馬鈴薯根際耐鹽堿細(xì)菌T11的篩選及促生效果研究

摘 要：為了篩選馬鈴薯根區(qū)的耐鹽堿細(xì)菌，探索其促生效果，本研究以馬鈴薯根區(qū)土壤細(xì)菌為研究對象，通過劃線法分離細(xì)菌，設(shè)置不同NaCl濃度（100 g/L、120 g/L、140 g/L、160 g/L、180 g/L）和pH梯度（9、10、11、12、13、14），篩選馬鈴薯根際耐鹽堿細(xì)菌。利用27F/1492-R引物鑒定細(xì)菌的種類，通過測定細(xì)菌的生長曲線、去鹽去堿和解鉀效果、產(chǎn)IAA和產(chǎn)蛋白酶能力，綜合分析其促生效果。結(jié)果表明：隨著pH值的升高，細(xì)菌的耐性不同，當(dāng)pH為13，NaCl濃度為160 g/L時(shí)，T11細(xì)菌存活，其他細(xì)菌不生長；促生效果結(jié)果表明，T11菌株具有產(chǎn)IAA、解鉀和產(chǎn)蛋白酶能力，去鹽堿效果較弱。本研究篩選得到的T11菌株為芽孢桿菌，具有促生效果，為馬鈴薯專用菌肥開發(fā)奠定微生物基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；耐鹽堿細(xì)菌；篩選鑒定；促生效果

中圖分類號：S144.2" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）11-0000-00

收稿日期：2024-01-10 修回日期：2024-02-08

基金項(xiàng)目：陜西省高校科協(xié)青年人才托舉計(jì)劃項(xiàng)目，榆林風(fēng)沙草灘區(qū)植物根區(qū)耐鹽耐堿菌株的篩選和應(yīng)用（20210211）。

第一作者簡介：艾靜（1990-），女，碩士，研究方向?yàn)樽魑镌耘嗯c耕作。

通信作者：郭亞寧。

Screening of Saline-alkali Tolerant Bacteria T11 in Potato Rhizosphere and" Their Growth Promotion Effect

AI Jing， GUO Yaning， ZHANG Siyu， LI Ribing， WANG Fugang

（College of Life Science， Yulin University， Yulin， Shannxi 719000， China）

Abstract：" In order to screen the saline-tolerant bacteria in the potato root zone and explore their growth-promoting effects， bacteria were used as subjects and isolated by the plate streak method. Different NaCl concentrations （100 g/L， 120 g/L， 140 g/L， 160 g/L， 180 g/L） and pH gradients （9， 10， 11， 12， 13， 14） were set to screen saline-tolerant bacteria in the potato rhizosphere. The 27F/1492-R primers were used to identify the species of bacteria， and their growth-promoting effects were analyzed by measuring the growth curve， the effect of removing salt and alkali， and the ability to produce IAA and protease. The results showed that with the increase of pH value， the tolerance of the bacteria varied. When pH was 13 and the NaCl concentration was 160 g/L， the T11 bacteria survived， while the other bacteria did not grow. The results of the growth promotion assays showed that T11 had the ability to produce IAA and protease， but the effect of removing salt and alkali was weak. The T11 strain belongs to the genus Bacillus and has a growth-promoting effect， laying a foundation for the development of a specialized bacterial fertilizer for potatoes.

Key words：Solanum tuberosum; Saline-alkali toleranted bacteria; Screening and identification; Promotion

榆林市地處陜西北部，土壤沙質(zhì)、晝夜溫差大，是我國馬鈴薯五大優(yōu)生區(qū)之一[1～4]。榆林市北部為風(fēng)沙草灘區(qū)，土地面積遼闊，占全市總土地面積的78.2%，該區(qū)域地下水位低，具備灌水條件，土壤大部分為鹽堿土，是馬鈴薯種植的優(yōu)良區(qū)域，馬鈴薯在該區(qū)域的種植面積逐年擴(kuò)大[5， 6]。馬鈴薯對水肥敏感，高水肥條件下可以促使馬鈴薯高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)，然而化學(xué)肥料的大量使用，導(dǎo)致土壤酸堿度變化，土壤板結(jié)，土壤質(zhì)量下降[7]。為了實(shí)現(xiàn)農(nóng)田的可持續(xù)利用，土壤友好型專用肥料的開發(fā)及應(yīng)用迫在眉睫。

微生物肥料包含微生物菌劑、生物有機(jī)肥和復(fù)合微生物肥料3種類型，其中微生物菌劑包含對植物生長有益的活體微生物，不僅促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高作物的抗逆性和產(chǎn)量，同時(shí)起到減肥增效的作用，是一種環(huán)境友好型生物肥料，目前在玉米[8]、水稻[9]、大豆[10]、馬鈴薯[11]等作物中均具有較好的促生效果。

馬鈴薯根際土壤微生物豐富度和土壤理化性質(zhì)、馬鈴薯產(chǎn)量及馬鈴薯的抗病性之間呈現(xiàn)密切的關(guān)系[12～14]，然而馬鈴薯微生物菌劑的使用集中于已有微生物的利用，對于馬鈴薯根際共生細(xì)菌的分離、鑒定與應(yīng)用較少。本研究以馬鈴薯根區(qū)土壤微生物為研究對象，基于Gibbson改良固體培養(yǎng)基，分離純化不同菌株，通過設(shè)置不同的NaCl和pH梯度，篩選耐鹽堿細(xì)菌，通過分析耐鹽堿菌株的去鹽去堿效果、產(chǎn)IAA水平、解磷、解鉀效果和產(chǎn)蛋白酶能力，綜合分析其促生效果，為西北旱區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)專用微生物肥料的開發(fā)奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 土壤樣品準(zhǔn)備

土壤樣品采集于榆林市榆陽區(qū)大地種業(yè)馬鈴薯種植區(qū)。馬鈴薯的根際土壤采集時(shí)需先將表層土去除，然后將整株植物的根區(qū)帶土挖出（深度5～20 cm），將距離根區(qū)2 cm以內(nèi)的土壤都裝入無菌紙袋。

1.2 菌株分離純化

供試培養(yǎng)基為Gibbson改良培養(yǎng)基（pH 9、NaCl濃度為100 g/L）[15]。稱取10 g土樣放入潔凈的培養(yǎng)瓶中，加入90 mL無菌水，將培養(yǎng)瓶放于37℃、180 r/min的搖床上振蕩30 min，待土壤浸提液震蕩搖勻后，取1mL土壤浸提液于無菌的試管中，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-5、10-6、10-7梯度稀釋液0.1 mL。無凈工作臺上環(huán)境下，采用平板劃線法將稀釋液涂布于Gibbson固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)5 d后，挑取細(xì)胞單克隆，二次劃線純化，純化后對菌株進(jìn)行編號[16]。

1.3 耐鹽堿菌株的篩選

基于Gibbson固體培養(yǎng)基，設(shè)置NaCl的濃度分別為100 g/L、120 g/L、140 g/L、160 g/L，pH分別為9、10、11、12、13、14，利用鹽堿組合，篩選耐鹽堿菌株，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.4 耐鹽堿菌株的鑒定

利用革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)，對耐鹽堿菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定[17]。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302（天根，中國）提取耐鹽堿菌株的DNA，基于27F/1492-R通用引物[18]，擴(kuò)增細(xì)菌16s rDNA區(qū)段，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用Blastn在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行序列比對，確定菌株的分類特征。

1.5 耐鹽堿菌株分泌IAA及產(chǎn)蛋白酶能力測定

利用紫外可見分光光度計(jì)，連續(xù)測定不同生長階段，耐鹽堿菌株在OD600波長的吸光值，繪制耐鹽堿菌株的生長曲線[19]。繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定OD530波長處，菌株處理液的吸光值，確定菌株的產(chǎn)IAA能力[20]。利用脫脂奶粉培養(yǎng)基及酪氨酸反應(yīng)法，測定680nm波長下，混合溶液的吸光值，確定菌株的產(chǎn)蛋白酶能力[21]。

1.6 耐鹽堿菌株去鹽去堿及解磷解鉀水平測定

將T11菌株按1%體積比接種于pH值為9，鹽度為8%的ISP2液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12 h、24 h、36 h和48 h取菌液樣品，測定pH，同時(shí)利用硝酸銀滴定法，計(jì)算菌株的去鹽效率η＼+l[22]。

公式1：C（Cl）=C（AgNO3）×V1/V2，式中：V1為滴定時(shí)消耗的AgNO3溶液的體積（mL）；V2為滴定時(shí)取的發(fā)酵液的體積。

公式2：去鹽效率η＼+1=（C（Cl）max—C（Cl）min）/C（Cl）max×100%，式中：C（Cl）max為培養(yǎng)基中Cl＼+-初始濃度（mol/L）；C（cl）min為培養(yǎng)48 h后Cl＼+-的濃度（mol/L）。

公式3：除堿效率η =（pH初始—pH48h）/pH初始×100%

用無菌槍頭將菌株T11接種到無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基上，28℃培育72 h，觀察培養(yǎng)基中是否產(chǎn)生透明圈，明確菌株的解磷能力，同時(shí)基于硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基檢測菌株的解鉀水平[23]。

2 結(jié)果分析

2.1 耐鹽堿菌株的篩選

基于Gibbson固體培養(yǎng)基（pH 9、NaCl濃度100 g/L），平板劃線法分離純化馬鈴薯根際細(xì)菌，共得到11個(gè)細(xì)菌菌株，分別編號為T1～T11。設(shè)置不同NaCl濃度和pH配比，篩選耐鹽堿菌株，結(jié)果見表2。隨著pH增長，不同菌株呈現(xiàn)不同的耐受性。當(dāng)pH分別為9、10、11、12時(shí)，不同NaCl濃度下，11個(gè)菌株均生長；當(dāng)培養(yǎng)基pH為13、NaCl濃度為140 g/L時(shí)，菌株T3、T4、T5、T10和T11正常生長；當(dāng)pH為13、NaCl濃度為160 g/L時(shí)，菌株T11正常生長，其余菌株不生長，說明11個(gè)菌株在較低pH下，耐鹽性較好，較高pH影響菌株的耐鹽性，說明鹽堿之間存在相互作用。

2.2" T11菌株的鑒定

根據(jù)革蘭氏染色基本原理及方法，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，結(jié)果表明T11菌株呈現(xiàn)紅色，為革蘭氏陽性菌。利用27F/1492-R通用引物，擴(kuò)增細(xì)菌16s rDNA序列，測序及分析結(jié)果見圖1?；贜CBI中（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blasn程序，選擇與T11菌株相似度值gt;96%，E-value=0的序列9條，分析可知，T11菌株與菌株NR178988序列的相似度為98.88%，NR178988菌株為枯草芽孢桿菌，同時(shí)NR151987、NR180225、NR115325、NR157609、NR157608、025130、118439和NR118441菌株均為芽孢桿菌，說明T11菌株為枯草芽孢桿菌。

2.3 T11菌株的生長發(fā)育特征及產(chǎn)IAA水平測定

利用紫外可見分光光度計(jì)，基于IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析耐鹽堿菌株的生長發(fā)育特征及產(chǎn)IAA能力[19]。如圖2A所示，T11菌株在IAA顯色反應(yīng)后，呈現(xiàn)微弱的粉色，其產(chǎn)IAA水平為1.927 9 ug/mL（圖2C），說明T11菌株具有一定的促生效果。按照菌液：LB培養(yǎng)基=1∶1 000體積比，180 rmp/min，28℃培養(yǎng)T11菌株，取不同生長時(shí)期菌液測定其OD600吸光值，結(jié)果表明T11菌株的生長曲線為S型（圖2B），符合細(xì)菌的一般生長規(guī)律。

2.4 T11菌株的產(chǎn)蛋白酶能力測定

利用脫脂奶粉培養(yǎng)基及酪氨酸反應(yīng)法，確定T11菌株的產(chǎn)蛋白酶能力，結(jié)果見圖3。圖3A結(jié)果可知，T11菌株在pH 7條件下，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)透明圈，說明其具有產(chǎn)蛋白酶能力。擬合酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3B）：Y=0.012X+0.035 8，進(jìn)一步利用酶活力單位（U/mL）=A·K·4/10·N公式[21]，計(jì)算T11菌株的蛋白酶活性為12.86 U/mL，進(jìn)一步說明T11菌株為產(chǎn)蛋白酶功能細(xì)菌。

2.5 T11菌株的去鹽去堿及解磷效果分析

分別取培養(yǎng)12 h、24 h、36 h和48 h的菌液樣品，測定pH，同時(shí)利用硝酸銀滴定法，計(jì)算菌株的去鹽效率[22]?；诠杷猁}培養(yǎng)基，分析T11菌株的解鉀效果[23]。如圖4A所示，在硅酸鹽固體培養(yǎng)基條件下，37℃培養(yǎng)72 h后，T11菌株正常生長并呈現(xiàn)光滑透明油滴狀，在無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基中未出現(xiàn)透明圈，說明T11菌株具有解鉀能力，無解磷能力。由圖4B-C可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，ISP2液體培養(yǎng)基的pH下降，說明T11菌株具有去堿能力，去堿效率為20.78%。AgNO3溶液滴定法測定其去鹽效率為24.28%。

3 討論

鹽堿土在我國分布廣泛，隨著耕作過程中不合理的施肥及灌水方式，土壤鹽堿化加劇，因此合理利用鹽堿土地資源成為保障我國糧食安全的重要舉措[24]。目前可以利用物理和化學(xué)方法改良鹽堿土壤，但其成本高，可持續(xù)性低，鹽堿土利用效率低[25]。大量研究表明，根際促生菌對于鹽堿土壤利用具有重要意義[26]。本研究基于馬鈴薯根際土壤，分離得到細(xì)菌菌株11個(gè)，通過設(shè)置不同的NaCl和pH濃度，篩選耐鹽堿菌株，結(jié)果可知隨著pH值不斷增大，不同菌株對NaCl的耐性降低，說明鹽堿脅迫相互作用，共同影響菌株的耐受性。

芽孢桿菌作為重要的植物根際促生菌，在促進(jìn)植物生長發(fā)育及抵抗不良生長環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵作用。武玲玲等[27]分離得到耐旱萎縮芽孢桿菌WL520，其能夠產(chǎn)生IAA和水解酶，具有固氮作用，能夠顯著性提高苜蓿的抗旱性。李培根等[28]利用篩選到具有高產(chǎn)IAA能力的芽孢桿菌進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，其顯著性促進(jìn)擬南芥和馬鈴薯的生長發(fā)育。T11菌株在進(jìn)化分析中與枯草芽孢桿菌NR178988為同一分支，相似度高達(dá)98.88%，推測T11菌株為芽孢桿菌。同時(shí)T11菌株具有產(chǎn)蛋白酶活性和產(chǎn)IAA能力，結(jié)合武玲玲等[27]和李培根等[28]的研究結(jié)果，進(jìn)一步說明T11菌株具有促生效果。

逄煥成等[29]通過研究微生物菌肥施用對鹽堿土壤及作物生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌肥能夠降低土壤pH及含鹽量，進(jìn)而促進(jìn)玉米生長發(fā)育，同時(shí)宋玉珍等[30]在造林中施用微生物菌肥，土壤鹽堿狀況優(yōu)化，本研究結(jié)果表明T11菌株的去堿效率為20.78%，去鹽效率為24.28%，說明T11菌株具有去鹽去堿能力，能夠改良鹽堿土壤，促進(jìn)鹽堿地植物的生長發(fā)育，是鹽堿地馬鈴薯種植的優(yōu)良微生物肥料。

4 結(jié)論

通過篩選馬鈴薯根際土壤中的耐鹽堿菌株，得到耐堿菌株T11菌株。T11菌株為芽孢桿菌，有產(chǎn)蛋白酶活性，具有產(chǎn)IAA、解鉀、去鹽和去堿能力，為鹽堿地馬鈴薯種植奠定微生物菌肥基礎(chǔ)。

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