棘孢木霉次級代謝產(chǎn)物麥角甾醇防治小麥赤霉病潛能分析

摘要：從棘孢木霉（Trichoderma asperellum）CBS 433.97次級代謝物中分離純化化合物麥角甾醇，研究其對小麥株高、根長和根數(shù)的影響，并對麥角甾醇防治小麥赤霉病的潛能進行了分析。結(jié)果表明，麥角甾醇具有促進小麥生長的作用，當(dāng)濃度為0.1、10 mg/L時，與對照相比，小麥幼苗根數(shù)分別增加了6.06%、9.09%，株高分別增加了10.04%、6.69%。另外，麥角甾醇具有防治小麥赤霉病的潛能，小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌PH-1脅迫條件下，與對照相比，麥角甾醇濃度為0.1 mg/L時，小麥葉片防御酶PPO活性提高了58.42%，POD活性提高了73.68%，LTP-1基因表達量是CK的2.07倍，Glu1基因的表達量是CK的1.89倍；麥角甾醇濃度為10 mg/L時，P5CS基因的表達量是CK的1.79倍。不同濃度麥角甾醇處理條件下，PR1.1、PR4和Chi基因的表達量均表現(xiàn)為下調(diào)。綜上，棘孢木霉CBS 433.97中分離的麥角甾醇能夠促進小麥生長并能誘導(dǎo)小麥對赤霉病的抗性，可用于生物農(nóng)藥開發(fā)。

關(guān)鍵詞：棘孢木霉；次級代謝產(chǎn)物；麥角甾醇；促生；抗病；小麥赤霉病

中圖分類號：S435.121.4⁺5""文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0133-07

小麥（Triticum aestivum L.）是我國的主要糧食作物，其生產(chǎn)與我國糧食安全密切相關(guān)^［1］。小麥赤霉病是由以禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）為主要致病菌引起的小麥真菌病害^［2］?；春右阅霞伴L江中下游地區(qū)是小麥赤霉病的多發(fā)區(qū)，近年來隨著耕作制度的改變、生產(chǎn)水平的提高以及全球氣溫變暖等影響，小麥赤霉病發(fā)病程度逐年加重，一般導(dǎo)致小麥減產(chǎn)10%～30%，甚至顆粒無收^［3］。被小麥赤霉病菌侵染的小麥還會產(chǎn)生玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）、脫氧雪腐鐮刀烯醇（deoxynivalenol，DON）以及雪腐鐮刀烯醇等有害毒素，攝入高含量毒素的小麥能夠引起人畜腹瀉、嘔吐，嚴重者會致畸致癌^［4-5］。因此防治小麥赤霉病刻不容緩。

小麥赤霉病的防治方法主要有生物防治、農(nóng)業(yè)防治、抗性育種以及化學(xué)防治等^［6-7］。近年來，隨著生物技術(shù)及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，生物防治逐漸成為防治小麥赤霉病的重要舉措^［8］。木霉菌（Trichoderma spp.）作為一種重要的生物防治真菌，可以快速生長，搶占植物根際生態(tài)位并形成生物屏障，提高植物抵御病原微生物脅迫的能力，促進植株的生長發(fā)育^［9］，已經(jīng)被應(yīng)用于多種植物病害的防治中。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉T-aloe的菌絲通過重寄生和纏繞的方式抑制核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）生長^［10］；王前程等研究發(fā)現(xiàn)，擬康寧木霉T-51可以提高病原脅迫下番茄體內(nèi)的抗氧化酶活性，增強其對枯萎病的抵抗能力^［11］。

木霉菌作為一種重要的生防菌，其活性代謝物種類多樣、結(jié)構(gòu)新穎，是抗菌活性物質(zhì)的重要資源庫，從中挖掘具有生防功能的活性物質(zhì)已經(jīng)成為研究熱點^［12-14］。哈茨木霉菌株T4產(chǎn)生的哈齊諾吡啶酮（harzianopyridone）以及哈茨木霉菌株T5產(chǎn)生的活性物質(zhì)6-PP（6-戊基-2H-吡喃-2-酮）能夠顯著抑制尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、齊整小核菌（S.rolfsii）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）以及菜豆殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）等病原菌的生長^［15］。哈茨木霉菌株T22產(chǎn)生的T22嗜氮酮（T22azaphilone）在較低濃度時就表現(xiàn)出對小球腔菌（Leptosphaeria maculans）、樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）以及灰霉病菌（Botrytis cinerea）的廣譜抗性，哈茨木霉菌株T39產(chǎn)生的丁烯羥酸內(nèi)脂（butenolide）在略高濃度時對3種病原菌也表現(xiàn)出相似的抗性^［16］。從奶油木霉（T.cremeum）中分離出的活性物質(zhì)cremenolide（一種十元內(nèi)酯）能夠有效地抑制尖孢鐮刀菌、灰霉病菌和立枯絲核菌的生長^［17］。木霉菌的代謝物不僅能夠拮抗病原菌，還可以促進植物生長，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。Luo等從擬康氏木霉（T.pseudokoningii）SMF2的代謝物中分離到的康寧霉素（trichokonins），可以提高病原脅迫下煙草中苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化物酶（POD）活性，上調(diào)多種防御酶基因的表達，誘導(dǎo)煙草對煙草花葉病毒（TMV）的系統(tǒng)抗性^［18］。Pascale等用哈茨木霉（T.harzianum）M10和綠色木霉（T.atroviride）P1的活性物質(zhì)哈進酸（harzianic acid，HA）和6-PP噴灑在葡萄葉片，可以抑制葡萄白粉病的發(fā)病率，提高葡萄產(chǎn)量以及抗氧化活性^［19］。本研究于2020—2021年在河南省周口市周口師范學(xué)院微生物實驗室（114°6′E，33°6′N）進行，對棘孢木霉CBS 433.97進行發(fā)酵并對其活性物質(zhì)進行了分離鑒定，分析了該物質(zhì)促進小麥生長和防治小麥赤霉病的潛能，旨在為利用棘孢木霉綠色防控小麥赤霉病等重要病害提供理論依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"試驗材料和培養(yǎng)基

供試菌株：棘孢木霉CBS 433.97購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（ACCC），菌種保藏號為ACCC30536。小麥赤霉病禾谷鐮刀菌PH-1由周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點實驗室羅奇博士提供。

供試小麥品種：周麥36，由周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯20 g，葡萄糖2 g，補充蒸餾水至100 mL，煮沸過濾，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。大米培養(yǎng)基：大米130 g，補充蒸餾水至100 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2"木霉種子液制備

挑取棘孢木霉CBS 433.97菌落邊緣菌絲體于新鮮PDA培養(yǎng)基平板中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，用直徑為6 mm的打孔器打取培養(yǎng)好的菌塊，接種于裝有100 mL新鮮PDB的錐形瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。超凈工作臺中用無菌紗布將發(fā)酵液過濾并制成孢子懸浮液 （2×10⁸個/mL），4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3"大量發(fā)酵與提取分離

總浸膏萃取參照吳長景等的方法^［20］，并稍作改進。具體如下：將“1.2”節(jié)中制備的孢子懸浮液接種于大米培養(yǎng)基中，每瓶接種2 mL，室溫發(fā)酵至培養(yǎng)基液化。向發(fā)酵物中加入等體積的乙酸乙酯，超聲波超聲0.5 h，此步驟重復(fù)3次。收集萃取液并減壓旋蒸，制得總浸膏62 g。參照劉暢的方法進行化合物的分離提取^［21］，得到不同流分，通過HPLC分離出化合物之后重結(jié)晶得到化合物單體。在中科院微生物研究所用安捷倫6500系列Q-TOF LC/MS系統(tǒng)對化合物的高分辨質(zhì)譜進行測定，用BrukeAvance Ⅲ 500核磁共振光譜儀對化合物的核磁共振譜進行測定?；衔锶軇殡按状迹–D3OD），其化學(xué)位移值為δH 3.31 ppm，δC 49.00 ppm。測定結(jié)果用Mest Re Nova進行數(shù)據(jù)分析。

1.4"麥角甾醇對小麥生長和抗病性的影響

1.4.1"麥角甾醇對小麥的促生作用分析

將麥角甾醇分別配制成濃度為0.1、1、10 mg/L的水溶液。挑選大小均一、飽滿、無裂痕的麥粒用溫水浸泡2 h，然后按照50粒/皿的標(biāo)準(zhǔn)將其置于底部鋪有濾紙片、直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中。將配制好的麥角甾醇水溶液加入到培養(yǎng)皿中，每個皿中加入5 mL，以等量蒸餾水作為對照，每組處理重復(fù)3次。25 ℃培養(yǎng)72 h后，將幼苗移栽至盛有200 g土的花盆中，每盆15粒種子。生長8 d時，測量小麥的根長、根數(shù)和株高。

1.4.2"麥角甾醇誘導(dǎo)小麥抗病相關(guān)生理指標(biāo)分析

小麥種子處理同“1.4.1”節(jié)，小麥種子在盆中生長 3 d 后，用接種針刺破小麥胚軸，滴加孢子數(shù)為 2×10⁷個/mL 的PH-1菌液10 μL^［22］。接種病原菌7 d后，測定小麥幼苗多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性以及游離脯氨酸含量^［23］，同時將小麥葉片用液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3"麥角甾醇誘導(dǎo)小麥幼苗抗病相關(guān)基因表達分析

用Trizol法提取小麥葉片總RNA，經(jīng)DNase處理后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進行RT-qPCR擴增，每個樣品重復(fù)3次，采用2^-ΔΔCT方法計算6個擴增基因的相對表達量^［21］。檢測所用引物見表1。

2"結(jié)果與分析

2.1"化合物的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)化合物的波普數(shù)據(jù)將該化合物鑒定為麥角甾醇（圖1）。化合物的波普數(shù)據(jù)為白色晶體，正離子ESI-MS m/z：397［M+H］⁺，分子式為 C28H44O，不飽和度為7；¹H NMR （500 MHz，CDCl3） δ：5.56 （1H，dd，J=5.5，2.2 Hz，H-6），5.39-5.36 （1H，m，H-5），5.19 （1H，dd，J=11.7，7.4 Hz，H-22，23），3.63 （1H，tt，J=11.2，4.1 Hz，H-3），1.03 （3H，d，J=6.7 Hz，H-21），0.94 （3H，s，H-19），0.91 （5H，d，J=6.9 Hz，H-28），0.85-0.81 （11H，m，H-26，27），0.62 （2H，s，H-18）；¹³C NMR （126 MHz，CDCl3） δ：141.23 （C-8），139.66 （C-5），135.44 （C-22），131.85 （C-23），119.46 （C-6），116.17 （C-7），77.16，70.32 （C-3），55.60 （C-17），54.43 （C-14），46.12 （C-9），40.65 （C-4），40.31 （C-20），39.65 （C-12），38.96（C-24），38.25（C-1），37.13 （C-10），32.96 （C-25），31.51 （C-2），28.13 （C-16），24.18 （C-15），20.98 （C-11，21），19.70 （C-27），17.49 （C-28），16.15 （C-19），11.92 （C-18）。

2.2"麥角甾醇對苗期小麥生長的影響

麥角甾醇處理后，小麥在花盆中生長5 d時，測量小麥幼苗的根數(shù)、根長和株高，評估麥角甾醇對小麥幼苗的促生效果。當(dāng)麥角甾醇濃度為0.1 mg/L時，小麥根數(shù)和株高分別顯著增加6.06%和10.04%（圖2-A、圖2-B），但對小麥根長影響不顯著（圖2-C）。當(dāng)麥角甾醇濃度為1 mg/L時，小麥根長減少了20.24%（圖2-C），但對根數(shù)和株高無顯著影響。當(dāng)麥角甾醇濃度為10 mg/L時，小麥根數(shù)和株高分別增加了9.09%和6.69%（圖2-A、圖2-B），根長減少了16.00%（圖2-C）。

2.3"麥角甾醇對苗期小麥相關(guān)防御酶活性及游離脯氨酸含量的影響

接種病原菌PH-1后第7 天，測定小麥葉片的抗氧化酶活性及相關(guān)抗性指標(biāo)。結(jié)果顯示，施加麥角甾醇顯著影響小麥葉片PPO和POD活性。麥角甾醇濃度為0.1 mg/L時小麥葉片PPO活性顯著提高，與對照相比提高了58.42%，麥角甾醇濃度為1、10 mg/L時對小麥葉片PPO活性無顯著影響（圖3-A）。麥角甾醇在試驗濃度下均可顯著提高小麥葉片POD活性，在0.1 mg/L時提高最多，與對照相比提高了73.68%，麥角甾醇濃度為1、10 mg/L時，POD活性與0.1 mg/L時相比雖顯著降低，但與對照相比均顯著提高，分別提高了53.10%和15.79%（圖3-B）。而麥角甾醇在試驗濃度下均未顯著影響小麥葉片內(nèi)游離脯氨酸含量的變化（圖3-C）。

2.4"麥角甾醇調(diào)控小麥相關(guān)抗病基因表達

麥角甾醇處理下，與對照相比，LTP-1基因表達量均顯著上調(diào)，麥角甾醇濃度為0.1 mg/L時，LTP-1表達量上調(diào)最多，為CK的2.07倍，麥角甾醇濃度為1、10 mg/L時其表達量分別是CK的1.26倍和1.98倍（圖4-A）。麥角甾醇處理下，與對照相比，P5CS基因表達量均顯著上調(diào)，當(dāng)麥角甾醇濃度為10 mg/L時其表達量上調(diào)最多，為CK的1.79倍，麥角甾醇濃度為0.1 mg/L和1 mg/L時其表達量分別是CK的1.33倍和1.28倍（圖4-B）。麥角甾醇處理下，與對照相比，Glu1基因表達量均顯著上調(diào)，當(dāng)麥角甾醇濃度為0.1 mg/L時，其表達量上調(diào)最多，為CK的1.89倍，麥角甾醇濃度為1、10 mg/L 時其表達量分別是CK的1.33倍和1.20倍（圖4-C）。麥角甾醇處理下，與對照相比，PR4基因表達量均顯著下調(diào)，當(dāng)麥角甾醇濃度為1 mg/L時，其表達量下調(diào)最多，為CK的0.29倍，麥角甾醇濃度為0.1、10 mg/L時，其表達量分別是CK的0.58倍和0.66倍（圖4-D）。麥角甾醇處理下，與對照相比，Chi1基因表達量均顯著下調(diào)，當(dāng)麥角甾醇濃度為1 mg/L時，其表達量下調(diào)最多，為CK的0.36倍，麥角甾醇濃度為0.1、 10 mg/L 時，其表達量分別是CK的0.52倍和0.53倍（圖4-E）。麥角甾醇處理下，與對照相比，PR1.1基因表達量均顯著下調(diào)，當(dāng)麥角甾醇濃度為1 mg/L時，其表達量下調(diào)最多，為CK的0.22倍，麥角甾醇濃度為0.1 mg/L和10 mg/L時，其表達量分別是CK的0.27倍和0.28倍（圖4-F）。

3"討論

麥角甾醇是絕大多數(shù)真菌細胞膜上的重要固醇分子，也是多種微生物、載體化合物和激素的合成前體^［24-25］。目前國內(nèi)外大量生產(chǎn)麥角甾醇使用的菌株多數(shù)為酵母菌^［26］，也有利用曲霉等進行生產(chǎn)^［27］。對麥角甾醇的研究集中于其抗炎^［28］、降脂^［29］、抗癌^［30］和免疫調(diào)節(jié)活性^［31］，而關(guān)于其抑菌活性則報道較少^［32］。有研究者從木霉中也分離到了麥角甾醇，但并未對其抑菌活性進行研究^［33］。

木霉通過次生代謝可以產(chǎn)生一些能夠促進植物生長和誘導(dǎo)植物抗性的化合物^［34］。哈茨木霉產(chǎn)生的異哈進酸能夠促進番茄種子萌發(fā)和植株生長，同時能夠誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性^［35］。本研究對棘孢木霉CBS 433.97乙酸乙酯萃取物的化學(xué)成分進行了分析，并對其提高小麥抗赤霉病的能力進行了評價。通過高效液相色譜和重結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合反復(fù)分離純化，從棘孢木霉CBS 433.97的乙酸乙酯萃取物中分離到了一種甾醇類化合物，利用波普分析技術(shù)結(jié)合相關(guān)文獻數(shù)據(jù)^［36］鑒定其為麥角甾醇。并且發(fā)現(xiàn)其促進了小麥幼苗根數(shù)的增加和株高的增長，說明麥角甾醇能夠促進小麥幼苗生長。植物受到外界脅迫產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和其他氧化物造成細胞膜系統(tǒng)損傷^［37］，此外，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸積累量也能夠反映植株受脅迫情況，在植物逆境條件下起著重要作用^［38］。過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等防御酶能夠清除植物體內(nèi)多余的過氧化物，維持氧自由基平衡，緩解植株損傷^{［37，39-40］}。本研究中，在病原脅迫下，麥角甾醇在試驗濃度下雖未引起小麥植株中游離脯氨酸含量的顯著變化，但提高了植株中的POD和PPO活性。說明麥角甾醇能夠提高小麥的防御酶活性，清除活性氧，減輕細胞損傷，提高小麥植株的抗病性。

植物在病原脅迫下往往伴隨著病程相關(guān)蛋白（PRs）基因表達的變動^［41］。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（LTPs）是在植物胚胎發(fā)生、角質(zhì)層合成以及病原菌抗御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的小堿性蛋白，屬于PR蛋白家族^［42-43］。β-1，3-葡聚糖酶，屬于PR-2類蛋白，受Glu1調(diào)控，能夠降解真菌細胞壁，參與植物免疫反應(yīng)^［44］。脯氨酸是一種羥自由基清除劑，能夠與磷脂互相作用，調(diào)節(jié)細胞滲透壓，提高細胞抗氧化能力，P5CS是脯氨酸合成酶基因，在脯氨酸合成過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)植物的抗御反應(yīng)^［45］。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，在小麥中，TaLTP5基因的過表達能夠顯著提高植株對根腐病和赤霉病的抗性^［46］。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，小麥在接種條銹菌（Puccinia striiformis）24 h后，其TaGlu基因轉(zhuǎn)錄水平增加了35倍^［47］。本試驗中，在病原菌侵染后，麥角甾醇處理的小麥植株體內(nèi)LTP-1、Glu1和P5CS基因表達量顯著提高，表明麥角甾醇能夠誘導(dǎo)小麥植株體內(nèi)部分PR蛋白基因和脯氨酸合成酶基因的表達，提高小麥對赤霉病的抗性。另一些抗性酶基因也參與植物免疫反應(yīng)，如PR4、Chi1和PR1.1等。PR4調(diào)控內(nèi)源幾丁質(zhì)酶的合成，Chi是堿性幾丁質(zhì)酶基因，兩者都可以降解真菌細胞壁，參與植物免疫反應(yīng)，且受到水楊酸（SA）等植物激素的調(diào)控^［48-49］。而PR-1則是植物系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的信號分子^［50］。Zhang等將苦瓜幾丁質(zhì)酶McCHIT1在水稻中過表達，提高了水稻對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抗性^［51］。王前程等研究發(fā)現(xiàn)，單獨用尖孢鐮刀菌孢子懸液處理的番茄葉片中SA含量和PR-1相對表達量的上調(diào)程度遠大于混合孢子液和單施木霉孢子懸液處理的上調(diào)程度^［11］。在本研究中，混合施用病原菌和麥角甾醇的小麥葉片中PR4、Chi1和PR1.1的表達量均低于單獨施用病原菌的小麥中的表達量，推測麥角甾醇防治小麥赤霉病的主要通路并非SAR。

綜上，本研究對棘孢木霉CBS 433.97的活性物質(zhì)進行了分離，并對活性物質(zhì)麥角甾醇提高小麥抗赤霉病能力進行了評價。初步探討了麥角甾醇誘導(dǎo)小麥抗病性的機制，為木霉菌及其活性物質(zhì)防控小麥赤霉病等重要病害提供了理論基礎(chǔ)。

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