堿脅迫下油莎豆幼苗生理代謝和轉錄組分析

摘要：油莎豆是一種草本油料作物，也是糧、油、飼、肥應用型經濟作物，綜合利用價值很高，而且油莎豆具有抗旱和耐鹽堿特性，明確其耐鹽堿分子調控機制可為其分子育種奠定基礎。本研究對油莎豆幼苗進行100 mmol/L混合堿（NaHCO3+Na2Co3，摩爾比2：1）脅迫處理，并分別于處理0、3、6、9、12 d取樣，進行丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白（SP）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸（Pro）含量、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性等生理指標的測定和轉錄組測序分析。結果表明，SOD和CAT活性在處理前6d迅速上升，之后平緩下降；POD活性先迅速上升，脅迫6d后迅速下降；MDA含量在堿脅迫下表現為先逐漸上升，6d后上升迅速；Pro和SP含量在堿脅迫時均表現出逐漸增大趨勢，前者上升迅速，后者上升相對平緩。轉錄組分析發(fā)現，在堿脅迫6d時，共鑒定出5 842個差異表達基因（DEGs），其中上調3 136個，下調2 706個。CO和KECC聚類分析顯示，DECs在植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝等過程中顯著富集。此外，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析結果與轉錄組分析結果大致相同，這證實了RIVA-seq數據的有效性。本研究結果為深入了解油莎豆幼苗對堿脅迫的響應機制提供了重要信息。

關鍵詞：油莎豆；堿脅迫；生理特性；轉錄組分析

中圖分類號：S565.9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）12-0001-09

土壤鹽堿化嚴重影響植物生長發(fā)育，對全球農業(yè)造成了一定的威脅。據統(tǒng)計，全球有上百個國家存在鹽堿地，我國鹽堿地面積約占全球總鹽堿地面積的10％，高達約1億hm2，其中有920.9萬hm2的鹽堿化耕地，占我國耕地面積的6.62％。東北地區(qū)是我國最大的鹽堿地分布區(qū)，僅松嫩平原鹽堿地面積就高達373.3萬hm2。全球氣候變暖等自然因素以及大面積開荒等人為因素導致土壤次生鹽堿化日益加重，嚴重影響了我國農業(yè)的發(fā)展，因此，利用基因工程等技術手段來篩選農作物耐鹽堿基因，培育耐鹽堿品種，提高鹽堿地開發(fā)和利用率，對我國經濟發(fā)展和糧食安全具有重要意義。

油莎豆（Cyperus esculentus L.）是莎草科的草本油料作物，脂肪含量約為30％，且油脂脂肪酸組成與橄欖油相近，不飽和脂肪酸約占80％（油酸65％-70％，亞油酸12％-15％），而且還富含淀粉、糖、維生素和礦物質等，被廣泛用于食品加工、釀酒、榨油以及化妝品、藥品生產等。油莎豆原產地為沙漠干旱地區(qū)，具有耐旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿、適應性廣的特點，非常適宜荒漠化等邊際土地種植，可以實現在不與主糧爭地的同時為國家食用油及糧食安全做出貢獻，是一種可以用于鹽堿地改良和邊際土地利用的優(yōu)質作物。

當植物開始遭受堿脅迫時，會迅速產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS作為第二信使，參與植物生長過程中的多種反應。但當植物體內ROS濃度過高時，會導致膜脂過氧化并產生大量丙二醛（malondialdehyde，MDA），使膜透性增加。為了抵御脅迫，植物會啟動體內的酶促和非酶促清除系統(tǒng)來清除體內多余的ROS，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶以及脯氨酸（proline，Pro）、可溶性蛋白（soluble protein，SP）等滲透調節(jié)物質，以減少脅迫帶來的傷害。

同時，植物在抵抗堿脅迫時發(fā)生的一系列生理生化反應又會誘導堿脅迫相關基因的表達，這些基因參與激素信號轉導、離子轉運、氧化還原、滲透調節(jié)等多種生物學過程，其存在與否及表達差異使植物呈現出對堿脅迫不同的耐受程度，因此，分析堿脅迫相關基因的表達差異和模式可為解析植物的耐堿機制奠定基礎。轉錄組測序技術（RNA-seq）常被用來分析差異表達基因（DEGs），已被應用于擬南芥、玉米、大豆等多種植物的堿脅迫相關基因表達檢測。

國內對油莎豆的研究起步較晚，對其抵御堿脅迫的研究相對較少，尚缺乏對其堿脅迫機制的全面深入了解。本研究以NaHCO3和Na2CO3混合堿溶液模擬堿脅迫環(huán)境，通過測定油莎豆苗期葉片與堿脅迫有關的生理指標解析堿脅迫下其生理代謝的規(guī)律，并用RNA-seq挖掘差異基因，了解油莎豆的分子響應機制，以期為油莎豆在鹽堿地的種植及耐堿品種的培育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

油莎豆品種選用吉林省農業(yè)科學院經濟植物研究所選育的‘吉莎2號’。100 mmol/L堿脅迫溶液用分析純NaHCO3和Na2CO3按摩爾比2：1混合配制。試驗于2022年5月10日至12月30日進行。

1.2試驗設計

選取籽粒飽滿的油莎豆種子，在35℃恒溫培養(yǎng)箱中用清水浸種24 h，然后取出用濕毛巾包裹住放人鐵盤中，再繼續(xù)放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽：待芽發(fā)齊后移栽至裝有蛭石與細沙（1：1混合）的育苗缽（9 cmx9 cmx8 cm）中，每缽一株；將育苗缽放在育苗盤中培育，期間每3d澆一次水，7d后待幼苗三片葉時進行混合堿脅迫處理（A），以未進行脅迫處理的幼苗為對照（CK）。每個處理設3次重復，每個重復10株。分別在處理0、3、6、9、12 d取葉樣，用于生理指標測定以及轉錄組測序分析。

1.3生理指標測定

SOD活性測定采用氮藍四唑（NBT）法，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性測定采用紫外吸收法，SP含量測定采用考馬斯亮藍（G-250）染色法，Pro含量測定采用磺基水楊酸法，淀粉酶含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。

1.4轉錄組測序分析

1.4.1提取RNA、構建文庫以及轉錄組測序 根據生理指標測定結果，選取處理6d的油莎豆葉片，委托北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序。先構建cDNA文庫，然后使用IlluminaNovaSeq6000測序平臺進行測序，過濾篩選后得到高質量的Clean Data；利用Triruty軟件進行序列組裝，篩去表達量低的轉錄本，統(tǒng)計Unigene的長度。

1.4.2Unigene功能注釋 通過比較堿脅迫處理與對照的基因表達量，得到差異表達基因（DEGs）。利用FPKM值表示對應Unigene的表達豐度。差異倍數（Fold Change）表示兩樣品（組）間表達量的比值。錯誤發(fā)現率（1 discover rate，FDR）是通過對差異顯著性P值（P-val-ue）進行校正得到的，表示差異的顯著性。本試驗中將Fold Change≥2且FDRlt;0.01作為篩選標準。

用DIAMOND軟件將Urugene序列與KEGG數據庫比對，用KOBAS得到KEGGOnhology結果；用InterProScan基于InterPro整合的數據庫分析新基因的GO Orthology結果；預測完Unigene的氨基酸序列后使用HMMER軟件與Pfam數據庫比對，獲得Urugene的注釋信息。

1.4.3熒光定量PCR驗證候選基因 為了驗證轉錄組測序分析結果的準確性，從富集通路中篩選出11個DEGs進行熒光定量PCR檢測。使用RNA提取試劑盒（天根）提取堿脅迫6d的油莎豆苗葉片的總RNA。使用Mi曲tyScript第一鏈cDNA合成Master Mix反轉錄試劑盒（生工）將RNA反轉錄成cDNA。利用IDT's PrimerQuestTool（https：//www.idtdna.com）設計特異性引物，以CeUCE2作為內參基因，然后采用2-△△Ct法計算基因相對表達量，并與轉錄組測序分析得到的FPKM值進行對比。

2結果與分析

2.1堿脅迫對油莎豆生理代謝的影響

如圖1所示，堿脅迫后油莎豆葉片中的SOD、POD、CAT活性及MDA、SP、Pro含量均明顯升高。隨著堿脅迫時間的延長，MDA、SP、Pro含量均持續(xù)上升，而SOD、POD、CAT活性呈現先上升后下降的趨勢，且均在處理6d時最高，說明處理第6天是研究堿脅迫響應機制的最佳采樣時間。

2.2堿脅迫后的差異表達基因分析

根據生理指標分析結果，選取堿脅迫6d的油莎豆幼苗葉片，利用RNA-seq技術進行轉錄組測序分析，比較組名稱為CK vs A。使用Unigene數據集作為進一步分析的參考，DEGs則通過DESeq2進行評估。結果顯示，共鑒定到5 842個DEGs，其中上調3 136個，下調2 706個（圖2）。

2.3GO富集分析

對鑒定到的DEGs進行GO富集分析，結果見圖3。在生物學過程方面，細胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、生物調節(jié)（biologcal regulation）、應激反應（response to stimulus）等在堿脅迫下被顯著富集。在細胞組分方面，細胞解剖實體（cellular anatomical entity）、細胞內（intracellular）、蛋白質復合物（proteincontaining complex）等在堿脅迫下被顯著富集。在分子功能方面，結合（binding）、催化活性（catalytic activity）、轉運體活性（transponer activity）、轉錄調節(jié)活性（transcription regulator activity）等在堿脅迫下被顯著富集。

2.4KEGG通路分析

根據KEGG注釋結果，發(fā)現共有1 832個DEGs注釋到KEGG數據庫，富集到127個代謝通路中。其中，大多DEGs注釋到代謝通路，占被注釋基因總數的70.42％；注釋到環(huán)境信息處理、基因信息處理、生物有機體系統(tǒng)通路的DEGs分別占18.94％、14.41％、14.13％：注釋到細胞過程的DEGs最少，僅占5.19％（圖41）。在分類通路中，富集DEGs最多的通路為植物一病原互作（plant-pathogen interaction），有221個DEGs，占12.06qo；其次為植物激素信號轉導（plam hormonesignal transduction），有174個DEGs，占9.49％；MAPK信號通路－植物（MAPK signaling pathway-plant）、碳代謝（carbon metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）通路分別注釋有110、98、86、83個DEGs，占比分別為6.00％、5.35％、4.69％、4.53％。

進一步分析與堿脅迫相關的主要通路，結果（圖4Ⅱ）表明，q值gt;0.05的通路為植物激素信號轉導以及淀粉和蔗糖代謝。推測堿脅迫下油莎豆通過高富集表達與植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝相關的基因來提高植株的堿脅迫耐性。

2.5qRT-PCR對DEGs高富集通路的驗證分析

2.5.1植物激素信號轉導通路 上述分析結果顯示植物激素信號轉導通路（k004075）在GO和KEGG中均有DEGs富集，因此對該通路中DEGs表達明顯發(fā)生改變的赤霉素（圖5 Ⅰ、Ⅱ）和脫落酸（ABA）（圖5Ⅲ、Ⅳ）兩個通路進行進一步分析，并從中選取9個DEGs進行qRT-PCR驗證分析，結果（圖6）顯示，qRT-PCR結果與RNA-seq結果在表達量上存在差異，但在CK和堿脅迫下的變化趨勢相似，證明了本研究轉錄組測序結果的合理性和可靠性。

2.5.2淀粉和蔗糖代謝通路 KEGG分析顯示在淀粉和蔗糖代謝途徑（ko00500）（圖7Ⅰ）富集的DEGs表達也明顯改變（圖7Ⅲ）；而且堿脅迫6d的油莎豆葉片中，a-淀粉酶活性顯著降低，B-淀粉酶和總淀粉酶活性顯著升高（Plt;0.05）（圖7Ⅱ）。因此推測淀粉和蔗糖代謝途徑也參與了油莎豆對堿脅迫的響應。對該通路富集的兩個表達明顯改變的DEGs進行qRT-PCR分析，結果（圖8）顯示，qRT-PCR結果與RNA-seq結果在CK和堿脅迫下的表達趨勢相似且表達量相近，再次證明了本研究轉錄組測序結果的合理性和可靠性。

3討論

苗期是植物對外界環(huán)境十分敏感的時期，也是進行脅迫處理的關鍵時期。堿脅迫對植物組織和器官的發(fā)育影響顯著，因此明確油莎豆苗期對堿脅迫的響應機制對提高其耐堿性具有重要意義。前人研究發(fā)現，堿脅迫后植物地上部生物量的降低程度顯著高于地下部生物量，說明地上部對堿脅迫更敏感。因此，本研究選用堿脅迫下的油莎豆苗期葉片進行生理指標測定和轉錄組測序分析。

堿脅迫通常會對植物造成滲透脅迫、次生傷害以及離子毒害等，為了維持正常生長，植物會啟動體內的酶促清除系統(tǒng)（SOD、POD、CAT等抗氧化酶）來緩解ROS帶來的傷害，同時通過積累SP、Pro等滲透調節(jié)物質降低滲透脅迫傷害。本研究結果顯示，混合堿脅迫下，油莎豆葉片中的SOD、POD、CAT活性均呈先上升后下降趨勢，且均在處理第6天達到峰值，之后均顯著下降；MDA含量在脅迫過程中持續(xù)增加，尤其脅迫處理6d后快速升高。這可能是因為堿脅迫初期，油莎豆能夠通過提升體內相關抗氧化酶活性快速清除ROS，維持植株正常生長：但隨著脅迫時間的延長，活性氧積累-清除平衡被打破，ROS過量積累，對細胞膜系統(tǒng)造成脂質過氧化傷害，從而導致MDA大量積累，抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞，酶活性下降。孔德真等研究表明，當用200 mmol/LNa2CO3處理高丹草時，在0-12 h抗氧化酶活性顯著上升，超過12 h則逐漸下降。這與本研究結果一致，說明抗氧化酶活性在植物抗逆過程中發(fā)揮作用時受到細胞自主活性的限制。另外，本研究結果顯示Pro、SP含量也均隨著堿脅迫時間的延長呈顯著上升趨勢，這與麻瑩等在鹽地堿蓬、劉佳等在山桃中的研究結果一致。綜上，處理第6天是研究油莎豆苗期對堿脅迫響應機制的合適采樣時間，因此本研究選用堿脅迫處理第6天的油莎豆葉片樣品進行后續(xù)轉錄組測序分析。

耐堿相關基因會在植物受到堿脅迫時迅速響應，但因為差異基因的存在，不同植物的耐堿性不同。本研究利用RNA-seq技術檢測了100mmol/L混合堿處理第6天的油莎豆苗期葉片的基因表達情況，結果顯示，堿脅迫下有5 842個基因差異表達，其中3 136個上調表達，2 706個下調表達。

由于物種不同以及脅迫處理的溶液、濃度、時間的不同，DEGs富集的GO條目和KEGG通路會有所差別，但也會存在很大的相似性。魏嘉等研究發(fā)現，在100 mmol/L Na2CO3脅迫6d的野生大豆中，DEGs顯著富集在細胞、細胞部分、結合、催化活性等GO條目。本研究結果顯示，DEGs顯著富集在細胞過程、代謝過程、結合等GO條目中，有與上述野生大豆相似的條目，說明這些條目可能與堿脅迫響應密切相關。

植物中大部分耐堿基因與其脅迫下的生理代謝過程相對應，比如與滲透調節(jié)、植物激素信號轉導和離子轉運相關的基因等。本研究在KEGG分析中發(fā)現，大多數DEGs被注釋到植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝、卟啉和葉綠素代謝等通路上。這與李慧姬用堿脅迫辣椒13 h得到的DEGs主要富集在類黃酮生物合成、淀粉和蔗糖代謝、類胡蘿卜素的生物合成等通路大致相同，說明堿脅迫對植物生理過程產生的影響非常復雜。

植物對非生物脅迫尤其是堿脅迫的響應機制有很多，激素信號轉導是其核心途徑，其中，堿脅迫可以誘導ABA、赤霉素快速響應，進而引發(fā)植物一系列的生理生化反應，以抵御堿脅迫傷害。在本研究中，GO和KEGG分析均發(fā)現DEGs在ABA和赤霉素相關途徑有富集，表明兩者均參與了油莎豆對堿脅迫的響應。同時，本研究中DEGs在淀粉和蔗糖代謝途徑也有較多富集，而且油莎豆幼苗葉片中的淀粉酶活性在堿脅迫下也發(fā)生了顯著變化，這表明淀粉和蔗糖代謝途徑也在油莎豆抵御堿脅迫時發(fā)揮了作用。

4結論

油莎豆苗期對混合堿脅迫具有一定的耐性，脅迫6d是對其進行轉錄組測序分析的最佳取樣時間。從堿脅迫6d的油莎豆葉片中，共鑒定到3 136個上調表達和2 706個下調表達基因，這些DEGs主要富集在植物激素信號轉導（ko04075）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）等途徑。本研究結果可為油莎豆耐堿品種選育和耐堿分子機制解析奠定基礎。