，其中也發(fā)現(xiàn)4個(gè)存在跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白編碼基因（atp8，nad4，rps3和ccmFn）在兩份材料中編碼產(chǎn)物發(fā)生了變化，因此這些非同義突變也可以被作為篩選導(dǎo)致紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的候選基因的條件之一。同時(shí)在對(duì)兩份材料的特有ORFs進(jìn)行比較分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)不育系中的兩個(gè)特有orfs，orf145a和orf135b兩個(gè)基因，在不育系特有的前提下，還存在著跨膜結(jié)構(gòu)域和與功能基因的嵌合結(jié)構(gòu)，因此將以上兩個(gè)orfs也作為能夠?qū)е伦匣ㄜ俎Ｐ坌圆挥暮蜻x基因之列，通過(guò)對(duì)以上的基因在紫花苜蓿花藥發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行qRT-PCR分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的推測(cè)，在日后通過(guò)原核表達(dá)以及擬南芥或是紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化，對(duì)以上的候選基因的具體功能加以驗(yàn)證。

4" 結(jié)論

目前在主要糧食作物水稻中的CMS-WA型不育究竟是如何與其核編碼的線粒體蛋白相互作用，導(dǎo)致不育以及如何與CMS的恢復(fù)基因相互作用的復(fù)雜分子機(jī)制已經(jīng)研究清晰，而目前對(duì)于紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的理論研究還是稍落后于其他主要栽培農(nóng)作物，還不夠完整深入，具體的不育機(jī)理尚未能夠完全結(jié)實(shí)清楚，還需要更進(jìn)一步的研究。本課題組前期通過(guò)BSR法將紫花苜蓿雄性不育系與恢復(fù)系的相關(guān)基因定位比對(duì)后發(fā)現(xiàn)MsJMT基因和MsGal基因［18-20］后經(jīng)過(guò)一系列的功能驗(yàn)證，認(rèn)定這兩個(gè)基因?yàn)閷?dǎo)致紫花苜蓿雄性不育的基因，后又通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)了紫花苜蓿雄性不育基因MsGDS［21］和MsPL［22］。但目前對(duì)于線粒體雄性不育基因關(guān)注較少，本研究對(duì)紫花苜蓿雄性不育系MSGN-1A和MSGN-1B的線粒體全基因組測(cè)序并進(jìn)行比較，挖掘可能與旨在為解析核質(zhì)互作不育的機(jī)理方面提供細(xì)胞質(zhì)部分候選基因的方面奠定一定的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯" 劉婷婷）