慢性HBV感染者組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)及相關(guān)模型的建立與評(píng)價(jià)

摘要：目的"" 慢性HBV感染自然史多有組織學(xué)意義上的免疫耐受狀態(tài)，免疫耐受狀態(tài)一旦打破，需立即啟動(dòng)抗病毒治療。通過(guò)對(duì)免疫介導(dǎo)的肝損傷與HBV病毒學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，精準(zhǔn)定義肝組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的患者。方法以2010年1月—2022年12月中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心、天津市第二人民醫(yī)院、上海瑞金醫(yī)院和浙江省臺(tái)州醫(yī)院收集的HBeAg陽(yáng)性且HBV DNAgt;2×106 IU/mL未經(jīng)抗病毒治療的577例慢性乙型肝炎患者為研究對(duì)象。通過(guò)肝組織活檢確定肝損傷情況，檢測(cè)血清ALT、AST水平及病毒學(xué)指標(biāo)。分析現(xiàn)有各大指南無(wú)創(chuàng)指標(biāo)特別是HBV DNA載量界值不同的情況下，肝組織免疫耐受狀態(tài)患者所占比例。進(jìn)一步嘗試以與肝組織免疫病理?yè)p傷程度相關(guān)性消失時(shí)的血清HBV DNA為新的閾值，聯(lián)合多因素指標(biāo)建立組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的診斷模型。計(jì)量資料兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。采用二元Logistic回歸分析建立多因素診斷模型，并應(yīng)用受試者工作特征曲線下面積（AUC）明確各模型的診斷效能，AUC的比較采用Z檢驗(yàn)。結(jié)果""""" 中國(guó)2022版、EASL 2017版、AASLD 2018版、APASL 2015版慢性乙型肝炎防治指南病毒學(xué)無(wú)創(chuàng)指標(biāo)所鑒定出的免疫耐受狀態(tài)患者中符合本研究定義（HBV DNAgt;2×106 IU/mL）的組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的比例分別為47.0%、38.5%、36.0%、44.6%，均未超過(guò)50%。當(dāng)將血清HBV DNA閾值升至gt;2×108 IU/mL時(shí)，盡管免疫介導(dǎo)的肝損傷與HBV DNA相關(guān)性消失（r=-0.029，P=0.704），此時(shí)肝組織免疫耐受狀態(tài)患者所占比例也僅為52.0%。在血清HBV DNAgt;1×108的HBeAg陽(yáng)性患者隊(duì)列（n=251）中，顯著肝損傷組（n=140）和無(wú)顯著肝損傷組（n=111）HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT及AST水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05），進(jìn)一步多因素二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，AST、HBV DNA、HBeAg是患者組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的獨(dú)立影響因素（P值均lt;0.05）。根據(jù)以上指標(biāo)并結(jié)合臨床，建立預(yù)測(cè)模型：logit（P）=1.424-0.028×AST，AUC為0.730，AST最佳臨界值為30.5 U/L，敏感度和特異度分別為52.8%、84.1%。進(jìn)一步使用浙江省臺(tái)州醫(yī)院接受肝穿刺活檢的238例成人慢性HBV感染者作為驗(yàn)證隊(duì)列，驗(yàn)證結(jié)果顯示，本研究建立的模型預(yù)測(cè)效能優(yōu)于AST/ALT、FIB-4、APRI（AUC分別為0.698、0.555、0.518、0.373，P值均lt;0.05）。結(jié)論在HBV DNAgt;2×108 IU/mL的HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者中，ASTgt;30.5 U/L時(shí)，提示組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)可能被“打破”。

關(guān)鍵詞：乙型肝炎，慢性；免疫耐受；診斷

HBV感染是慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要致病因素。已知嗜肝性的HBV并不具有直接的致感染肝細(xì)胞病變效應(yīng)，這意味著慢性HBV感染的肝損傷主要是宿主免疫系統(tǒng)控制清除感染病毒肝細(xì)胞造成的免疫病理?yè)p傷[1]，即慢性HBV感染疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸是病毒持續(xù)感染與宿主抗病毒免疫相互作用的結(jié)果。1985年，我國(guó)臺(tái)灣學(xué)者[2]發(fā)現(xiàn)，以母嬰垂直傳播為主要傳播方式的慢性HBV感染者疾病進(jìn)程早期多表現(xiàn)為高病毒復(fù)制和輕（無(wú)）肝臟炎癥的特點(diǎn)，并據(jù)此引入了“宿主免疫”的概念，將慢性HBV感染自然進(jìn)程劃分為免疫耐受期（HBeAg陽(yáng)性慢性感染）、免疫激活或免疫清除期（HBeAg陽(yáng)性CHB）、免疫控制下的非活動(dòng)攜帶期（HBeAg陰性慢性感染）和再活動(dòng)期（HBeAg陰性CHB），并被各大指南沿用至今[1]。

然而，值得注意的是，盡管自然史分期曾采用免疫學(xué)概念來(lái)描述，但一直缺乏直接的免疫學(xué)證據(jù)和指標(biāo)來(lái)支持對(duì)各期的界定。現(xiàn)有的各大指南對(duì)于慢性HBV感染者的“免疫耐受期”的定義是以患者肝組織病理學(xué)界定的，即在HBeAg陽(yáng)性患者中，肝組織無(wú)明顯炎癥壞死和纖維化，反映肝損傷的生化指標(biāo)低于正常值且HBV DNA處于高水平狀態(tài)。

真實(shí)的“免疫耐受”狀態(tài)是否存在以及如何界定尚有爭(zhēng)議。Kennedy等[3]收集不同年齡“免疫耐受期”患者的T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兒童和青少年具有更多的HBV特異性T淋巴細(xì)胞；Mason等[4]的研究認(rèn)為慢性HBV感染自然史中并不存在“免疫耐受期”，更傾向于描述為“高病毒復(fù)制，低炎癥損傷”時(shí)相。因?yàn)樘幵凇懊庖吣褪芷凇钡穆訦BV感染者與HBeAg陽(yáng)性CHB患者以及HBeAg陰性CHB患者一樣，均能檢測(cè)到肝臟炎癥、HBV整合以及整合肝細(xì)胞克隆性細(xì)胞集落，同時(shí)伴隨著HBV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)及肝內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[5]也發(fā)現(xiàn)，HBsAg宮內(nèi)暴露的小鼠對(duì)乙型肝炎疫苗刺激激活了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答且具有抗-HBs免疫記憶。從免疫學(xué)定義來(lái)講，HBV“免疫耐受期”患者應(yīng)不存在HBV特異性細(xì)胞免疫、體液免疫，甚至也不存在固有免疫識(shí)別反應(yīng)⑹，依照這一定義，CHB疾病進(jìn)展中是否存在真正的“免疫耐受期”值得商榷。

然而，Milich等[7]持不同意見(jiàn)，認(rèn)為“高復(fù)制低炎癥”是描述性的，“免疫耐受”解釋了高復(fù)制低炎癥的機(jī)制，且由于慢性HBV感染疾病的進(jìn)展主要是HBV特異性免疫清除感染肝細(xì)胞導(dǎo)致的，因此在命名疾病的各個(gè)階段時(shí)，仍有必要繼續(xù)采用免疫學(xué)術(shù)語(yǔ)。Liaw等[8]也認(rèn)為，從臨床角度看“免疫耐受”仍然是正確的。由于真正免疫耐受狀態(tài)的慢性感染者肝組織往往沒(méi)有明顯的肝損傷，且通常對(duì)抗病毒治療缺乏有效的應(yīng)答，一般認(rèn)為此時(shí)并不亟須啟動(dòng)抗病毒治療。因此準(zhǔn)確地甄別處于“免疫耐受”狀態(tài)的患者仍有其臨床意義。

實(shí)驗(yàn)室前期臨床隊(duì)列研究[9]發(fā)現(xiàn)，在HBeAg陽(yáng)性且HBV DNAgt;2×106 IU/mL的慢性HBV感染者中，其HBV病毒學(xué)指標(biāo)如HBV DNA、qHBsAg及HBeAg定量（或半定量）水平與患者肝臟免疫介導(dǎo)的損傷程度呈負(fù)相關(guān)，顯示此時(shí)宿主免疫耐受狀態(tài)已被打破，并能夠有效清除感染肝細(xì)胞和出現(xiàn)HBV DNA水平的下降。因此，應(yīng)采用更高的HBV DNA水平來(lái)輔助界定免疫耐受狀態(tài)。

ALT和AST雖可在一定程度上反映肝細(xì)胞損傷程度，但因其受多種因素影響，特異性差且各大指南正常范圍標(biāo)準(zhǔn)不一，在我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》[10]中指出，慢性HBV感染者1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次且每次至少間隔3個(gè)月ALT/AST正常才能定義為ALT/AST持續(xù)正常。

本研究中，因考慮到ALT和AST的非特異性以及其易受許多非病毒學(xué)指標(biāo)的影響，所以嘗試以HBeAg陽(yáng)性、高病毒復(fù)制、輕（無(wú)）炎癥損傷為特征定義組織學(xué)意義上的“免疫耐受”狀態(tài)，有助于鑒別肝組織學(xué)意義上的“免疫耐受”狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)此類患者的精準(zhǔn)診療。

1"""" 資料與方法

1.1" 研究對(duì)象"""""" 從實(shí)驗(yàn)室既往研究隊(duì)列中納入2010年1月—2022年12月中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心、天津市第二人民醫(yī)院、上海瑞金醫(yī)院和浙江省臺(tái)州醫(yī)院HBeAg陽(yáng)性、HBV DNAgt;2×106 IU/mL的慢性HBV感染者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18周歲者；（2）HBsAg陽(yáng)性≥6個(gè)月者；（3）未接受抗病毒治療者；（4）接受肝組織穿刺檢查有明確病理診斷者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎等導(dǎo)致肝損傷者；（2）合并心、腦、腎等其他重要臟器功能衰竭或者惡性腫瘤者；（3）女性妊娠、哺乳者。

1.2" 血液生化、病毒學(xué)指標(biāo)檢測(cè)""""" 收集入組患者性別、年齡等人口學(xué)資料；血液生化指標(biāo)應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)；HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc定量應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)（ARCHITECTi2000SR），HBsAg檢測(cè)下限為0.05 IU/mL；HBV DNA病毒載量使用COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan48進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)下限為20 IU/mL。

1.3" 肝組織活檢病理檢測(cè)"" 肝活檢組織經(jīng)4%甲醛液固定，石蠟包埋，連續(xù)5 μm組織切片，常規(guī)進(jìn)行HE、Masson染色，顯微鏡下觀察炎癥、纖維化程度及病變特點(diǎn)，根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》[10]對(duì)肝組織炎癥活動(dòng)度（GO～G4）和纖維化程度（SO～S4）進(jìn)行分級(jí)。顯著肝損傷定義為經(jīng)病理學(xué)診斷存在中度以上肝臟炎癥（≥G2）和/或中度及以上纖維化（≥S2）。

1.4" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法"" 使用SPSS 22.0和GraphPad 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。HBV DNA和HBsAg定量數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。采用二元Logistic回歸分析建立多因素診斷模型，并應(yīng)用受試者工作特征曲線（ROC曲線）下面積（AUC）明確各類模型診斷效能。AUC的比較采用Z檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2"""" 結(jié)果

2.1" 一般資料"""""" 本研究共納入4家醫(yī)院577例符合入組條件的未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者，其中HBV DNAgt;2×107 IU/mL有438例，HBV DNAgt;1×108 IU/mL有251例，HBV DNAgt;2×108 IU/mL有171例。577例患者中，男329例，女248例；平均年齡33歲。入組患者根據(jù)肝活檢結(jié)果分為存在顯著肝損傷組（n=369）和無(wú)顯著肝損傷組（n=208），基本臨床特征及病毒學(xué)指標(biāo)分布情況見(jiàn)表1。已經(jīng)打破免疫耐受的肝組織存在顯著肝損傷（≥G2和/或≥S2）患者的ALT和AST水平顯著高于無(wú)顯著肝損傷患者，同時(shí)，病毒學(xué)指標(biāo)顯著低于無(wú)顯著肝損傷的患者（P值均lt;0.05）。

2.2" 根據(jù)各大指南無(wú)創(chuàng)指標(biāo)計(jì)算組織學(xué)免疫耐受期患者所占比例""""" 本研究分析了除去ALT/AST之外的其他無(wú)創(chuàng)病毒學(xué)指標(biāo)對(duì)組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)患者的診斷效能。表2是分別依據(jù)各大CHB防治指南病毒學(xué)無(wú)創(chuàng)指標(biāo)所鑒定出的免疫耐受狀態(tài)患者中符合本文定義的組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的比例。結(jié)果顯示，即使提高HBV DNA至108 IU/mL（Mason等[4]2016年在Gastroenterology發(fā)表文章入組的免疫耐受期患者HBV DNA平均值為108 IU/mL），組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)患者所占比例（44.6%）也不超過(guò)50%。

2.3" 確定與肝組織炎癥活動(dòng)度出現(xiàn)負(fù)相關(guān)性消失時(shí)的HBV DNA上限閾值 當(dāng)HBeAg陽(yáng)性患者血清HBV DNA水平升高至2×108 IU/mL時(shí)，其水平與肝炎活動(dòng)程度相關(guān)性消失（r=-0.029，P=0.704）（表3），符合組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的比例為52.0%（89/171），與HBV DNA高于2×106 IU/mL（36.0%，208/577）、2×107 IU/mL（47.0%，164/349）和1×108 IU/mL（44.6%，112/251）相比，僅略有升高。這可能是因?yàn)?，在這些HBV DNAgt;2×108 IU/mL的患者中，其HBsAg，特別是HBeAg仍和肝臟炎癥活躍度及反映肝臟炎癥損傷的生化指標(biāo)有著不同程度的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的負(fù)相關(guān)性（表3），提示部分患者免疫耐受狀態(tài)已被“打破”。

2.4" 多指標(biāo)聯(lián)合尋找確定組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)患者的最佳診斷模型"" 考慮到即使將HBV DNA閾值升高至2×108 IU/mL，仍有相當(dāng)比例（48.0%，82/171）的慢性HBV感染者已經(jīng)存在明顯的肝臟炎癥損傷，因此，本研究試圖在此基礎(chǔ)上聯(lián)合其他無(wú)創(chuàng)指標(biāo)以提高組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)患者的診斷準(zhǔn)確度。

在血清HBV DNAgt;1×108的HBeAg陽(yáng)性患者隊(duì)列（n=251）中，顯著肝損傷組（n=140）與無(wú)顯著肝損傷組（n=111）比較，ALT、AST、HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均lt;0.05）（表4）；進(jìn)一步二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，AST、HBeAg、HBV DNA是影響患者組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的獨(dú)立影響因素（P值均lt;0. 05）（表5）?？紤]到HBeAg是半定量指標(biāo)，且大部分臨床醫(yī)生重點(diǎn)關(guān)注的是HBeAg陰/陽(yáng)性問(wèn)題，故只將AST、HBV DNA納入建立模型：logit（P）=-9.315-0.032×AST+1.236×log10 HBV DNA，AUC為0.800，通過(guò)約登指數(shù)得出的最佳臨界值所對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為94.3%、55.0%（圖1）。

由于HBeAg陽(yáng)性患者血清HBV DNA水平升高至2×108 IU/mL時(shí)，其水平與肝炎活動(dòng)程度相關(guān)性消失（P=0.704），同時(shí)考慮到臨床可操作性，在血清HBV DNAgt;2×108 IU/mL的患者中，將AST單獨(dú)納入二元Logistic回歸分析，回歸方程模型：logit（P）=1.424-0.028×AST，AUC為0.730（圖2），模型預(yù)測(cè)效果良好，通過(guò)約登指數(shù)得出AST最佳臨界值為30.5 U/L，敏感度和特異度分別為52.8%、84.1%。因此，在血清HBV DNAgt;2×108 IU/mL的HBeAg陽(yáng)性患者中，若ASTgt;30.5 U/L，應(yīng)考慮患者的組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)已經(jīng)被“打破”。

2.5" 不同診斷模型預(yù)測(cè)效能的比較"" 目前針對(duì)免疫耐受期的無(wú)創(chuàng)診斷模型主要包括AST/ALT、FIB-4和APRI[14]。進(jìn)一步使用浙江省臺(tái)州醫(yī)院接受肝穿刺活檢的238例成人慢性HBV感染者作為驗(yàn)證隊(duì)列，在血清HBV DNAgt;2×108 IU/mL的HBeAg陽(yáng)性患者中，將ALT/AST、FIB-4、APRI與本研究建立的診斷模型進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，本研究建立的模型預(yù)測(cè)效能優(yōu)于AST/ALT、FIB-4、APR（AUC分別0.698、0.555、0.518、0.373，P值均lt;0.05）（圖3）。

3"""" 討論

由于曾有采用配對(duì)肝活檢的研究數(shù)據(jù)顯示，免疫耐受期的患者5年內(nèi)肝損傷的進(jìn)展微乎其微[15]。因此，現(xiàn)階段各大指南[10-13]對(duì)“免疫耐受期”患者的管理建議是對(duì)組織學(xué)診斷的真正“免疫耐受期”患者不推薦進(jìn)行抗病毒治療。但目前國(guó)際上對(duì)真正的免疫耐受期的定義尚未達(dá)成共識(shí)，也缺乏有效的鑒定手段。

本研究首先提出了“組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)”的建議，在現(xiàn)階段缺乏有效的評(píng)判免疫狀態(tài)的免疫學(xué)指標(biāo)的現(xiàn)實(shí)下，在臨床實(shí)踐中定義患者是否處于“組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)”可能更加實(shí)用。因?yàn)橐环矫妫嬲慕M織學(xué)免疫耐受階段的患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)小，且即使開(kāi)展抗病毒治療，其病毒學(xué)應(yīng)答也不令人滿意；而另一方面，在Kennedy等[3]和Mason等[4]按現(xiàn)行的HBeAg陽(yáng)性、高病毒復(fù)制且ALT水平正常等指標(biāo)納入其研究的免疫耐受期患者中，相當(dāng)比例患者的肝組織已經(jīng)存在顯著肝損傷，不再是真正意義上的“免疫耐受期”。不僅如此，這些患者的肝組織往往有相當(dāng)數(shù)量的、攜帶了HBV DNA 整合片段的細(xì)胞克隆集落。其表達(dá)HBsAg的能力不僅使CHB難以實(shí)現(xiàn)臨床治愈，伴隨著增殖的突變積累也增加了患者未來(lái)肝細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此，進(jìn)一步明確免疫耐受患者的定義，并嘗試建立甄別符合真正免疫耐受狀態(tài)的慢性HBV感染者的手段極為重要。

肝活檢是評(píng)估免疫介導(dǎo)的肝損傷程度及是否啟動(dòng)抗病毒治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但因有創(chuàng)性難以常規(guī)開(kāi)展。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)之上，嘗試采用不同的無(wú)創(chuàng)指標(biāo)在HBeAg陽(yáng)性、HBV DNAgt;2×106 IU/mL的慢性HBV感染者中篩選出“組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)”的患者。然而，盡管發(fā)現(xiàn)當(dāng)HBV DNAgt;2×108 IU/mL，免疫介導(dǎo)的肝損傷與HBV DNA相關(guān)性消失，但由于其與HBsAg/HBeAg的負(fù)相關(guān)性依然存在，以致由此定義的“組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)”者中存在明顯肝組織學(xué)損傷的比例仍高達(dá)48%。因此有必要增加新的無(wú)創(chuàng)指標(biāo)來(lái)進(jìn)一步精準(zhǔn)診斷。

本研究發(fā)現(xiàn)以AST異常升高（gt;30.5 U/L）輔助研判慢性HBV感染者的“組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)”是否被“打破”，可在HBeAg陽(yáng)性、HBV DNAgt;2×108 IU/mL的慢性感染者中鑒別組織學(xué)免疫耐受狀態(tài)的患者，這將有助于HBeAg陽(yáng)性且HBV DNA高水平患者的臨床管理。

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