基于X 射線熒光光譜分析水稻籽粒離子組

摘要： 【目的】水稻籽粒離子組通常采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS） 和電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICPOES）等技術(shù)進行分析，需要破壞性取樣且樣品前處理過程復雜。X 射線熒光光譜法（XRF） 一般無需進行樣品處理，可以快速無損地檢測樣品中的元素含量。本研究建立和優(yōu)化了利用XRF 進行水稻籽粒離子組分析的方法。【方法】通過比較不同的試驗條件對水稻籽粒中不同元素XRF 譜圖的影響，確定適合進行XRF 分析的元素及試驗條件，通過與ICP-MS 定量結(jié)果的相關(guān)性分析，檢驗XRF 定量方法的適用性、定量結(jié)果的準確性。【結(jié)果】在樣品室抽真空時，光源在30 kV 和 600 μA 并且不使用濾光片的條件下，使用50 μm 步長面掃描時，樣品中的P、S、Cl、K、Ca、Mn、Fe 和Zn 等元素信號與背景對比明顯。同時，XRF 掃描獲得的Mn 和Zn 的熒光定量結(jié)果與ICP-MS 的測定結(jié)果具有較高的相關(guān)性，線性擬合的決定系數(shù)分別為0.8415 （Plt;0.001） 和0.7736（Plt;0.001）。采用優(yōu)化的分析條件，水稻籽粒中Cd 的兩條特征譜線La 和Ka 分別受到K 和Mn 信號的壓抑，不能用于Cd 含量的定量分析?！窘Y(jié)論】采用優(yōu)化的試驗條件，XRF 方法可以無損地同時測定稻米中多個營養(yǎng)元素，特別是鋅和錳。但由于Cd 特征圖譜與稻米中含量較高的K 和Mn 接近，信號無法清楚識別，因此，XRF 儀無法快速測定水稻籽粒中Cd 含量是否超標。

關(guān)鍵詞： 水稻； 籽粒離子組； X 射線熒光； 電感耦合等離子體質(zhì)譜； 無損分析

水稻（Oryza sativa L.） 是重要的糧食作物之一，為全球一半以上的人口提供淀粉、蛋白質(zhì)和必需礦質(zhì)營養(yǎng)元素。亞洲人口每天卡路里攝入量的75% 來自大米，雖然一般大米品種礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量并不豐富，但它仍然為人們提供一定量的熱量、維生素和礦物質(zhì)[1]。礦物質(zhì)直接或間接地影響人類的新陳代謝及生理過程，人體礦質(zhì)營養(yǎng)元素攝入不足可能會導致多種功能障礙和疾病，導致所謂的“隱形饑餓”[2]。據(jù)統(tǒng)計，世界上大約有60% 的人口鐵缺乏，超過30% 的人口鋅缺乏，而缺鐵會導致貧血，缺鋅則會導致生長遲緩和智力遲鈍[3]。生物強化育種可以有效地增加主食中礦質(zhì)元素的含量，被認為是解決人體微量元素攝入不足的一種低成本和可持續(xù)的方法[4]。要開展水稻的礦質(zhì)元素強化育種，首先需要對大量育種材料的籽粒礦質(zhì)營養(yǎng)元素和有毒有害元素的含量進行快速準確地檢測，特別是對一些珍貴且稀有的樣本，開發(fā)一種無損快速的檢測技術(shù)非常有必要。

水稻籽粒離子組是指水稻籽粒中所有礦質(zhì)營養(yǎng)元素和微量元素的總和，既包括了磷（P）、硫（S）、鉀（K）、鈣（Ca） 等大量和中量元素，也包括鐵（Fe）、鋅（Zn）、硒（Se）、銅（Cu）、錳（Mn） 等人體必需的微量元素以及鎘（Cd）、砷（As） 等有毒有害元素[5?6]。目前水稻籽粒中礦質(zhì)元素含量的檢測技術(shù)主要有原子吸收光譜技術(shù)[7] （flame atomic absorption spectrometry，F(xiàn)AAS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)[8] （inductivelycoupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)[9] （inductively coupled plasmaoptical emission spectroscopy，ICP-OES），這些技術(shù)需要將待測部位從整株中分離、研磨、加酸消解。前處理方法復雜，容易引起離子污染，此外由于樣品的消解導致元素的原位分布信息丟失，且原始的樣品也無法繼續(xù)用于繁種。相比于傳統(tǒng)的化學技術(shù)，X 射線熒光光譜技術(shù)[10?11] （X-ray fluorescence，XRF）具有制樣簡單、檢測成本低、無損檢測、分析速度快、可同時檢測多種元素、結(jié)果重復性好、不改變元素形態(tài)以及可以檢測元素的原位分布等特點[12?14]，在農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應用[15?18]。

XRF 技術(shù)的原理是當原子核周圍的低能態(tài)電子受到一定能量的X 射線照射躍遷到高能態(tài)，低能態(tài)電子軌道上會產(chǎn)生空位，于是高能態(tài)電子會自動躍遷到低能態(tài)填補空位，兩個軌道的能量差以二次X射線的形式釋放，不同元素所釋放的二次射線具有各自的特征，通過檢測二次X 射線的特征和強度，可以確定元素的種類以及該元素的含量[12]。有研究者利用XRF 技術(shù)研究不同植物組織中部分元素的含量[16?17]和分布[19?21]，但定量分析時對樣品進行研磨，無法保持樣品的結(jié)構(gòu)完整性，元素的原位分布結(jié)果雖然直觀，但無法得到元素的定量結(jié)果。本研究旨在確定利用 XRF 技術(shù)快速無損分析水稻籽粒中元素含量的條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用水稻粳稻品種‘中花11’的籽粒進行XRF 參數(shù)比較。選用19 份不同水稻品種籽粒樣品進行XRF 熒光值與ICP-MS 測定的元素含量的相關(guān)分析。上述品種均種植于南京農(nóng)業(yè)大學白馬基地無Cd 污染水稻田塊。Cd 污染稻米樣品來源于江蘇常熟某地Cd 污染田塊和未污染田塊種植的水稻品種‘常農(nóng)粳12 號’。

1.2 試驗儀器

X 射線熒光光譜儀（M4 Tornado plus，BRUKER），未裝雙曲面彎晶光學晶體，配備了30 W Rh 靶X 射線光管（最大工作電壓50 kV，最大工作電流600 μA，光斑直徑20 μm） 和兩個60 mm2 硅漂移探測器（能量分辨率lt; 145 eV@600000 cps），儀器工作距離9 mm，點掃描時積分時間30 s，面掃描時像素積分時間2 ms，其他參數(shù)見1.3 試驗設(shè)計。

1.3 籽粒樣品處理及分析

手工剝離稻殼獲得供試糙米樣品。先將‘中花11’的籽粒樣品固定在載物臺上，分別用點、面兩種模式掃描，以確定后續(xù)樣品的掃描方式和參數(shù)。

點掃描：樣品置于真空條件下，光源在50 kV電壓和600 μA 電流且不加濾光片，分別從樣品環(huán)境（真空環(huán)境0.2 Kpa 和非真空環(huán)境100 KPa），濾光片（不使用濾光片，以及使用厚度分別為12.5、25 和100 μm 的鋁濾光片），光源電流（光源電流分別為200、400、600 μA），光源電壓（光源電壓分別為30、40、50 kV） 4 個方面篩選。面掃描：經(jīng)篩選后，在樣品室抽真空，設(shè)定光源為30 kV 和600 μA 并且不使用濾光片條件下，分別采用10、20、50、75、100 μm 步長對同一樣品的5 個籽粒進行面掃描，計算各元素的XRF 定量分析結(jié)果，并比較定量結(jié)果的變異系數(shù)，確定用于定量研究的最佳掃描步長參數(shù)。采用確定的掃描參數(shù)對19 份水稻籽粒樣品進行面掃描。用儀器自帶軟件，依據(jù)19 份水稻品種籽粒樣品的相對熒光強度，得到各元素的定量分析結(jié)果。

然后，每個糙米樣品選5 粒（約0.1 g） 置于消煮管內(nèi)，加入5 mL 優(yōu)級純濃硝酸，置于石墨消解儀（DigiPREP MS，SCP SCIENCE） 上消解。消解程序如下：采取程序升溫的方式，首先升溫至115℃，保持3 h；繼續(xù)升溫至180℃，最終獲得少量澄清淺黃色油狀液體，用2% 硝酸定容至10 mL，離心轉(zhuǎn)移后，用電感耦合等離子質(zhì)譜分析儀（ICP-MS， PerkinElmer Nexion 300 X） 測定元素含量，每個樣品測定3 次。用ICP-MS 測定上述19 份水稻籽粒中的元素含量。

隨機選取200 ?！谢?1’野生型籽粒，其中100粒不進行掃描作為對照組，另100 粒用試驗篩選的掃描條件掃描之后作為處理組，進行發(fā)芽試驗，測定發(fā)芽率，每組處理3 個重復。

1.4 數(shù)據(jù)處理

元素的譜線圖和實時熒光圖通過儀器自帶分析軟件M4 Tornado 獲取。所有樣品籽粒同時進行面掃描，然后計算每個樣品籽粒中不同元素的含量。XRF和ICP-MS 定量結(jié)果，采用Excel （Office 2016） 計算平均值、標準誤差、變異系數(shù)及決定系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗參數(shù)對XRF 譜圖的影響

2.1.1 樣品室真空度

樣品在真空環(huán)境（0.2 KPa）下，輕質(zhì)元素Si、P、S 的信號值分別較非真空環(huán)境（100 KPa） 提高了7、26、18 倍，Cl 元素在非真空環(huán)境下不出峰，真空環(huán)境下信號值也大幅提高，礦質(zhì)元素K、Zn、Fe、Mn、Ca 的信號值略有提高，但提高幅度沒有輕質(zhì)元素大（圖1）。表明真空環(huán)境降低了空氣介質(zhì)對熒光信號的吸收，特別是降低了對輕質(zhì)元素熒光信號的影響[22]。所以，多元素同時檢測應盡量在真空環(huán)境下進行。

2.1.2 光源濾光片

濾光片位于X 射線光源和多導毛細管入口之間，適當使用濾光片可以提高金屬元素的信噪比和檢出限，但是也會使所有元素的信號響應值明顯下降[23]。當增加濾光片厚度之后，所有元素的信號值都會隨之降低，但相對來說對輕質(zhì)元素的影響更大[24]。相對于不使用濾光片，濾光片不同程度地降低了元素的信號值（圖2）。使用100 μm Al 濾光片后，各元素的信號值下降幅度從96% 到29%，其中P 和S 元素下降幅度最大為96%，Zn 元素下降幅度最小為29%。因此，多元素分析不使用濾光片。

2.1.3 光源電流強度

元素的信號值隨著光源電流強度的增大而增大。與200 μA 光源相比，采用600 μA光源，所有元素的信號值均提高，其中，P 元素的信號值提高了1.4 倍，F(xiàn)e 元素提高了3.1 倍，Zn 元素提高了1.8 倍（圖3）。因此，采用儀器能達到的最高工作電流600 μA，以提高元素檢測的識別率和靈敏度。

2.1.4 光源電壓

改變光源工作電壓，除Zn 外的其他各元素的信號值沒有特別明顯的變化（圖4）?？紤]到光源使用壽命，后續(xù)試驗選擇能激發(fā)600 μA 工作電流的最小電壓30 kV。

2.1.5 掃描步長

圖5 結(jié)果表明，采用的掃描步長越小，圖像分辨率越高，所用時間也越長。其中Si 元素在樣品區(qū)域的含量遠低于背景，可能是背景如載物臺中Si 元素含量相對樣品區(qū)域較高，因此面掃描方法不適宜于Si 元素定量分析。

使用不同掃描步長，對同一樣品的5 個籽粒同時進行面掃描，計算各元素的XRF 定量分析結(jié)果，其變異系數(shù)如表1 所示。在50 μm 掃描步長下，S、Cl、Mn、Fe 和Zn 元素的定量結(jié)果變異系數(shù)最小，而K、P 和Ca 在20 μm 掃描步長下變異系數(shù)最小。因此，在50 μm 掃描步長條件下，大部分元素的定量結(jié)果重復性都較好。綜合考慮圖像分辨率、掃描時間以及定量結(jié)果重復性，后續(xù)采用50 μm 掃描步長作為面掃描的試驗條件。

2.2 XRF 法掃描水稻籽粒光譜結(jié)果

采用優(yōu)化后的參數(shù)，對水稻品種‘中花11’同一株上的5 粒水稻籽粒進行XRF 面掃描。在50 μm 掃描步長下，得到樣品區(qū)域和背景區(qū)域整體XRF 譜圖（圖6A）。然后選擇面積接近的樣品區(qū)域和背景區(qū)域，分別生成XRF 譜圖，并將兩者譜圖相減得到差值譜（圖6B），從結(jié)果可知，水稻籽粒中P、S、Cl、K、Ca、Mn、Fe 和Zn 元素對比背景有明顯的信號差異，表明可以利用XRF 對這些元素進行分析。

2.3 XRF 與ICP-MS 測定結(jié)果的相關(guān)性分析

這19 個品種由于遺傳背景和種植環(huán)境等差異導致籽粒中元素的含量存在差異。首先利用XRF 方法，在面掃描模式下，樣品室抽真空時，光源在30 kV和600 μA 并且不使用濾光片的條件下，用50 μm 掃描步長獲得P、S、Cl、K、Ca、Mn、Fe 和Zn 的熒光強度值。同時，用ICP-MS 測定19 個品種水稻籽粒中上述元素P、S、K、Ca、Mn、Fe 和Zn 的含量，并分析二者的相關(guān)性（圖7）。由于Cl 元素無法使用ICP-MS 準確定量，無法計算兩種方法測定的Cl 元素含量相關(guān)性。

結(jié)果表明，兩種方法測定的Mn 和Zn 含量值呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系，線性擬合的決定系數(shù)分別為0.8415（Plt;0.001） 和0.7736 （Plt;0.001） （圖7）。而XRF 掃描獲得P、S、K、Ca、Fe 的熒光信號值與ICP-MS 測定得到的元素含量相關(guān)性較弱或者不存在相關(guān)性，線性擬合的決定系數(shù)分別為0.4546 （P = 0.002）、0.2029（P = 0.051）、0.4434 （P = 0.002）、0.3465 （P = 0.008）和0.0004 （P = 0.939）。其中，S 的XRF 熒光強度與ICP-MS 測定的S 含量存在負相關(guān)關(guān)系，可能由于所使用的條件不適合于掃描籽粒中S 元素，同時也可能因為利用ICP-MS 測定籽粒中S 的含量準確度不高，因為ICP-MS 測定S 用的32S 與氧（O2） 的質(zhì)荷比非常接近，信號值受反應器中的氧影響較大。因此，XRF 快速定量方法可用于水稻籽粒中Mn 和Zn 元素含量的快速無損檢測。

2.4 利用XRF 對Cd 污染水稻籽粒進行掃描分析

為研究X 射線熒光光譜儀（M4 Tornado plus，BRUKER） 是否可以用于無損測定水稻籽粒Cd 的超標，本研究選用了種植于Cd 污染農(nóng)田和非污染農(nóng)田的水稻品種常農(nóng)粳12 號各3 份材料。通過ICP-MS測定，Cd 污染農(nóng)田收獲的3 份樣品籽粒Cd 含量為0.683～0.944 mg/kg，超過國家稻米Cd限量值（0.2mg/kg） 3～4 倍，而非污染農(nóng)田收獲的3 份樣品籽粒Cd 含量為0.019～0.034 mg/kg （圖8A），超標的3 份樣品和未超標的3 份樣品稻米Cd 含量相差32 倍。

在面掃描模式下，將樣品室抽真空，設(shè)置光源在30 kV 和600 μA 并且不使用濾光片，用50 μm 掃描步長對上述6 份樣品進行XRF 掃描，每份樣品掃描6 個籽粒（圖8B）。Cd 元素主要的特征譜線有兩條，分別為Lα 線和Kα 線，其中Lα 線與K 元素的特征譜線非常接近。其中K 元素Kα 線位于3.313 keV，而Cd 元素Lα 線位于3.132 keV。而且K 是大量元素，Cd 的Lα 線信號容易受到K 元素信號的影響，故只能使用Cd 的Kα 線，而在譜圖中Cd 的Kα 線處沒有明顯的信號峰（圖8C），這說明Cd 的樣品信號與背景信號不能有效區(qū)分。計算Cd 污染籽粒與未污染籽粒的XRF 差值譜，發(fā)現(xiàn)兩者譜圖主要表現(xiàn)為Mn 元素信號差異（圖8D）。因此，在水稻籽粒Cd 超標2～3 倍左右的水平上，本研究選用的X 射線熒光光譜儀（M4 Tornado plus，BRUKER） 不能用于快速檢測水稻籽粒中Cd 是否超標。

2.5 XRF 掃描對水稻種子發(fā)芽的影響

篩選水稻種子中元素含量發(fā)生改變的突變體，是定位和克隆控制元素在水稻籽粒積累相關(guān)基因和解析籽粒元素積累分子機理的重要手段。相對于FAAS、ICP-MS、ICP-OES 等需要對種子樣品進行破壞性消解后再進行定量測定，XRF 的優(yōu)點是可以對種子進行無損檢測。但是經(jīng)過XRF 掃描的水稻種子能否正常萌發(fā)以繁殖足夠的種子進行驗證和后續(xù)遺傳分析，將決定了是否可以利用XRF 掃描的方法，對通過誘變獲得的當代突變體種子進行元素含量突變體篩選。為了檢測經(jīng)過XRF 掃描是否影響水稻種子的萌發(fā)，對XRF 掃描之后的‘中花11’種子進行發(fā)芽試驗。未經(jīng)過XRF 掃描的‘中花11’種子發(fā)芽率為95.3%±2.08%，而采用光源在30 kV 和600 μA并且不使用濾光片時，進行50 μm 步長面掃描之后的種子發(fā)芽率為95.3% ± 1.53%，與未掃描種子的發(fā)芽率不存在顯著差異（Pgt;0.05）。上述結(jié)果表明XRF儀器的X 射線對中花11 種子發(fā)芽率沒有任何影響，經(jīng)XRF 掃描后的種子可以正常萌發(fā)。因此，XRF 適用于對當代收獲突變體種子進行元素含量突變體篩選，而無需像基于FAAS、ICP-MS、ICP-OES 等破壞性篩選方法需要對突變體進行1～2 代的繁種以獲得純合突變種子才可以進行篩選，節(jié)約了工作量和時間成本。

3 討論

近年來，由于X 射線熒光光譜技術(shù)眾多的優(yōu)越性和廣泛的適應性，已在環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品及其產(chǎn)地質(zhì)量探測等方面廣泛應用。但是由于X 射線光源的限制，配備常規(guī)Rh 光源的儀器無法檢測到水稻籽粒中的輕質(zhì)元素，而對Si、P、Cl、S、K、Ca、Mn、Fe、Zn 元素的信號響應較好。同時，在水稻籽粒Mn 和Zn 元素的快速定量研究中，XRF 法與ICPMS法測定結(jié)果相關(guān)性較好，可作為這兩種元素育種材料鑒定篩選的一種方法。而且水稻籽粒在經(jīng)過優(yōu)化的試驗條件下掃描后，發(fā)芽率沒有任何變化，說明儀器光源產(chǎn)生的X 射線在工作時間內(nèi)對籽粒的發(fā)芽率沒有影響，XRF 測定方法可應用于水稻籽粒離子組突變體材料的篩選。

XRF 法在元素定量應用方面也有一些不足。如大量元素K 和Ca，XRF 法與ICP-MS 法定量結(jié)果之間并沒有很好的相關(guān)性。特別是Ca 元素，其XRF信號值與ICP-MS 測定的含量之間相關(guān)性較差，可能與樣品形態(tài)、元素在籽粒中的空間分布以及XRF 光源在樣品中的穿透厚度等因素有關(guān)。有研究表明，谷類作物籽粒發(fā)育中各微量元素的分布規(guī)律不盡相同[25]，大量元素K 的移動性較大，精米中的含量達到穎殼中的52.5%～90.6%。中量元素鈣在穎殼中含量非常高，而其他元素最高含量均在糊粉層[ 2 1 ]，XRF 的穿透性有限，對分布在籽粒表面的元素更為適用，對于胚中含量較高的元素則不能準確的測定，所以這可能是某些元素如Ca 和K 的XRF 掃描定量結(jié)果與ICP-MS 測定結(jié)果相關(guān)性不高的原因之一，其他原因還需要進一步研究。另外有研究顯示，樣品的含水量也會影響定量結(jié)果[24]，但是試驗中所用到的水稻籽粒材料保存條件相同，可認為其含水量基本一致，所以并沒有開展該項研究。

基于同步輻射的XRF 可以顯著提升元素定量分析的準確性，尤其是配備了Maia 高性能熒光檢測系統(tǒng)的XRF 儀[ 2 6 ]。比如，通過基于同步輻射的微區(qū)X 射線熒光（SR-mXRF） 對50 份稻米籽粒橫切面的元素進行掃描，發(fā)現(xiàn)所獲得的相對熒光值與ICP-MS 測定的含量具有較高的相關(guān)性，尤其是對于原子序數(shù)較大的元素[27]。其中Cu 和Zn 的SR-mXRF 熒光值和ICP-MS 測定含量值之間的一致性最高，斜率接近1。As 和Mn 在SR-mXRF 和ICP-MS 之間也表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，且準確性較高（As 斜率=0.46， Mn斜率=0.58）。K 和S 在SR-mXRF 和ICP-MS 數(shù)據(jù)之間表現(xiàn)出弱相關(guān)性（R2lt;0.1 或Pgt;0.1）。Fe 和P 在兩種方法之間均未表現(xiàn)出相關(guān)性。在SR-mXRF 測量中觀察到了Ca，但ICP-MS 的回收率較差（12%），無法進行比較。在SR-mXRF 測量中也觀察到了Si，但其在參考材料中的濃度未經(jīng)認證，且石英載玻片中的硅影響了定量結(jié)果，導致SR-mXRF 測定結(jié)果不準。以上結(jié)果表明，采用亮度更高的光源以及性能更強的檢測器都能提高XRF 檢測的靈敏度和定量結(jié)果的準確性。但是由于同步輻射光源結(jié)構(gòu)復雜，造價昂貴，并不適合在普通實驗室推廣使用，因此，應用范圍受到了一定局限。

對稻米Cd 超標的快速檢測是目前開展重金屬污染阻控研究的一個重要方向。我們發(fā)現(xiàn)即使稻米Cd超標3～4 倍的情況下，利用本實驗室購買的X 射線熒光光譜儀（M4 Tornado plus，BRUKER） 對稻米進行掃描仍很難區(qū)分Cd 超標和未超標的樣品。這主要由于Cd 的兩條XRF 特征譜線Lα 線和Kα 線中的Lα 線與K 元素的特征譜線非常接近（K 元素Kα 線位于3.313 keV，Cd 元素Lα 線位于3.132 keV）。由于水稻籽粒中K 的含量通常遠高于Cd 含量，因此，Cd 的Lα 線信號極易受到K 信號的影響，從而無法檢出。而Cd 的Kα 線在XRF 圖譜中的信號值很弱，也無法用于對Cd 進行定性或者定量分析。因此，未裝備雙曲面彎晶光學晶體的X 射線熒光光譜儀無法應用于高通量檢測稻米Cd 的超標情況。目前，市面多款XRF 儀器通過裝備單色和聚焦光學器件雙曲面彎晶光學晶體，可以將設(shè)備信噪比大幅提高，使得與傳統(tǒng)能量色散X 射線熒光技術(shù)（EDXRF） 相比的檢測精度大大提升，可以應用于稻米Cd 超標的快速篩查。

4 結(jié)論

利用XRF 掃描，可以無損并同時檢測P、S、K、Fe、Mn、Zn、Ca 元素含量，不適宜測定Si、Cl、Cd 含量。最適合的測定條件為：樣品室處于真空狀態(tài)，XRF 光源為30 kV、600 μA，不使用濾光片，在50 μm 步長下進行面掃描。XRF 掃描對水稻種子發(fā)芽率無不良影響。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2023YFC3708104）；常熟市耕地質(zhì)量提升技術(shù)支撐服務(wù)項目（JSJY-Z2021D002）。