靈芝酸A對(duì)刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷小鼠模型的影響及其作用機(jī)制

摘要：目的"" 觀察靈芝酸A（GA-A）對(duì)刀豆球蛋白A（ConA）誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎（AIH）模型的治療作用。方法將35只小鼠隨機(jī)分為空白組（NC組）、模型組（ConA組）和GA-A低、中、高劑量治療組（GA-A-L組、GA-A-M組、GA-A-H組），每組各7只小鼠。通過尾靜脈注射ConA建立經(jīng)典AIH小鼠模型，1 h后通過腹腔注射不同劑量GA-A治療。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究GA-A對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，另外在體外用全反式維甲酸（ATRA）將HL-60細(xì)胞分化為dHL-60中性粒細(xì)胞來驗(yàn)證GA-A的作用機(jī)制。檢測炎癥（血清ALT和AST活性、HE染色及炎癥相關(guān)基因）、凋亡（TUNEL染色）、中性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NET）標(biāo)志物[髓過氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化組蛋白3（CitH3）、Ly6G、游離雙鏈DNA（dsDNA）]及p38磷酸化指標(biāo)。計(jì)量資料兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果 與NC組相比，ConA組小鼠血清ALT和AST水平顯著增加（P值均＜0.001）。與ConA組相比，GA-A治療顯著降低ALT和AST水平（P值均＜0.01）。HE染色結(jié)果表明，ConA組小鼠肝臟發(fā)生明顯壞死。GA-A治療后顯著減少肝壞死面積和TUNEL陽性肝細(xì)胞的數(shù)量（P值均＜0.05）。另外，與ConA組相比，GA-A治療后血清和肝組織中炎癥因子IL-6、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平顯著降低（P值均＜0.05）。蛋白質(zhì)組學(xué)分析提示，GA-A通過抑制NET的釋放和p38 MAPK通路來減輕ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷。小鼠肝組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，與ConA組相比，GA-A治療組MPO陽性中性粒細(xì)胞的數(shù)量及Ly6G和CitH3陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著降低（P值均＜0.01）。Western Blot及dsDNA結(jié)果顯示，GA-A顯著抑制小鼠肝組織及dHL-60細(xì)胞中的NET標(biāo)志物dsDNA、CitH3以及p38磷酸化水平（P值均＜0.05）。結(jié)論" GA-A抑制p38 MAPK通路和NET釋放減輕肝臟炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞死亡，從而減輕ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷。本研究為GA-A通過調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞功能治療免疫性肝損傷提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：靈芝酸A；伴刀豆球蛋白A；肝炎，自身免疫性；胞外誘捕網(wǎng)；蛋白質(zhì)組學(xué)；小鼠，近交C57BL

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性炎癥性肝病，其特點(diǎn)是血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高、自身抗體陽性，以及淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤[1-2]。嚴(yán)重情況下，AIH可迅速進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭[3]。AIH在歐美國家的發(fā)病率相對(duì)較高，在我國其確切發(fā)病率和患病率尚不清楚，但國內(nèi)文獻(xiàn)[4]報(bào)道的病例數(shù)呈明顯上升趨勢。肝臟免疫應(yīng)答異?；罨瘯?huì)導(dǎo)致肝組織損傷，但其作用機(jī)制尚不完全清楚[5-6]。目前，免疫抑制劑和肝移植是治療AIH的標(biāo)準(zhǔn)方法，然而，這些療法在一些AIH患者中會(huì)呈現(xiàn)無應(yīng)答狀態(tài)，也會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)[7]。因此，尋找潛在的治療藥物至關(guān)重要。

嗜中性粒細(xì)胞受到刺激后，產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET），在AIH中發(fā)揮了重要作用。中性粒細(xì)胞具有抗菌功能，并通過釋放NET殺死多種微生物病原體[8]。中性粒細(xì)胞分泌NET的過程被稱為NETosis，其通常需要中性粒細(xì)胞的激活及NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[9-10]。然而，由于NET組成成分復(fù)雜，可能引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織病變[11]。在感染、敗血癥、自身免疫和糖尿病相關(guān)的疾病中，NET引起的組織病變與細(xì)胞損傷直接相關(guān)[12-13]。

研究[14]表明，p38 MAPK通路調(diào)控免疫細(xì)胞活化和NET釋放。ROS依賴的p38 MAPK通路活化促進(jìn)NET釋放，以及NADPH氧化酶衍生的ROS下游的p38 MAPK參與NET細(xì)胞凋亡[15-16]。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，靈芝酸A（ganoderic acid A，GA-A）能改善肝臟氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)炎癥以減輕肝損傷。GA-A是一種三萜類化合物，是靈芝中的主要化合物[17]。研究[18]表明，GA-A抑制細(xì)胞釋放組胺，增強(qiáng)各種消化系統(tǒng)器官的功能，降低血脂和血壓，從而保護(hù)和調(diào)節(jié)肝功能。GA-A可以改善肝臟的氧化應(yīng)激[19-20]，并通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3和RhoA/ROCK通路發(fā)揮抗炎作用[21]。然而，GA-A在AIH治療中的作用和潛在機(jī)制尚不明確。本研究旨在明確GA-A對(duì)刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導(dǎo)的AIH小鼠的治療作用和潛在機(jī)制。

1"""" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組"" 35只6周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠購自上海中醫(yī)藥大學(xué)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（滬）2017-0010；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（滬）2018-0002。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

小鼠禁食14 h后，模型組（ConA組，n=7）小鼠通過尾靜脈注射15 mg/kg ConA（11028-71-0/C2010-100MG，Sigma- Aldrich，德國）建立AIH小鼠模型，空白組（NC組，n=7）小鼠通過尾靜脈注射等量生理鹽水。1 h后，治療組小鼠以10 mg/kg（低劑量，GA-A-L組，n=7）、20 mg/kg（中劑量，GA-A-M組，n=7）、40 mg/kg（高劑量，GA-A-H組，n=7）的劑量腹腔注射GA-A（B20742，MCE，美國），NC組和ConA組小鼠通過腹腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS）。在ConA注射12 h后使用過量的異氟醚處死小鼠，并收集血液和組織樣本。

1.2" 生化檢測"""""" 小鼠外周血分離血清后，委托上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測血清ALT、AST的表達(dá)水平。

1.3" 蛋白質(zhì)組學(xué)分析"" 選取NC組、ConA組、GA-A-M組小鼠肝組織進(jìn)行基于質(zhì)譜的Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理，每組5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以蛋白表達(dá)變化≥1.5且Plt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白（differentially expressed protein，DEP）并進(jìn)行生信分析，篩選GA-A治療后顯著改變的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。

1.4" 酶聯(lián)免疫吸附測定""""" 使用小鼠ELISA試劑盒（EK106/EK282/EK280，聯(lián)科生物）檢測白細(xì)胞介素（IL）6、腫瘤壞死因子（TNF）α和干擾素（IFN）γ的血清水平。

1.5" 組織學(xué)染色"" 將肝組織樣品固定在4%福爾馬林緩沖液中24 h，包埋在石蠟中，切成5 μm厚的切片，脫蠟并用蘇木精和伊紅染色。TUNEL染色按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用光學(xué)顯微鏡（ECLIPSE Ts2，Nikon，日本）拍攝圖像。

1.6" 免疫熒光技術(shù)""""" 為了鑒定肝臟中性粒細(xì)胞活化和NET的形成，使用肝組織切片免疫熒光染色法檢測瓜氨酸化組蛋白3（citrullinated histone 3，CitH3）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和Ly6G。小鼠組織切片與CitH3（ab281584，Abcam，英國）、MPO（ab208670，Abcam，英國）和Ly6G（Ab238132，Abcam，英國）抗體孵育過夜。PBS洗滌后，二抗（ab6936，Abcam，英國）室溫孵育1 h，隨后進(jìn)行DAPI染色。使用BX51熒光顯微鏡（BX51，Olympus Life Science，日本）進(jìn)行免疫熒光圖像拍攝。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域拍攝圖像，每組至少使用3只小鼠。采用Image-Pro Plus軟件（v.6.0）分析圖像。

1.7" 細(xì)胞培養(yǎng)和刺激"" 將人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60（ZQ0433，中喬新舟）置于IMDM培養(yǎng)基中，加入10% FBS，于37℃、5% CO2中培養(yǎng)。在補(bǔ)充有10 μmol/L全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，使其分化為中性粒細(xì)胞，并通過qPCR分析CD11b的表達(dá)來驗(yàn)證其分化水平。用100 ng/mL佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）刺激分化的中性粒細(xì)胞（dHL-60）5 h，并用20或40 μmol/L GA-A孵育12 h。

1.8" 游離雙鏈DNA（dsDNA）的測定"""" 使用Quant-iT?PicoGreen?dsDNA試劑（P11496，Invitrogen，美國）檢測小鼠血清和dHL-60細(xì)胞上清液中dsDNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)操作按照說明書進(jìn)行。

1.9" 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用RNA快速提取試劑盒（SB/R001，圣爾生物）提取總RNA，使用cDNA合成試劑盒（Share-bio）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR qPCR Master Mix（Q511-02/03，諾唯贊）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1所示。

1.10 蛋白質(zhì)印跡"" 使用RIPA裂解緩沖液（Share-bio）從肝組織或細(xì)胞中提取總蛋白。將裂解物在4 ℃下以13 000×g離心15 min，并收集上清液。等量蛋白通過SDS- PAGE進(jìn)行電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA封閉膜1 h，并與抗GAPDH（ab181602，1：10 000）、抗p- p38（28796-1-AP，1：2 000）、抗p38（14064-1-AP，1：4 000）或抗CitH3（ab281584，1：1 000）抗體在4 ℃下孵育過夜。將膜與二抗（M2100S，1：5 000）在室溫下孵育1 h后使用化學(xué)發(fā)光（Share-bio）檢測蛋白質(zhì)表達(dá)，并用AI800成像系統(tǒng)（29399481，GE Health Care，美國）拍攝圖像。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法"" 使用Graphpad Prism 8.0.2軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2"""" 結(jié)果

2.1" GA-A減輕ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷""" 局部肝壞死是AIH典型的病理特征，HE染色結(jié)果表明，ConA組小鼠肝臟發(fā)生明顯壞死。GA-A治療后顯著減少肝壞死面積和TUNEL陽性肝細(xì)胞的數(shù)量（圖1a～d），表明GA-A治療能減輕ConA誘導(dǎo)的肝損傷。另外，ConA可以誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷[22]，導(dǎo)致肝酶水平升高。本研究結(jié)果顯示，與NC組相比，ConA組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高。與ConA組相比，GA-A治療顯著降低ALT和AST水平，且具有劑量依賴性。值得注意的是，GA-A-M組具有較好的抗肝損傷效果（圖1e、f）。與ConA組相比，GA-A-M組血清和肝組織中炎癥因子IL-6、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平顯著降低（圖1g、h），表明GA-A具有顯著的抗炎效果。

2.2" 蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明GA-A調(diào)控NET釋放和p38 MAPK通路""""" GA-A-M組表現(xiàn)出最好的治療效果，因此選擇本組肝組織進(jìn)行后續(xù)分析。為了研究GA-A治療免疫性肝損傷的作用機(jī)制，選取NC組、ConA組和GA-A-M組小鼠肝組織進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。使用LC-MS/MS技術(shù)，在肝組織中共鑒定出3 006種蛋白質(zhì)。定量篩選后，與NC組相比，ConA組共鑒定出239個(gè)DEP，其中170個(gè)顯著上調(diào)，69個(gè)顯著下調(diào)（圖2a）。與ConA組相比，GA-A-M組共鑒定出202個(gè)DEP，其中21個(gè)顯著上調(diào)，181個(gè)顯著下調(diào)（圖2b）。NC組、ConA組和GA-A-M組共有DEP 61個(gè)（圖2c）。

對(duì)202個(gè)與GA-A治療相關(guān)的DEP進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在細(xì)胞成分類別中，DEP在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中顯著富集（圖2d）。在分子功能類別中，DEP在酶、大分子復(fù)合物和RNA結(jié)合中顯著富集（圖2e）。在生物過程中，DEP主要富集在炎癥相關(guān)功能，包括炎癥反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)和免疫系統(tǒng)過程（圖2f），表明GA-A在AIH治療中具有免疫調(diào)節(jié)作用。此外，IPA（ingenuity pathway analysis）通路富集分析表明，DEP顯著富集于中性粒細(xì)胞NET相關(guān)通路（圖2g），且通過MAPK通路調(diào)節(jié)NET（圖2h）。使用IPA構(gòu)建的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)揭示了DEP與p38 MAPK通路之間的密切關(guān)系（圖2i）。以上結(jié)果提示，GA-A可能通過p38 MAPK通路調(diào)控中性粒細(xì)胞NET釋放治療自身免疫性肝損傷。

2.3" GA-A對(duì)肝臟中性粒細(xì)胞浸潤和NET形成的影響"" 中性粒細(xì)胞大量浸潤是ConA誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷的主要特征[23-26]。進(jìn)一步驗(yàn)證GA-A對(duì)中性粒細(xì)胞功能的影響。小鼠肝組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，GA-A-M組MPO陽性中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著低于ConA組；與ConA組相比，GA-A-M組Ly6G和CitH3陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，說明GA-A能明顯抑制中性粒細(xì)胞NET形成（圖3a～d）。

2.4" GA-A通過p38 MAPK通路對(duì)NET形成的影響 p38 MAPK通路激活NET促進(jìn)炎癥發(fā)生[16]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，p38 MAPK是GA-A調(diào)控的潛在通路。Western Blot結(jié)果表明，ConA組小鼠肝臟中p38的磷酸化水平和NET標(biāo)志物CitH3的表達(dá)顯著升高，GA-A治療后顯著降低（圖4a、b）。鑒于NET由DNA、組蛋白和抗菌蛋白組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，筆者檢測了血清dsDNA作為肝組織中NET形成的指標(biāo)，結(jié)果表明GA-A-M組的dsDNA水平顯著低于ConA組（圖4c）。另外在體外用ATRA將HL-60細(xì)胞分化為dHL-60來驗(yàn)證GA-A的作用機(jī)制。相比在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞，在含ATRA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d的dHL-60細(xì)胞CD11b表達(dá)顯著增加（圖4d），表明HL-60細(xì)胞已經(jīng)成功分化為中性粒細(xì)胞。接著用PMA刺激dHL- 60細(xì)胞5 h，并用不同濃度的GA-A孵育12 h。結(jié)果表明，GA-A顯著抑制dHL-60細(xì)胞中的dsDNA、CitH3以及p38磷酸化水平（圖4e～g）。

2.5" GA-A調(diào)控NET釋放和p38 MAPK通路治療免疫性肝損傷的機(jī)制 總的來說，本研究表明，GA-A通過p38 MAPK通路減輕炎癥反應(yīng)并抑制NET釋放，從而減輕ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷，具體機(jī)制詳見圖5。

3"""" 討論

AIH是一種慢性炎癥性疾病，可迅速發(fā)展為肝硬化和肝衰竭。近年來，AIH發(fā)病率迅速增加[27]，最佳治療方法尚不明確。ConA誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型已被廣泛用于模擬人類AIH。其肝損傷特征是ALT和AST水平顯著升高，伴有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷T淋巴細(xì)胞浸潤。在該模型中，TNF-α和IFN-γ等炎性細(xì)胞因子可引起廣泛的肝壞死[27]。本研究明確了GA-A在ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷小鼠模型中具有顯著的治療效果，可以減輕肝損傷和肝臟炎癥。本研究通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，提示了GA-A治療AIH可能的作用機(jī)制，并在體內(nèi)和體外水平進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GA-A通過抑制NET形成和p38 MAPK通路活化改善ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷。

已有研究[21，28-30]表明，GA-A具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗纖維化和保肝功能。但是在AIH中鮮有報(bào)道，本研究明確了GA-A對(duì)AIH同樣具有保護(hù)作用。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，GA-A在ConA誘導(dǎo)的AIH小鼠模型中的治療效果與肝臟中NET的形成相關(guān)。過度的NET釋放會(huì)損害組織并引發(fā)炎癥[31]。本研究結(jié)果表明，Ly6G、CitH3和dsDNA作為NETosis標(biāo)志物，在GA-A處理后顯著降低，表明GA-A抑制NET的釋放，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝細(xì)胞存活，與過往的研究[20，29，32-33]結(jié)果一致。

研究[14，34]表明，p38 MAPK是NET形成的關(guān)鍵調(diào)控途徑。值得注意的是，DEP的生物信息學(xué)分析表明，p38MAPK通路顯著富集，提示其是GA-A在NET抑制中的潛在靶通路。體內(nèi)外驗(yàn)證結(jié)果表明，GA-A顯著降低模型小鼠肝組織和dHL-60細(xì)胞中的p38磷酸化水平，GA-A通過p38 MAPK通路抑制ConA誘導(dǎo)的AIH小鼠的NET釋放。ROS的產(chǎn)生還可以刺激p38 MAPK通路磷酸化并誘導(dǎo)NET形成[15]。鑒于GA-A可以減少氧化應(yīng)激，筆者猜想GA-A可能通過降低ROS抑制p38 MAPK激活。目前關(guān)于AIH的研究大多集中在自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞上[5，34]，本研究強(qiáng)調(diào)了中性粒細(xì)胞功能與AIH誘導(dǎo)的肝損傷和炎癥之間的緊密關(guān)系，GA-A在AIH治療中具有一定的應(yīng)用前景。

綜上，本研究結(jié)果表明，GA-A通過抑制p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)來抑制NET的形成，從而改善ConA誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷和肝臟炎癥。

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