基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析多發(fā)性硬化相關(guān)的鐵死亡基因及其免疫浸潤(rùn)

摘 要：目的 通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析探討多發(fā)性硬化（MS）中鐵死亡基因免疫浸潤(rùn)及綜合網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。方法 采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法鑒定MS中相關(guān)鐵死亡基因表達(dá)，通過GO和KEGG進(jìn)行富集分析。運(yùn)用LASSO和SVM-RFE算法識(shí)別MS中的關(guān)鍵鐵死亡基因，采用ROC曲線分析評(píng)價(jià)其診斷效能。構(gòu)建MS小鼠模型通過qRT-PCR驗(yàn)證其表達(dá)。CIBERSORT算法探索關(guān)鍵鐵死亡基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape分別預(yù)測(cè)候選小分子化合物/藥物、轉(zhuǎn)錄因子和miRNA。結(jié)果 篩選出MS中39個(gè)為鐵死亡基因，與氧化應(yīng)激相關(guān)。確定了BRD7、MTDH和SMAD7為MS關(guān)鍵鐵死亡基因，三者的診斷效能高，在MS小鼠模型中表達(dá)均較對(duì)照組升高；且與免疫浸潤(rùn)高度相關(guān)。 結(jié)論 MS中鐵死亡基因BRD7、MTDH及SMAD7與免疫浸潤(rùn)密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：多發(fā)性硬化；鐵死亡；轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析；免疫浸潤(rùn)

中圖分類號(hào)：R744.51 " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1671-0142（2024）06-0070-05

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)行性自身免疫相關(guān)的炎性脫髓鞘疾病，其以炎性反應(yīng)、軸突損傷、脫髓鞘、神經(jīng)元死亡和血-腦屏障破壞為特征[1-3]。MS好發(fā)于29～39歲，女性更為多見，中國(guó)整體人群MS發(fā)病率為0.235/10萬(wàn)人年，復(fù)發(fā)率及致殘率高，于2018年被列入中國(guó)《第一批罕見病目錄》[4]。

目前，MS的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。Luoqian等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，鐵死亡可刺激MS小鼠模型即實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠的脫髓鞘和炎癥改變[5]。此外，Rayatpour等學(xué)者在局灶性脫髓鞘模型中發(fā)現(xiàn)鐵死亡基因表達(dá)升高[6]。誘導(dǎo)鐵死亡的因素可能促進(jìn)MS的進(jìn)展，但機(jī)制尚未明確。因此，靶向鐵死亡的治療靶點(diǎn)可能逆轉(zhuǎn)MS的進(jìn)展[6]，探索MS的鐵死亡基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控特征，有助于闡明鐵死亡在MS中的致病機(jī)制，為MS的治療尋找潛在藥物靶點(diǎn)。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中關(guān)于MS患者腦組織樣本的基因芯片數(shù)據(jù)集，探討MS相關(guān)差異表達(dá)鐵死亡基因的生物學(xué)功能、免疫浸潤(rùn)情況，為MS的發(fā)病機(jī)制和診治研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理及鐵死亡基因集獲取 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選并下載GSE131282的基因表達(dá)譜芯片作為訓(xùn)練集，其中包含來(lái)自63例MS患者的142個(gè)腦組織樣本和來(lái)自14例對(duì)照者的42個(gè)腦組織。同時(shí)下載GSE135511芯片作為驗(yàn)證集。使用RStudio軟件（版本4.1.2）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。同時(shí)，從FerrDb V2數(shù)據(jù)庫(kù)下載鐵死亡基因集。

1.2 DEG分析 “l(fā)imma”軟件包篩選GSE131282中收集的MS患者和對(duì)照組的皮質(zhì)樣本中的差異表達(dá)基因，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：矯正后Plt;0.05和基因表達(dá) Log 倍數(shù)變化（Log fold change，LogFC）絕對(duì)值gt;0.585。使用“ggplot2”和“pheatmap”R軟件包可視化差異基因。

1.3 鐵死亡相關(guān)基因的鑒定和富集分析 從FerrDb V2數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人的鐵死亡基因集。利用MS的差異表達(dá)基因與鐵死亡基因集取交集，獲得MS中相關(guān)鐵死亡基因。本研究通過David在線數(shù)據(jù)庫(kù)中GO（Gene Ontology）及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析探索MS相關(guān)鐵死亡基因的功能及通路網(wǎng)絡(luò)。Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R軟件中“ggplot2”包用于可視化富集分析結(jié)果。

1.4 基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選MS關(guān)鍵的鐵死亡基因 為了獲取關(guān)鍵的MS鐵死亡基因，本研究使用R中的“glmnet”和“mlbench”和“caret”包進(jìn)行LASSO（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）和SVM-RFE（Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination）分別從MS相關(guān)鐵死亡基因中篩選特征基因，并將此兩種算法得到的基因取交集后作為MS的關(guān)鍵鐵死亡基因。

1.5 MS關(guān)鍵鐵死亡基因的診斷效能評(píng)估 本研究利用受試者工作特征曲線（Receiver Operating Characteristic Curve，ROC）評(píng)估GSE131282基因表達(dá)譜芯片篩選的MS關(guān)鍵鐵死亡基因的診斷性能，利用ROC曲線下面積（Area Under Curve，AUC）值衡量關(guān)鍵鐵死亡基因診斷MS的效果。此外，在GSE135511集中驗(yàn)證關(guān)鍵鐵死亡基因的診斷價(jià)值。

1.6 MS動(dòng)物模型構(gòu)建及關(guān)鍵鐵死亡基因表達(dá)驗(yàn)證 為在MS動(dòng)物模型中驗(yàn)證關(guān)鍵鐵死亡基因的表達(dá)量，本研究根據(jù)已有文獻(xiàn)的方法構(gòu)建EAE模型[7]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合ARRIVE指南并通過江蘇瀚江生物科技有限公司倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：HJSW-24070201）。動(dòng)物接受12 小時(shí)晝夜節(jié)律循環(huán)周期光照、恒溫恒濕飼養(yǎng)，食用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物滅菌后墊料、飼料及水。

免疫后21天收集腦組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)。使用RNA提取試劑盒（M5105，NCM， 中國(guó)），提取腦組織RNA，并用cDNA合成試劑盒（R333，Vazyme，中國(guó)）進(jìn)行cDNA合成。采用qPCR試劑盒SYBR Green Master Mix（AG11733，AG，中國(guó)）對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行定量，采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)水平。β-actin作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

1.7 關(guān)鍵MS鐵死亡基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析 本研究使用CIBERSORT算法評(píng)估MS腦組織的免疫浸潤(rùn)，在R軟件中進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，探討關(guān)鍵MS鐵死亡基因與浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，使用“ggplot2”包進(jìn)行可視化。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集采用RStudio（4.1.2）進(jìn)行分析，差異采用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析，數(shù)據(jù)以不少于三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。數(shù)據(jù)的正態(tài)性采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，兩組間比較采用Prism 9.0軟件中的非配對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。采用Spearman相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性。矯正后P值lt;0.05時(shí)，均認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MS中差異表達(dá)基因鑒定 差異分析鑒定出3438個(gè)矯正后Plt;0.05且LogFC絕對(duì)值gt;0.585的差異表達(dá)基因。

2.2 MS鐵死亡相關(guān)基因及其富集途徑的鑒定" 將MS的差異基因與DEGs和FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)中的鐵死亡基因相交取交集（圖1A），得到39個(gè)MS鐵死亡相關(guān)基因。GO富集分析中生物過程（biological process，BP）功能富集顯示，MS鐵死亡相關(guān)基因主要富集在響應(yīng)化學(xué)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡過程中；細(xì)胞成分（cell component，CC）分析表明，MS鐵死亡相關(guān)基因與過氧化物酶體、微體、自噬小體等顯著相關(guān)，且參與了多個(gè)分子功能（molecular function，MF）過程，包括雙鏈RNA結(jié)合、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)抑制劑活性等（圖1B）。KEGG分析顯示，MS的鐵死亡相關(guān)基因不僅在自噬、凋亡中富集，也在脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化及神經(jīng)退行性病變等途徑中富集（圖1C）。

2.3 基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選MS的關(guān)鍵鐵死亡基因 LASSO回歸分析從39個(gè)MS鐵死亡相關(guān)基因中篩選出9個(gè)特征基因（圖2A，B），SVM-RFE算法識(shí)別出了5個(gè)特征基因（圖2C），取交集篩選出三個(gè)重疊的基因作為MS的關(guān)鍵鐵死亡基因： BRD7、MTDH和SMAD7（圖2D）。

2.4 BRD7、MTDH及SMAD7的診斷性能評(píng)估 為了評(píng)估BRD7、MTDH和SMAD7的診斷價(jià)值，本研究通過ROC曲線計(jì)算其AUC值，三者的AUC值分別為： BRD7（0.992，95% CI：0.98～1.00）、MTDH（0.991，95% CI：0.977～1.00）和SMAD7（0.970，95% CI：0.937～1.00）。聯(lián)合BRD7、MTDH和SMAD7進(jìn)行ROC曲線得到AUC值為1.00，在驗(yàn)證集GSE135511中聯(lián)合BRD7、MTDH和SMAD7進(jìn)行ROC曲線得到AUC值為0.815，分析提示BRD7、MTDH和SMAD7能夠準(zhǔn)確診斷MS。

2.5 通過在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BRD7、MTDH及SMAD7的表達(dá) 通過qRT-PCR檢測(cè)EAE小鼠模型中MS關(guān)鍵鐵死亡基因的表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，EAE小鼠腦組織中BRD7、MTDH及SMAD7表達(dá)明顯升高（圖3）。

2.6 BRD7、MTDH及SMAD7與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性分析 BRD7、MTDH及SMAD7均與幼稚B細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞和激活的記憶CD4+ T細(xì)胞呈正相關(guān)。同時(shí)，它們與靜息的NK細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M1/M2呈負(fù)相關(guān)（圖4A，B，C）。

3 討論

MS是一種累積中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性致殘性疾病，其在異常的細(xì)胞及體液免疫作用下形成神經(jīng)炎癥及神經(jīng)退行性病變[8，9]，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，即使經(jīng)過規(guī)范DMT治療，大部分患者的殘疾功能障礙仍呈緩慢進(jìn)行性加重。隨著研究的不斷深入，研究者們認(rèn)為鐵死亡可能參與MS的神經(jīng)退行性改變，但具體機(jī)制仍未闡明。目前利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的研究較少[10]，因此，挖掘潛在的MS鐵死亡相關(guān)基因，可能為未來(lái)MS的治療提供新的方向。

本研究篩選出MS中39個(gè)異常表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因，富集分析發(fā)現(xiàn)MS中鐵死亡在響應(yīng)化學(xué)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等富集。有研究發(fā)現(xiàn)，在活躍的MS病變中，氧化的DNA和磷脂在脫髓鞘軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中積累，即氧化應(yīng)激參與了MS的發(fā)生[11]。鐵死亡受鐵穩(wěn)態(tài)、氧化應(yīng)激、能量代謝調(diào)控[6，12]，當(dāng)鐵依賴的活性氧積累和脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[13，14]。根據(jù)進(jìn)一步的KEGG分析，除了自噬和凋亡外，MS鐵死亡基因還在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化途徑、神經(jīng)退行性變途徑中富集。該分析結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，鐵死亡與其他形式的細(xì)胞死亡有關(guān)，如細(xì)胞凋亡和自噬[15]。MS鐵死亡基因的富集與動(dòng)脈粥樣硬化等重疊交叉，進(jìn)一步提示鐵死亡的一些潛在的關(guān)鍵分子和途徑參與MS的發(fā)生發(fā)展。

利用LASSO和SVM-RFE兩種基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法，在MS中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)關(guān)鍵的差異表達(dá)的鐵死亡基因：BRD7、MTDH和SMAD7，三者的AUC均大于0.90，提示三者對(duì)MS的診斷價(jià)值高。含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)7（Bromodomain-containing proteins 7，BRD7）是識(shí)別乙酰化賴氨酸的蛋白質(zhì)家族中密切相關(guān)的成員。BRD7的下調(diào)參與了多種疾病的病理生理特性[16]。Zhang等證實(shí)了BRD7通過線粒體鐵代謝途徑介導(dǎo)鐵死亡[17]。異粘蛋白（Metadherin，TDH）通過介導(dǎo)腫瘤的起始、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性參與多種類型癌癥的發(fā)展[18]。在MTDH調(diào)控的背景下，GPx4和SLC3A2表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽表達(dá)降低，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性[19]。在MS的體外和體內(nèi)研究中均發(fā)現(xiàn)，在靜脈注射潑尼松龍后SMAD7下調(diào)[20]。SMAD7是一種有效的肝素抑制劑，抑制肝素可破壞鐵的穩(wěn)態(tài)。Peng等人研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀誘導(dǎo)的SMAD7下調(diào)可抑制鐵死亡，改善缺血再灌注損傷[21]。綜上，僅有SMAD7在MS中報(bào)道過，且其與BRD7和MTDH在MS中的鐵死亡作用尚需探索。

最近，Luoqian等學(xué)者首次揭示了MS中T細(xì)胞活化與鐵死亡相關(guān)[5]。然而MS中免疫細(xì)胞和鐵死亡的關(guān)系復(fù)雜，仍需大量基礎(chǔ)研究。本研究發(fā)現(xiàn)BRD7、MTDH及SMAD7均與幼稚B細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞和激活的記憶CD4+ T細(xì)胞呈正相關(guān)。同時(shí)，它們與靜息的NK細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M1/M2呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)免疫細(xì)胞影響鐵代謝或釋放細(xì)胞因子引起鐵死亡時(shí)，鐵死亡也可能反過來(lái)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的激活和死亡。綜上，MS中BRD7、MTDH及SMAD7的基因介導(dǎo)的相關(guān)鐵死亡可能引起免疫細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的免疫擾動(dòng)[22]；也可能是MS中促炎和抗炎機(jī)制的失衡與免疫失調(diào)促發(fā)了鐵死亡相關(guān)基因尤其是BRD7、MTDH及SMAD7的差異表達(dá)，即鐵死亡-免疫浸潤(rùn)的交互作用參與MS的發(fā)病。

然而，本研究也存在局限性。首先，缺乏足夠的患者及動(dòng)物的樣本量驗(yàn)證鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)、免疫浸潤(rùn)情況及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。再者，未深入探索MS關(guān)鍵鐵死亡基因的具體致病機(jī)制。

4 結(jié)論

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法及機(jī)器學(xué)習(xí)方法，在MS中發(fā)現(xiàn)了與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)的鐵死亡相關(guān)基因BRD7、MTDH及SMAD7，為探索鐵死亡-免疫浸潤(rùn)參與MS慢性炎性脫髓鞘、神經(jīng)退行性變及免疫失調(diào)提供科學(xué)依據(jù)，并為MS的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供一個(gè)新的綜合視角。

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（責(zé)任編輯 楊荔晴）

Transcriptomic Analysis of Ferroptosis-Related Gene and Immune Infiltration in Multiple Sclerosis

ZHANG Shao-ru， ZHENG Zhi-peng， SHA Min， LU Hui-min

（The Affiliated Taizhou People's Hospital of Nanjing Medical University， Taizhou Jiangsu 225300， China）

Abstract： Objective To investigate the immune infiltration and integrated network regulation of multiple sclerosis （MS） by transcriptomic analysis. Methods The differentially expressed ferroptosis-related genes of MS was identified and the enrichment analysis was performed by GO and KEGG. LASSO and SVM-RFE algorithms were used to identify key ferroptosis-related genes in MS. ROC curve analysis was generated to test the predictive value of the key ferroptosis-related genes in MS. MS mouse model was constructed to verify their expression by qRT-PCR. The CIBERSORT algorithm explored the correlation of key ferroptosis-related genes and immune cell infiltration. Online databases and Cytoscape were applied respectively to predict candidate small molecule compounds / drugs， transcription factors and miRNA. Results 39 ferroptosis-related genes of MS were selected and they were found associating with oxidative stress. BRD7， MTDH and SMAD7 were identified as the ferroptosis-related genes of MS. These three genes had high diagnostic efficacy and were all increased in the MS mouse model compared with in the control group. Besides， they were highly associated with immune infiltration. Conclusion BRD7， MTDH and SMAD7 were closely related with immune infiltration.

Key words： multiple sclerosis; ferroptosis; transcriptomic analysis;immune infiltration