蝦青素對13月齡羅曼粉蛋雞卵巢組織結(jié)構(gòu)和Sirtuin基因家族表達(dá)的影響

摘 要：卵巢是影響蛋雞產(chǎn)蛋性能的重要器官，產(chǎn)蛋期卵巢生理機(jī)能衰退會導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降。本文旨在研究不同水平蝦青素對13月齡羅曼粉蛋雞卵巢組織和Sirtuin基因家族表達(dá)的影響。選取16只健康、體重相近的13月齡羅曼粉蛋雞，隨機(jī)分為4組，每組4個重復(fù)，分別為對照B組、試驗LC組、MC組和HC組。所有蛋雞飼喂相同的基礎(chǔ)日糧，每日飼喂三次。對照組B額外灌喂葵花籽油4 mL，試驗組LC、MC和HC分別額外灌喂4、20、100 mg/kg體重的蝦青素（溶劑為葵花籽油）4 mL。飼喂方式為每天下午18：00直接灌服。各組溫度保持在（25±3）℃，濕度維持在65%～80%，試驗期25 d。結(jié)果顯示，灌喂蝦青素會使蛋雞卵巢組織結(jié)構(gòu)著色點增多、著色加深，卵泡壁增厚，卵泡數(shù)量有所增加。試驗MC組卵巢組織中的Sirt2、Sirt3基因表達(dá)量極顯著高于對照組（Plt;0.01），Sirt6、Sirt7基因表達(dá)量顯著高于對照組（Plt;0.05），LC組卵巢組織中的Sirt1基因表達(dá)量極顯著高于對照組（Plt;0.01）。綜上所述，蝦青素能夠改善蛋雞卵巢組織結(jié)構(gòu)，延緩卵泡衰老，促進(jìn)卵巢中Sirtuin基因家族的表達(dá)，其中20 mg/kg的劑量效果最佳。本試驗結(jié)果可為蝦青素調(diào)控卵巢生理功能機(jī)制的研究提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：蝦青素；卵巢；Sirtuin；蛋雞

中圖分類號：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-1085（2024）12-0005-07

家禽的繁殖系統(tǒng)由卵巢和輸卵管兩部分組成，卵巢是影響蛋雞產(chǎn)蛋性能的一個重要器官。馬艷粉[1]研究表明，隨著產(chǎn)蛋周齡的增加，蛋雞卵巢中的卵泡發(fā)生更多閉鎖，大白卵泡和小白卵泡數(shù)量顯著下降。姜禮文等[2]研究表明，蛋雞卵巢機(jī)能下降可能與氧化應(yīng)激加重有關(guān)。Sirtuins是一個需要NAD+作為底物來維持酶活性的蛋白去乙?；讣易?，在組織中的表達(dá)具有高度保守性[3]，在細(xì)胞凋亡、線粒體生物合成、脂質(zhì)代謝、脂肪酸氧化、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等多種細(xì)胞過程中都發(fā)揮了重要作用[4]。目前人類公認(rèn)的Sirtuin基因家族成員有7個，且有不同的亞細(xì)胞定位，例如Sirt1、Sirt6和Sirt7主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，Sirt2主要分布在細(xì)胞漿中，Sirt3、Sirt4和Sirt5則位于線粒體內(nèi)[5]。

本實驗室前期研究表明，姜黃素（Curcumin，Cur）和斑蝥黃等天然抗氧化劑能夠有效改變蛋雞卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，緩解卵巢損傷[6-8]。蝦青素（Astaxanthin，AST）又名蝦紅質(zhì)、蝦黃素，化學(xué)名3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，是一種廣泛存在于雨生紅球藻中的多功能型類胡蘿卜素，抗氧化能力是維生素E的500倍，被譽(yù)為“超級維生素E”，且沒有副作用[9-11]。賀維朝[12]研究發(fā)現(xiàn)蝦青素通過增強(qiáng)蛋雞抗氧化能力，減少卵巢細(xì)胞凋亡，促進(jìn)生殖激素釋放，從而提高卵巢中的卵泡數(shù)量，降低卵泡閉鎖率，改善了卵巢衰退的系列表征。但目前對蝦青素如何影響蛋雞體內(nèi)Sirtuins表達(dá)調(diào)控的研究相對較少，因此本試驗通過額外灌喂蝦青素，觀察蛋雞卵巢組織切片，并檢測Sirtuins基因的表達(dá)量變化，研究結(jié)果可為蝦青素調(diào)控蛋雞卵巢功能的機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZM-75），上海申安醫(yī)療器械廠；冷凍離心機(jī)（3K15），揚(yáng)州有限公司；PCR儀（621BR31414），伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司；凝膠成像分析儀，北京譽(yù)朗科技有限公司；三恒電泳儀（DYY-10型/ECP3000），北京市六一儀器廠；4 ℃冰箱，北京福意電氣有限公司。

1.2" 試驗試劑

Trizol總RNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；100 bp DNA Marker，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR mix，康為世紀(jì)公司；瓊脂糖，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；EB替代品，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3" 試驗設(shè)計

試驗選取16只13月齡羅曼粉蛋雞，隨機(jī)分為4組（對照B組、試驗LC組、MC組和HC組），每組4個重復(fù)，每個重復(fù)1只雞。所有處理飼喂相同的基礎(chǔ)日糧，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組B額外灌喂葵花籽油4 mL，試驗組LC、MC和HC分別額外灌喂4、20、100 mg/kg體重的蝦青素（溶劑為葵花籽油），灌服時間為每天下午18：00。試驗期為25 d。

1.4" 樣品采集

試驗結(jié)束時，采用斷頸的方式處死試驗動物，及時取出完整卵巢，用PBS溶液清洗干凈后，將卵巢組織剪成黃豆粒大小，置于4%多聚甲醛中保存，用于制作組織切片；再收集4管黃豆大小的卵巢組織放在事先加入Trizol試劑的EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)分子試驗。

1.5" 卵巢形態(tài)測定

卵巢組織于 4%多聚甲醛中固定24 h后，將其切成大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的方塊，后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm）、展片、烘干、水洗、HE染色，用中性樹膠封片，貼上標(biāo)簽并編號。制片處理完成后進(jìn)行圖像采集，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行定位和拍攝，保存圖片進(jìn)行后續(xù)對比分析。

1.6" Sirtuin基因家族表達(dá)測定

使用Trizol法提取卵巢組織中RNA，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金）將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過PCR擴(kuò)增目的條帶。PCR體系（20 μL）：PCR mix 10 μL、 ddH2O 6 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；12 ℃保存。本試驗設(shè)計的所有引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成，引物序列見表2。

擴(kuò)增完成后，制備1%的瓊脂糖凝膠，放入裝有1×TBE電泳緩沖液的電泳池中對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電壓為120 V，電流為130 mA，電泳30 min。置于凝膠電泳成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀察分析結(jié)果。

1.7" 統(tǒng)計分析

利用光學(xué)顯微鏡對蛋雞卵巢組織切片進(jìn)行觀察分析；先使用ImageJ軟件對DNA熒光條帶進(jìn)行灰度分析，所分析出來的數(shù)據(jù)整合至Excel 2016軟件，求出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，利用SPSS軟件中Duncan’s多重比較檢驗，用Graphpad Prism軟件作出柱狀圖。Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 蝦青素對13月齡羅曼粉蛋雞卵巢組織的影響

蛋雞卵巢組織形態(tài)如圖1所示。觀察各組的初級卵泡，可以看出對照B組卵泡內(nèi)容物著色點最多，卵泡形狀也最不規(guī)則，多呈不規(guī)則環(huán)形。而隨著灌服蝦青素劑量的增加，各試驗組的卵泡異常狀況有所改善，初級卵泡形態(tài)相對規(guī)則。觀察各組的次級卵泡，可以看出各試驗組尤其是HC組卵泡密集、發(fā)育良好，且次級卵泡的內(nèi)容物多。觀察各組的成熟卵泡，可以看出B組成熟卵泡結(jié)構(gòu)形態(tài)細(xì)節(jié)不太清晰，各試驗組卵泡發(fā)育良好、形態(tài)飽滿圓潤、內(nèi)壁薄而清晰、顆粒層厚。

對比分析得到，B組卵巢組織切片中可見視野里成型的各級卵泡數(shù)量較少，同時結(jié)構(gòu)不規(guī)則。LC組卵巢組織切片中卵泡內(nèi)容物豐富；MC組卵巢組織切片中卵泡發(fā)育好，視野中有大片卵泡密集，次級卵泡以及成熟卵泡數(shù)量多，簇?fù)沓蓤F(tuán)，卵巢上密布著小黃卵泡和大白卵泡；HC組卵巢組織切片中卵泡發(fā)育好，細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞核邊界較清晰，顆粒細(xì)胞層增多，卵巢上密布著小黃卵泡和大白卵泡。

綜上，三個試驗組的卵泡相比對照組發(fā)育程度更為良好，數(shù)量更為密集，表明適當(dāng)添加蝦青素可能延緩卵泡的衰老。

2.2" 蝦青素對13月齡羅曼粉蛋雞Sirtuin基因家族表達(dá)的影響

對內(nèi)參基因β-actin和Sirtuin基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)顯示，內(nèi)參基因和Sirt基因的擴(kuò)增條帶單一且清晰可見，位置大小合適（圖2a）。對凝膠電泳后所得出的條帶進(jìn)行灰度分析，各基因檢測值除以內(nèi)參基因整理得出的結(jié)果見圖2b。LC組的Sirt1表達(dá)量，MC組的Sirt2和Sirt3表達(dá)量均極顯著高于B組（Plt;0.01）。同時，MC組的Sirt6和Sirt7表達(dá)量均顯著高于B組（Plt;0.05）。HC組Sirt基因的表達(dá)量與B組無顯著差異（Pgt;0.05）。各處理組間Sirt4和Sirt5的表達(dá)量差異均不顯著（Pgt;0.05）。由此可以表明，蝦青素能提高雞卵巢中Sirtuin基因家族的表達(dá)量，尤其是LC組（4 mg/kg）對Sirt1的表達(dá)量和MC組（20 mg/kg）對Sirt2、Sirt3、Sirt6、Sirt7的表達(dá)量有顯著提升效果。

3" 討論

3.1" 蝦青素對卵巢組織的影響

氧化應(yīng)激反應(yīng)是機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化失衡的狀態(tài)，會導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[13-14]。ROS是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛能的主要因素之一，過多的ROS會影響卵母細(xì)胞成熟并阻滯胚胎發(fā)育[15]，而細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)可使卵母細(xì)胞免受ROS的損害[16]。蛋雞進(jìn)入產(chǎn)蛋后期后，體內(nèi)的新陳代謝速率開始減慢，抗氧化能力下降，ROS過度積累，從而損害卵巢的生理功能。蝦青素可中和游離態(tài)氧，清除自由基，避免發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞免受氧化[17]。

本次試驗發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，試驗組卵巢組織發(fā)育更好，可以看到成熟的卵泡，隨著蝦青素濃度的增加，著色點增多、著色加深，卵泡壁增厚明顯，卵泡數(shù)量同樣逐漸增多。這表明蝦青素可能會促進(jìn)卵巢發(fā)育，增加卵泡數(shù)量，進(jìn)而提高產(chǎn)蛋率[18] 。

3.2" 蝦青素對蛋雞卵巢組織中Sirtuins基因表達(dá)的影響

Sirtuins能夠調(diào)控抗氧化酶的活性，清除過量的ROS，提高卵母細(xì)胞抗氧化能力[19]。有研究表明，Sirtuins與原始卵泡數(shù)量呈正相關(guān)，能夠延緩原始卵泡激活和閉鎖，其表達(dá)缺陷會減少卵泡數(shù)量，加速原始卵泡的耗竭[20]。研究表明，Sirt1通過抗氧化修復(fù) DNA 損傷、去乙?；{(diào)控代謝和調(diào)控促凋亡因子來延緩細(xì)胞衰老和凋亡[21]。Sirt2表達(dá)量降低是導(dǎo)致卵母細(xì)胞年齡依賴性損傷的眾多原因之一，老化的卵母細(xì)胞中ROS水平激增，抗氧化能力降低，而通過促進(jìn)Sirt2的表達(dá)可使老齡小鼠卵母細(xì)胞的ROS水平降低，恢復(fù)卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[22-23]。Sirt3對卵巢儲備和卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和胚胎植入前的發(fā)育進(jìn)程、卵母細(xì)胞的老化以及顆粒細(xì)胞功能都具有重要的調(diào)控作用[24]。Sirt4可以抑制腫瘤細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)以及上皮組織-間葉組織的轉(zhuǎn)化過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[25]。抑制Sirt5蛋白表達(dá)會使早期胚胎的發(fā)育能力降低[26]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵巢中Sirt1、Sirt3和Sirt6的表達(dá)水平與卵巢始基卵泡池的大小顯著相關(guān)，可以看出這些Sirtuins與卵巢的儲備功能有著密切的聯(lián)系，并且可以通過其表達(dá)量判斷卵巢壽命[27]。Sirt7表達(dá)抑制會干擾胎鼠卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程[28]。Sirtuin家族成員雖然各具重要且獨(dú)特的功能，但是各個成員之間相互也存在著重要的聯(lián)系，既相互影響又共同協(xié)調(diào)。如果有某個成員的表達(dá)受到干擾，則其他成員的功能亦會紊亂甚至缺失。

目前蝦青素在Sirt1的表達(dá)機(jī)制方面有少許研究，但對Sirtuins家族的其他基因少有涉及。本次試驗的結(jié)果表明，與對照組相比， MC組的Sirt2和Sirt3基因表達(dá)量極顯著提高，Sirt6和Sirt7基因表達(dá)量顯著提高，LC的Sirt1基因表達(dá)量極顯著提高，可以推測適量的蝦青素能夠調(diào)控雞卵巢中Sirtuin基因家族表達(dá)量，延緩蛋雞卵巢組織細(xì)胞衰老和凋亡。

4" 結(jié)論

蝦青素能夠改善蛋雞卵巢組織結(jié)構(gòu)，延緩卵泡衰老，促進(jìn)卵巢中Sirtuin基因家族的表達(dá)，其中20 mg/kg的劑量效果最佳。

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Effect of Astaxanthin on Ovarian Tissue Structure and Sirtuin Gene Expression in 13-month-old Roman Laying Hens

Abstract：" The ovary is an important organ which affects laying performance of laying hens. The decline of physiological function of ovary during laying period will lead to the decrease of laying rate. The aim of this study was to investigate the effects of different levels of astaxanthin on ovarian tissue structure and Sirtuin gene expression in 13-month-old Roman laying hens. 16 healthy 13-month-old Roman laying hens with similar body weight were randomly divided into 4 groups with 4 replicates in each group， The 4 groups were control group B， experimental group LC， MC and HC respectively. All layers were fed the same basic diet three times a day. The control group was fed with 4 mL sunflower seed oil， and the experimental groups （LC， MC， HC） were fed with 4 mL of astaxanthin-sunflower oil mixture at 4， 20 and 100 mg/kg body weight， respectively. Hens were perfused with astaxanthin at 18：00 pm every day. The temperature and humidity of each group were maintained at （25±3） ℃ and 65%～80% respectively for 25 days. The results showed that administration of astaxanthin could increase the staining spots， deepen the staining spots， thicken the wall of follicles and increase the number of follicles. The expression levels of Sirt2 and Sirt3 in MC were significantly higher than those in control group （Plt;0.01）. The expression levels of Sirt6 and Sirt7 in MC ovarian tissues were significantly higher than those in control group （Plt;0.05）. The expression level of Sirt1 gene in LC ovarian tissues was significantly higher than that in control group （Plt;0.01）. In conclusion， Astaxanthin can improve ovarian tissue structure， delay follicle senility and promote the expression of Sirtuin gene family in ovary of laying hens， and the dose of 20 mg/kg has the best effect. These results provide reference for studying the regulatory mechanism of astaxanthin on ovary function of hens.

Keywords：" Astaxanthin; Ovary; Sirtuin; Laying hens