基于轉(zhuǎn)錄組分析的甘薯貯藏根淀粉含量相關(guān)SNPs開發(fā)

摘要：甘薯是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，貯藏根淀粉含量是甘薯的重要農(nóng)藝性狀，開發(fā)與淀粉含量相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)于加快育種進(jìn)程具有重要意義。但甘薯具有自交不親和特性，基因組是高度雜合的六倍體，增加了開發(fā)分子標(biāo)記的難度。本試驗(yàn)以高淀粉品種漯徐薯8號(hào)和低淀粉品種鄭薯20及其雜交F1代中6個(gè)高淀粉株系和6個(gè)低淀粉株系為材料，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析并結(jié)合表型分析，發(fā)現(xiàn)44個(gè)高淀粉特異的SNPs位點(diǎn)，從中選取9個(gè)進(jìn)行PCR單克隆分析，篩選到3個(gè)與高淀粉含量顯著相關(guān)的位點(diǎn)，分別為chr9.27120209、chr9.27120256和chr9.13675504，用上述12個(gè)株系和F1群體中的另外16個(gè)株系進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到3個(gè)與貯藏根淀粉含量相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)。本試驗(yàn)豐富了甘薯分子標(biāo)記開發(fā)的途徑，為甘薯貯藏根淀粉含量相關(guān)育種提供了可選擇的標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：甘薯；貯藏根；淀粉含量；單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記；轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類號(hào)：S531.01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）12-0010-06

SNP（singe nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）、SSR（ simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列）、InDel（insertion and deletion，插入和缺失）等標(biāo)記是基于染色體序列多態(tài)性的分子標(biāo)記，很多與農(nóng)藝性狀緊密關(guān)聯(lián)，可在作物輔助選擇育種方面發(fā)揮作用，是基因編輯潛在的位點(diǎn)，目前在水稻、小麥、玉米、糜子、蠶豆、木薯等作物中已有比較深入的研究。

甘薯是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，前人也有關(guān)于其分子標(biāo)記開發(fā)的研究，例如Xiao等對(duì)314個(gè)甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行深度測(cè)序，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)lbZEP1啟動(dòng)子變異與果肉顏色顯著相關(guān)：Nie等對(duì)收集自韓國各地的66份甘薯種質(zhì)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了與貯藏根的糖分相關(guān)性狀及總淀粉、直鏈淀粉和總類胡蘿卜素含量顯著相關(guān)的63個(gè)SNPs；Kim等對(duì)96個(gè)甘薯基因型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在3號(hào)和4號(hào)染色體上分別鑒定出兩個(gè)與鐮刀菌根腐病抗性相關(guān)的重要SNPs標(biāo)記。但這些分子標(biāo)記都是在基因組水平上進(jìn)行的開發(fā)，而甘薯具有自交不親和性且基因組是高度雜合的六倍體，這增加了在基因組水平上開發(fā)分子標(biāo)記的難度。因此，本研究選用高淀粉品種漯徐薯8號(hào)與低淀粉品種鄭薯20的雜交F1代群體，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和貯藏根淀粉含量表型分析，嘗試從雜交群體株系的轉(zhuǎn)錄組水平開發(fā)甘薯貯藏根淀粉含量相關(guān)SNPs分子標(biāo)記，以期為基因編輯提供可選擇的位點(diǎn)，并為甘薯分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試甘薯材料為高淀粉含量品種漯徐薯8號(hào)（LXS8）、低淀粉含量品種鄭薯20（ZS20）及其雜交F1代群體240個(gè)株系。2015-2017年在山東省濟(jì)南市紙坊村（116.97°E，36.42°N）和龐莊村（116.73°E，36.39°N）種植。

1.2貯藏根淀粉含量測(cè)定

10月中旬甘薯收獲時(shí)，選取中等大小的貯藏根，常溫保存，于一周之內(nèi)進(jìn)行淀粉含量測(cè)定。淀粉含量的測(cè)定采用酶水解的蒽酮比色法，略有修改。

1.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析

將從F1代群體中選出的6個(gè)高淀粉株系和6個(gè)低淀粉株系以及兩個(gè)親本同時(shí)育苗移栽，在移栽后第113天收獲，每個(gè)品種（系）收集3個(gè)中等大小的貯藏根，用純凈水沖洗干凈后，用打孔器從每個(gè)貯藏根中部取一個(gè)直徑為0.5 cm的圓柱形樣品，立即置于液氮中快速冷凍，儲(chǔ)存在-80℃冰箱中備用。

采用Trizol法從樣品中提取總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集帶有polyA尾的mRNA。將獲得的RNA樣品用斷裂緩沖液進(jìn)行片段化處理，用隨機(jī)N6引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后合成雙鏈DNA；將合成的雙鏈DNA末端平末端化，并在5’端磷酸化，在3’端形成一個(gè)帶有“A”的黏性末端，并連接一個(gè)3’端帶有突出“T”的接頭：連接產(chǎn)物通過特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)熱變性形成單鏈，使用橋接引物將單鏈DNA環(huán)化，從而獲得用于BGISEQ-500平臺(tái)測(cè)序的單鏈環(huán)狀DNA文庫。計(jì)算測(cè)序數(shù)據(jù)的Q20和Q30值以評(píng)估測(cè)序質(zhì)量。

將測(cè)序得到的轉(zhuǎn)錄組序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析，使用GATK檢測(cè)SNPs信息：對(duì)于得到的SNPs位點(diǎn)，在親本、6個(gè)高淀粉株系和6個(gè)低淀粉株系間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在漯徐薯8號(hào)和6個(gè)高淀粉株系中特有的SNPs位點(diǎn)。

1.4SNPs位點(diǎn)的PCR單克隆驗(yàn)證分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，依據(jù)SNPs位點(diǎn)兩側(cè)序列信息設(shè)計(jì)引物（表1），用多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取親本和F1群體分析的各株系貯藏根基因組，作為PCR模板。配制20 uL PCR反應(yīng)體系：5×pfu buffer 4 uL，2.5 mmol/L dNTPs l uL，10 mmol/L primer F0.5 uL，10 mmol/L primer R 0.5 uL，50 mmol/LMgSO4 0.5 uL，PfuDNA聚合酶0.2 uL，DNA模板0.5 uL，加水至20 uL。在Bio-Rad PCR儀（580BR）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，32個(gè)循環(huán)；72℃保溫10 min。PCR產(chǎn)物在Bio-Rad電泳儀上用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，切膠回收目的條帶?；厥誔CR產(chǎn)物構(gòu)建pEASY-Blunt克隆載體（TRANSGEN公司），連接體系包括PCR回收產(chǎn)物4 uL、pEASY-Blunt 1 uL，連接后室溫靜置5 min。將克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取陽性單克?。?0個(gè)以上）進(jìn)行測(cè)序，基于測(cè)序結(jié)果對(duì)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

1.5雜交群體中SNPs位點(diǎn)與表型分析

按照基因型（純合體和雜合體）對(duì)測(cè)序的14個(gè)株系和F1代群體中另外16個(gè)株系進(jìn)行歸類，用Microsoft Excel對(duì)不同基因型間的淀粉含量進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1F1代雜交群體貯藏根淀粉含量分布

對(duì)漯徐薯8號(hào)與鄭薯20的雜交F1代群體進(jìn)行3年2點(diǎn)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，F(xiàn)1代群體貯藏根淀粉含量主要集中在19％-lt;31％之間，最高為（33.45±3.34）％，最低為（10.51±0.56）％，呈偏正態(tài)分布（圖1），符合后續(xù)試驗(yàn)研究的要求。

2.2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

對(duì)雜交群體中6個(gè)高淀粉和6個(gè)低淀粉株系以及兩個(gè)親本的貯藏根分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析（表2），共獲得154.31 GB的有效數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣本11.02 GB；共檢測(cè)到85 493個(gè)基因，NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中72 425個(gè)為已知基因，13 068個(gè)為新基因；與參考基因組比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)1 647 113個(gè)SNPs位點(diǎn)，168 775個(gè)Indel位點(diǎn)（表3）。

2.3SNPs位點(diǎn)分析及PCR單克隆驗(yàn)證

結(jié)合淀粉含量數(shù)據(jù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了44個(gè)高淀粉特異的SNPs變異位點(diǎn)，從中隨機(jī)選擇9個(gè)進(jìn)行PCR單克隆測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)，除chr9.27411023位點(diǎn)在高淀粉親本漯徐薯8號(hào)中沒有發(fā)現(xiàn)胞嘧啶核苷酸（C），與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致，其余8個(gè)位點(diǎn)的PCR單克隆驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均一致。

2.4高淀粉特異SNPs位點(diǎn)的篩選與雜交群體驗(yàn)證

除轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析選用的12個(gè)株系外，又從F1代群體其余株系中隨機(jī)選擇16個(gè)，以這28個(gè)株系及兩親本為材料，利用PCR單克隆測(cè)序?qū)ι鲜?個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分析，按照SNPs位點(diǎn)基因型分為純合體和雜合體兩類，然后結(jié)合貯藏根淀粉含量數(shù)據(jù)（表5），從中篩選到3個(gè)與高淀粉含量顯著相關(guān)（Plt;0.05）的位點(diǎn)（表6、表7）；chr9.27120209（G-A）位點(diǎn)以及位于其下游47 bp處與其緊密連鎖的chr9.27120256（A-G）位點(diǎn)，即（GA-AG），通過與參考基因組比對(duì)，位點(diǎn)所在序列注釋為編碼甘油激酶的基因：還有一個(gè)是clu9.13675504（G-C）位點(diǎn)，通過與參考基因組比對(duì)，位點(diǎn)所在序列注釋為編碼組蛋白H2B-Iike的基因。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)SNPs位點(diǎn)所在轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量在高、低淀粉株系間沒有顯著性差異（表8）。按照甘薯遺傳密碼子，將位點(diǎn)所在基因序列翻譯成氨基酸序列，clu9.27120209位點(diǎn)密碼子由AAC變?yōu)锳AU（互補(bǔ)鏈），都編碼天冬氨酸；chr9.27120256位點(diǎn)密碼子由UUA變?yōu)镃UA（互補(bǔ)鏈），都編碼亮氨酸：clu：9.13675504位點(diǎn)密碼子由GUG變?yōu)镚UC，都編碼纈氨酸?？梢姡琒NPs位點(diǎn)的變異沒有引起氨基酸序列的差異。

3討論

貯藏根淀粉含量是甘薯的重要農(nóng)藝性狀，開發(fā)與貯藏根淀粉含量相關(guān)的SNPs標(biāo)記對(duì)于甘薯淀粉含量相關(guān)分子育種具有重要意義。甘薯貯藏根的淀粉含量受到基因型和環(huán)境的影響，變化較大。本試驗(yàn)選擇的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的高淀粉株系組中最低淀粉含量為（25.38±1.89）％，低淀粉株系組中最高淀粉含量為（15.89±1.03）％，這保證了高、低淀粉含量株系組間淀粉含量的差異主要與基因型相關(guān)。對(duì)高、低淀粉含量株系組間的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，就可以發(fā)現(xiàn)與淀粉含量相關(guān)的SNPs分子標(biāo)記。本試驗(yàn)在驗(yàn)證的9個(gè)SNPs位點(diǎn)中，有3個(gè)SNPs位點(diǎn)與淀粉含量顯著相關(guān)。

目前已有的甘薯分子標(biāo)記主要是在染色體水平上開發(fā)的，需要有足夠大的群體基因組數(shù)據(jù)和性狀數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)方法與其相比，僅需要部分表型極端的個(gè)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上結(jié)合表型性狀進(jìn)行分析，依據(jù)分析獲得的結(jié)果在群體中進(jìn)行單點(diǎn)驗(yàn)證，并結(jié)合表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，這樣可以在節(jié)省成本的情況下針對(duì)性地開發(fā)相關(guān)性狀分子標(biāo)記。同時(shí)基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的分子標(biāo)記還可以獲得其所在基因的表達(dá)信息，這有利于SNPs位點(diǎn)與表型性狀關(guān)系的機(jī)理解析。

甘油激酶可以將甘油磷酸化形成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在3-磷酸甘油脫氫酶的催化下又被氧化成磷酸二羥丙酮，參與糖酵解和合成途徑。糖酵解和合成途徑與淀粉合成緊密相關(guān)。據(jù)此推測(cè)甘油激酶中的chr9. 27120209/chr9.27120256位點(diǎn)SNPs與甘薯淀粉含量可能存在一定的關(guān)系。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)所在的甘油激酶基因的表達(dá)量在高、低淀粉含量的株系間沒有顯著差異，說明這個(gè)SNPs位點(diǎn)對(duì)淀粉含量的影響與基因的表達(dá)量無關(guān)。甘油激酶蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)的變化沒有引起氨基酸的變化，說明這個(gè)SNPs位點(diǎn)對(duì)淀粉含量的影響與甘油激酶結(jié)構(gòu)的變化無關(guān)，其具體的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

組蛋白H2B參與了染色體結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和基因表達(dá)的調(diào)控。組蛋白H2B的基因表達(dá)量和氨基酸序列并沒有因chr9.13675504位點(diǎn)SNP的改變而改變。這個(gè)SNP位點(diǎn)與淀粉含量的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本試驗(yàn)以高淀粉含量的漯徐薯8號(hào)和低淀粉含量的鄭薯20及其雜交F1代中6個(gè)高淀粉含量株系和6個(gè)低淀粉含量株系為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合表型性狀進(jìn)行分析，并在雜交群體中另外選擇16個(gè)株系進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與淀粉含量相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，分別為chr9.27120209、chr9.27120256和chr9.13675504。本試驗(yàn)豐富了甘薯分子標(biāo)記開發(fā)的途徑，對(duì)甘薯淀粉含量相關(guān)育種提供了可選擇的標(biāo)記。