降解黃曲霉毒素B1芽孢桿菌的分離鑒定及其特性研究

摘要：本研究旨在從不同來源的樣本中分離出對黃曲霉毒素B1（AFB1）具有降解作用的芽孢桿菌，為降解AFB1的芽孢桿菌開發(fā)利用提供理論依據(jù)。采集雞的腸道、肛拭子和土壤樣本，富集后利用MYP固體培養(yǎng)基和初篩培養(yǎng)基篩選出疑似芽孢桿菌的菌落，通過分析細(xì)菌對AFB1的降解率復(fù)篩，選出對AFB1具有降解作用的菌株，通過16S rRNA測序鑒定細(xì)菌種屬，然后對篩選出的芽孢桿菌的溶血性、抗生素敏感性、生長曲線、耐酸和耐膽鹽性進(jìn)行測試。結(jié)果顯示，共篩選出20株對AFB1具有降解作用的芽孢桿菌。結(jié)合細(xì)菌測序和溶血試驗(yàn)結(jié)果，選擇3株降解率高的地衣芽孢桿菌（S51、S48、S8-2）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，3株芽孢桿菌對多種抗生素較敏感，其中S51的生長速度最快，菌液濃度最大，對酸和膽鹽的耐受性均強(qiáng)于另外兩株菌。本研究篩選出1株對AFB1有較好降解作用的地衣芽孢桿菌，具有良好的安全性和耐受性，有望作為微生態(tài)制劑應(yīng)用到AFB1降解過程中。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；降解；芽孢桿菌

中圖分類號：S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）12-0105-08

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是由多種黃曲霉和寄生曲霉通過聚酮途徑產(chǎn)生的二呋喃香豆素衍生物，目前已經(jīng)分離鑒定出的AF有20多種，其中以AFB1分布最廣、毒性最強(qiáng)。AFB1的代謝物具有急性毒性、致畸性、致突變性和致癌性。動物食入AFB1后，毒素會在體內(nèi)蓄積造成急性或慢性中毒，影響動物的生長性能，損傷生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。AF還存在于中毒動物的肉蛋奶中，嚴(yán)重威脅食品安全。近幾年，隨著畜禽飼養(yǎng)數(shù)量的不斷增加，飼料消耗量也隨之增多，飼料在存儲運(yùn)輸過程中極易發(fā)生發(fā)霉變質(zhì)等情況。

目前AF的解毒方法有三種：物理降解、化學(xué)降解、微生物降解。其中微生物是通過將霉菌毒素結(jié)合到其表面降解或轉(zhuǎn)化為毒性較小的代謝物來起作用，相較于物理和化學(xué)方法，具有安全、高效、綠色且對動物存在益生作用等優(yōu)點(diǎn)。芽孢桿菌因具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、良好的抗逆性以及具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)機(jī)體對疾病的抵抗力等益生作用，在動物養(yǎng)殖過程中被廣泛應(yīng)用。Liu等給1日齡肉雞連續(xù)灌服凝結(jié)芽孢桿菌42天，發(fā)現(xiàn)其可以通過改善腸道菌群、促進(jìn)肉雞腸上皮細(xì)胞再生和增強(qiáng)先天免疫力來保護(hù)腸黏膜屏障；Jia等研究發(fā)現(xiàn)，給食用黃曲霉毒素污染飼料的蛋雞連續(xù)飼喂枯草桿菌降解產(chǎn)物4周，可以明顯改善蛋雞的采食量、產(chǎn)蛋量等生產(chǎn)性能；Li等研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠灌喂解淀粉芽孢桿菌28天能夠緩解AFB1對小鼠肝臟的損傷。基于以上研究，本試驗(yàn)旨在從不同來源的樣品中分離具有良好安全性和耐受性的AFB1降解菌，以期為芽孢桿菌降解AFB1的研究和微生物解毒制劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品來源 從濟(jì)南市某市場采集不同日齡健康雞的盲腸內(nèi)容物和肛拭子樣本共20份：從濟(jì)南華山湖采集土壤樣品10份。

1.1.2主要試劑 初篩培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 5.0g，KH2PO4 2.5 g，MgSO4 1.0 g，Na2HPO4·12H2O0.5 g，CaCl2 0.1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1L，pH值7，121℃滅菌15 min，加入過濾除菌的香豆素溶液至1 g/L。LB培養(yǎng)基、MYP培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。血平板培養(yǎng)基，購自環(huán)凱微生物科技有限公司。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，購自FERMENTEK。AFB1ELISA試劑盒，購自南京博研生物科技有限公司。DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司。慶大霉素、青霉素及四環(huán)素等12種藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。香豆素，購自Macklin。豬膽鹽，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2降解菌株的篩選

1.2.1初篩 將采集到的腸道和土壤樣本置于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24 h，將富集后的菌液用無菌水梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，劃線培養(yǎng)于MYP固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)24 h，重復(fù)操作2次。純化后的細(xì)菌染色后進(jìn)行形態(tài)特征觀察，選取疑似芽孢桿菌的菌株繼續(xù)劃線培養(yǎng)于含有香豆素的初篩培養(yǎng)基，選擇在初篩培養(yǎng)基上生長良好的細(xì)菌菌液與60％的甘油1：1混合，-80℃凍存。

1.2.2復(fù)篩 挑取單個菌落接種在5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。將菌液按照5％的比例接種在50 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，37℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取980 uL發(fā)酵液與20 uL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（5 ug/mL）混合，使AFB1的最終濃度為100ng/mL，37℃、150 r/min避光孵育72 h。以不接種菌液的LB培養(yǎng)基加人20 uL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品作為空白對照。孵育結(jié)束，4 000 r/min低溫離心5min，吸取上清液，使用AFB1 ELISA試劑盒檢測菌液上清中AFB1的含量。每個菌株重復(fù)3次。AFB1降解率（％）=（對照組AFB，含量-細(xì)菌組AFB1含量）／對照組AFB1含量×100。

1.3菌株16S rRNA基因序列鑒定

利用DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物（27F/1492R）對分離菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 uL）；DNA模版1 uL，引物27F、1492R各0.4 uL，2x Taq PCR StarMix 10 uL，ddH2O 8.2 uL。PCR反應(yīng)條件；94℃預(yù)變性2min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2min，25個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送往深圳華大基因股份有限公司測序，測序結(jié)果輸入BLAST進(jìn)行序列比對。

1.4菌株特性分析

1.4.1溶血試驗(yàn) 挑取單菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、170 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液劃線于血平板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)溶血環(huán)。

1.4.2藥敏試驗(yàn) 首先在LB平板上挑取芽孢桿菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用無菌水調(diào)整為麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液。用無菌棉棒蘸取菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂平板，室溫放置5 min。用無菌鑷子將藥敏紙片貼在涂布有菌液的MH瓊脂平板上并做好標(biāo)記，37℃培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，根據(jù)抗生素敏感性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表1）判定結(jié)果。

1.4.3細(xì)菌生長曲線 將細(xì)菌按照5％接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，每12 h用酶標(biāo)儀檢測菌液在波長630 nm處的吸光度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.4.4細(xì)菌耐受性試驗(yàn) 耐酸試驗(yàn)：將0.5 mL分離菌懸液分別接種于pH值為1.0、2.0、3.0、4.0的4.5 mL無菌LB液體培養(yǎng)基中，37℃處理3h。以酸處理Oh的LB培養(yǎng)基作為對照。取100 uL菌液10倍稀釋后，選3個稀釋度平板計(jì)數(shù)。37℃恒溫培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)活菌數(shù)量，按照公式計(jì)算存活率。存活率（％）=酸處理3 h的活菌數(shù)（cfu/mL）/酸處理Oh的活菌數(shù)（cfu/mL）x100。

耐膽鹽試驗(yàn)：挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基并置于搖床中37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。將0.5 mL菌懸液分別接種于4.5 mL含0.1％、0.2％、0.3％膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min培養(yǎng)3h。以膽鹽處理Oh的LB液體培養(yǎng)基為對照。取菌液適度稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。存活率（％）=膽鹽處理3h的活菌數(shù)（cfu/mL）/膽鹽處理Oh的活菌數(shù)（cfu/mL）×100。

1.5S51菌株降解特性

取10 mL菌株S51發(fā)酵液，4℃、10 000r/min離心10 min，分離獲得上清液和菌體。菌體用無菌蒸餾水洗滌、離心，重復(fù)3次后加入10 mL無菌蒸餾水制備成S51菌懸液。按上述方法制備10 mL菌懸液，隨后低溫超聲破碎20 min，無菌過濾制備胞內(nèi)液。將S51上清液、菌懸液、胞內(nèi)液分別加入AFB1，37℃孵育72 h后，檢測各組AFB1降解率。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel匯總后進(jìn)行初步整理，利用GraphPad Prism 6.02進(jìn)行One-wayANOVA分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1降解菌株的篩選

2.1.1初篩 利用MYP培養(yǎng)基共分離出73株細(xì)菌，通過形態(tài)特征觀察，篩選出菌落呈乳白色、邊緣不規(guī)則、顯微鏡下菌體呈藍(lán)紫色桿狀的革蘭氏陽性菌（圖1），初步判斷有27株為芽孢桿菌。因香豆素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與AFB1相似，繼續(xù)篩選在含有香豆素的初篩培養(yǎng)基上生長良好的細(xì)菌，選出20株可能對AFB1具有降解作用的細(xì)菌。

2.1.2復(fù)篩 將篩選的菌株與AFB1共培養(yǎng)，檢測細(xì)菌對AFB，的降解率。結(jié)果（圖2）顯示，降解率在50％以上的有4株，分別為菌株S51、S48、S8-2、S45，對AFB，的降解率分別為61.03％、58.80％、53.18％、52.58％。

2.2菌株16S rRNA基因序列鑒定

經(jīng)BLAST比對，這20株菌均為芽孢桿菌，其中地衣芽胞桿菌有10株，枯草芽孢桿菌有2株，蠟樣芽孢桿菌有3株，貝萊斯芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、假真菌樣芽孢桿菌各1株（表2）。

2.3菌株特性

2.3.1菌株溶血性 如圖3所示，20株芽孢桿菌中，T1-1、D23-2、N2-6-2、D23-2和Z5-1的菌落周圍存在溶血環(huán)，有溶血現(xiàn)象。結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)特征、對AFB1的降解率、16S rRNA基因序列分析以及溶血試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇S51、S48和S8-2這3株地衣芽孢桿菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2菌株藥敏試驗(yàn) 由表3可知，3株地衣芽孢桿菌均對慶大霉素、多西環(huán)素、萬古霉素和環(huán)丙沙星敏感，對青霉素G、阿奇霉素和克林霉素耐藥，對利福平中度敏感。其中菌株S48對8種藥物敏感，對1種藥物中度敏感：菌株S51對5種藥物敏感，對4種藥物中度敏感：菌株S8-2對4種藥物敏感，對5種藥物中度敏感。

2.3.3菌株生長曲線 由圖4可知，S51、S48、S8-2這3株地衣芽孢桿菌均在培養(yǎng)24 h達(dá)到生長穩(wěn)定期，其中菌株S51生長速度最快：在前12 h菌株S48的生長速度高于S8-2；在24 h之后菌株S8-2的生長速度高于S48。持續(xù)監(jiān)測72 h，3株地衣芽孢桿菌的濃度均能維持在穩(wěn)定水平。

2.3.4細(xì)菌耐受性 3株芽孢桿菌對不同酸度的耐受性見圖5。3株芽孢桿菌的存活率隨著pH值的升高而提升，其中S51菌株對不同酸性溶液的耐受性明顯高于另外兩株芽孢桿菌，其在pH值1.0條件下的存活率為26.06％，在pH值4.0條件下的存活率為64.12％。

3株芽孢桿菌對不同濃度膽鹽溶液的耐受性見圖6。膽鹽對3株芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用，并隨著膽鹽終濃度的升高細(xì)菌的存活率降低。S48對膽鹽的耐受性最低，在0.1％和0.3％的膽鹽濃度下存活率分別為32.05％和22.26％。在0.1％的膽鹽濃度下S51的耐受性最高，為51.54％；在0.2％的膽鹽濃度下S8-2的耐受性較高，為46.22％。

2.4S51菌株降解特性

比較菌株S51上清液、菌懸液、胞內(nèi)液對AFB1的降解特性，發(fā)現(xiàn)上清液的降解能力最強(qiáng)，達(dá)61.03％，菌懸液和胞內(nèi)液的降解效果相對較弱，降解率分別為10.17％和7.15％（圖7）。表明菌株S51對AFB1的脫毒能力主要來源于上清液中的某種活性物質(zhì)，而非吸附作用。

3討論與結(jié)論

動物飼料大量堆積容易出現(xiàn)發(fā)霉變質(zhì)現(xiàn)象，如何對飼料中的黃曲霉毒素進(jìn)行解毒成為問題關(guān)鍵。利用微生物降解黃曲霉毒素是近些年研究較多的一種解毒方法，目前已發(fā)現(xiàn)的降解菌有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、假單胞菌和黑曲霉等。芽孢桿菌可以分泌多種酶類和蛋白，通過降解和吸附的方式將AFB1轉(zhuǎn)化為低毒的或無毒的化合物達(dá)到解毒效果。本研究采集土壤以及雞的腸道和肛拭子樣本，經(jīng)過富集、MYP培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢以及含香豆素的培養(yǎng)基培養(yǎng)對分離菌進(jìn)行初篩，選出20株可能對AFB1具有降解作用的細(xì)菌，經(jīng)與AFB1共培養(yǎng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)4株芽孢桿菌（S51、S48、S8-2、S45）對AFB1的降解率在50％以上，通過16S rRNA測序鑒定均為地衣芽孢桿菌。王康從發(fā)霉的谷物中分離出2株枯草芽孢桿菌，對AFB1的降解率分別為70.65％和61.42％。細(xì)菌對AFB1的降解率與AFB1濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等條件有關(guān)。Wang等從土壤中分離出1株地衣芽孢桿菌，120 h內(nèi)對AFB1的降解率為89.1％。程思忠等分離出一株能夠降解AFB1的貝萊斯芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其主要通過上清液中的胞外酶發(fā)揮解毒作用。王明清等篩選出一株AFB1降解菌，其各組分中上清液的降解率最高可達(dá)91.7％。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究表明菌株S51降解AFB1的活性組分主要存在于胞外上清液中，該結(jié)果可為后續(xù)分析S51菌株降解AFB，的活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

安全性試驗(yàn)是評價(jià)細(xì)菌能否應(yīng)用到動物體內(nèi)的關(guān)鍵。細(xì)菌的溶血性是篩選菌株的先決條件，溶血陽性細(xì)菌通常被認(rèn)為存在安全風(fēng)險(xiǎn)，會對宿主的健康產(chǎn)生威脅。通過溶血試驗(yàn)對篩選出的20株芽孢桿菌進(jìn)行安全性評價(jià)，其中T1-1、D23-2、N2-6-2、D23-2和25-1這5株細(xì)菌菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，表明存在溶血現(xiàn)象。結(jié)合細(xì)菌的復(fù)篩結(jié)果和菌種測序結(jié)果，最終選取3株菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，分別是S51、S48、S8-2。益生菌對抗生素的敏感性也是評價(jià)細(xì)菌安全性的重要指標(biāo)之一。細(xì)菌對抗生索的耐藥性既可以是特定物種所固有的，也可以通過基因突變或水平基因轉(zhuǎn)移獲得。攜帶耐藥基因較少的菌株進(jìn)入動物體內(nèi)，其耐藥基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也會隨之減少。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示3株菌均對慶大霉素、多西環(huán)素、萬古霉素和環(huán)丙沙星敏感，對青霉索G、阿奇霉素和克林霉素耐藥，對利福平中度敏感。這與地衣芽孢桿菌對克林霉素的耐藥性是固有特性且與其耐藥基因有關(guān)的報(bào)道相一致。

對S51、S48、S8-2這3株地衣芽孢桿菌生長性能的監(jiān)測結(jié)果顯示，在24 h內(nèi)均能達(dá)到生長穩(wěn)定期，其中S51菌株生長最快，細(xì)菌濃度最大；連續(xù)培養(yǎng)72 h，S51的細(xì)菌數(shù)量略有下降，菌株S48和S8-2的細(xì)菌數(shù)量略有升高，但3株細(xì)菌的數(shù)量均能夠維持在穩(wěn)定水平，暗示芽孢桿菌進(jìn)入動物體內(nèi)后可以持續(xù)發(fā)揮降解作用。

能夠在胃和小腸的惡劣環(huán)境中生存是益生菌所需的特性之一。益生菌進(jìn)入機(jī)體后，首先會在胃內(nèi)停留3h，動物胃腸道的pH值為1.5-4.0，經(jīng)過胃酸的消化后益生菌進(jìn)入小腸，由膽鹽形成的高滲透環(huán)境會改變細(xì)胞外膜的通透性從而起到殺菌作用，膽鹽濃度為0.03％-0.30％。對酸和膽鹽的耐受能力直接影響益生菌能否在動物體內(nèi)存活。通過對3株地衣芽孢桿菌進(jìn)行耐受性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使pH值為1.0的強(qiáng)酸情況下，3株菌仍能保持一定的活性，其中菌株S51的存活率能達(dá)到20％以上，在pH值4.0的情況下S51的存活率可以達(dá)到60％以上，表明其對酸的耐受性較強(qiáng)，能夠通過胃酸消化。這與張昊等的研究結(jié)果一致。耐膽鹽的試驗(yàn)結(jié)果顯示，芽孢桿菌S51對膽鹽的耐受性最強(qiáng)，在0.1％的膽鹽濃度下存活率可達(dá)50％以上。這些結(jié)果表明地衣芽孢桿菌S51對酸和膽鹽的耐受性強(qiáng)于另外2株菌，有作為益生菌添加劑的潛力。

本研究從土壤及雞的腸道和肛拭子樣本中分離出20株對AFB1具有降解作用的芽孢桿菌，其中有4株地衣芽孢桿菌對AFB1的降解率在50％以上。從中篩選出一株對AFB1降解率較高的地衣芽孢桿菌S51，其具有良好的生長性能，無溶血現(xiàn)象，耐酸、耐膽鹽，耐藥性較差，有望作為微生物添加劑用于降低飼料中AFB1的含量。后續(xù)仍需開展動物體內(nèi)試驗(yàn)檢測S51在動物體內(nèi)的安全性和解毒效果。