揚(yáng)輻粳系列水稻新品系稻瘟病抗性基因與穗頸瘟抗性分析

摘要：為加快揚(yáng)輻粳系列水稻品種的稻瘟病抗性改良，對(duì)275份水稻新品系進(jìn)行穗頸瘟抗性鑒定，利用分子標(biāo)記檢測(cè)了稻瘟病抗性基因Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita在試驗(yàn)材料中的分布，并分析了抗性基因分布與穗頸瘟抗性的關(guān)系。結(jié)果顯示，揚(yáng)輻粳系列水稻新品系中這6個(gè)基因出現(xiàn)的頻率分別為27.3%、10.5%、33.5%、4.7%、36.7%、23.3%，其中Pigm出現(xiàn)頻率最高，在揚(yáng)輻粳系列新品系中被重點(diǎn)選擇利用。大部分品系攜帶的稻瘟病抗性基因數(shù)量為1個(gè)或2個(gè)，沒(méi)有攜帶5個(gè)及以上數(shù)量抗性基因的品系，利用線性回歸分析發(fā)現(xiàn)水稻穗頸瘟抗性強(qiáng)弱與攜帶的抗病基因數(shù)量之間不存在線性相關(guān)關(guān)系。僅攜帶Pi2或Pigm單個(gè)基因的品系穗頸瘟病級(jí)顯著低于不攜帶任何檢測(cè)基因的品系。邏輯回歸分析結(jié)果表明，Pi2、Pik和Pigm可以通過(guò)與其他抗性基因的相互作用提高水稻的稻瘟病抗性。本研究結(jié)果可為揚(yáng)輻粳系列水稻新品種的選育提供理論指導(dǎo)，也可為江蘇省抗稻瘟病粳稻新品種的選育提供參考。

關(guān)鍵詞：揚(yáng)輻粳；穗頸瘟；抗性基因；抗病育種

中圖分類號(hào)：S435.111.4⁺1""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）22-0128-05

稻瘟病是一種由稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）引起的世界性真菌病害，一般發(fā)生時(shí)造成水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)造成減產(chǎn)40%～50%，甚至顆粒無(wú)收。從2008年開始，我國(guó)的水稻新品種審定對(duì)稻瘟病抗性實(shí)行“一票否決”制，但是近幾年我國(guó)稻瘟病發(fā)生面積仍在375萬(wàn)hm²左右^［1］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，一般通過(guò)種植抗性品種結(jié)合噴施殺菌劑來(lái)控制稻瘟病發(fā)生，但是農(nóng)藥防治不僅增加水稻種植成本，而且會(huì)造成環(huán)境污染、危害人類身體健康。因此，培育抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。

迄今為止，已報(bào)道的稻瘟病抗性基因有140多個(gè)。除第3染色體外，其他水稻染色體上都有這些基因成簇分布，其中第6、11、12染色體上分布的抗性基因數(shù)量最多^［2］。目前已克隆的稻瘟病抗性基因有30多個(gè)，其中部分基因位于同一基因座上，如Pi2、Pi9、Pi50、Pigm、Piz、Piz-t同為Piz位點(diǎn)上的復(fù)等位基因^［3］；Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p同為Pik位點(diǎn)上的復(fù)等位基因^［4］；Pid3與Pi25等位；Pia與PiCO39等位^［5-6］。這些基因的抗病特異性存在差異，一些在特定生態(tài)區(qū)具有廣譜持久抗性的抗稻瘟病基因已被廣泛用于抗稻瘟病水稻品種的選育^［7］。王軍等發(fā)現(xiàn)對(duì)江蘇稻瘟病病菌表現(xiàn)廣譜抗性的基因有Pita、Pib、Pi54和Pikm^［8］。閆影等研究表明，長(zhǎng)三角地區(qū)攜帶Pita、Pi5、Pi2和Pikm基因的粳稻種質(zhì)稻瘟病抗性較好^［9］。王小秋等研究了江蘇育成粳稻品種穗頸瘟抗性與稻瘟病抗性基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Pia、Pi5和Pita能夠顯著提高水稻對(duì)穗頸瘟的抗性，Pigm及基因組合Pia+Pita育種利用價(jià)值較高^［10］。目前，創(chuàng)造綜合性狀優(yōu)良的水稻抗稻瘟病核心種質(zhì)，篩選和利用廣譜持久的抗病基因組合，是水稻抗稻瘟病育種的重要方向^［11］。

隨著稻瘟病抗性基因的發(fā)掘和利用，水稻抗稻瘟病育種進(jìn)程不斷加快，我國(guó)每年審定的水稻品種中抗病品種比例持續(xù)增加。為更好地開展揚(yáng)輻粳系列水稻新品種的稻瘟病抗性改良工作，本研究對(duì)275份揚(yáng)輻粳系列水稻新品系進(jìn)行了穗頸瘟抗性鑒定，并利用分子標(biāo)記檢測(cè)了Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita等6個(gè)稻瘟病抗性基因在試驗(yàn)材料中的分布。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料和接種菌株

試驗(yàn)材料為筆者所在課題組新近育成的275份揚(yáng)輻粳系列水稻新品系，2023年種植在位于江蘇省揚(yáng)州市生態(tài)科技新城的江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所萬(wàn)福試驗(yàn)基地，5月15日播種，6月14日栽秧，常規(guī)水肥管理，稻瘟病病菌接種時(shí)間為各個(gè)品系的孕穗期。穗頸瘟抗性鑒定使用的菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，為2023年分離得到的江蘇省稻瘟病病菌代表菌株的孢子混合液。

1.2"穗頸瘟人工接種鑒定

在水稻孕穗初期采用混合菌株進(jìn)行接種，用注射器將接種液注入稻苞內(nèi)，每穗注射1 mL孢子懸浮液，每個(gè)品系接種8個(gè)稻穗^［12］。根據(jù)供試材料的生育期差異分期接種。接種后于水稻蠟熟期，按農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程》（NY/T 2646—2014）進(jìn)行病情調(diào)查，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，無(wú)??；1級(jí)，小枝梗發(fā)病，每穗損失率≤5.0%；3級(jí)，主軸或穂頸發(fā)病，每穗損失率為5.1%～20.0%；5級(jí)，主軸或穂頸發(fā)病，谷粒半癟，每穗損失率為20.1%～50.0%；7級(jí)，穂頸發(fā)病，大部分癟谷，每穗損失率為50.1%～70.0%；9級(jí)，穂頸發(fā)病，每穗損失率gt;70.0%。

1.3"分子標(biāo)記檢測(cè)

本研究檢測(cè)的6個(gè)稻瘟病抗性基因?yàn)镻i2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita。在水稻分蘗盛期，收集不同水稻品系新鮮葉片，按CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取基因組DNA。由武漢市景肽生物科技有限公司利用基于SNP（單核苷酸多態(tài)性）的PARMS（5引物擴(kuò)增受阻突變體系）技術(shù)進(jìn)行基因型檢測(cè)。

1.4"統(tǒng)計(jì)分析

采用辦公軟件Excel 2013 對(duì)研究中獲得的各類數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖。方差分析、線性回歸（linear regression）分析和邏輯回歸（logistic regression）分析基于jamovi v2.3（https：//www.jamovi.org）完成。

2"結(jié)果與分析

2.1"稻瘟病抗性基因分布

6個(gè)稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示，含有Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm或Pita的品系數(shù)量分別為75、29、92、13、101、64，分別占總數(shù)的27.3%、10.5%、33.5%、4.7%、36.7%、23.3%（圖1-A）。含有0、1、2、3、4個(gè)稻瘟病抗性基因的品系數(shù)量分別為47、113、86、27、2個(gè)，分別占比17.1%、41.1%、31.3%、9.8%、0.7%，沒(méi)有含5或6個(gè)抗性基因的品系（圖 1-B，表1）。在所檢測(cè)的6個(gè)基因中Pigm出現(xiàn)頻率最高，表明該基因在揚(yáng)輻粳系列新品系中被重點(diǎn)選擇利用。大部分品系攜帶的稻瘟病抗性基因數(shù)量為1個(gè)或2個(gè)，攜帶5個(gè)及以上數(shù)量抗性基因的品系沒(méi)有被選擇。

2.2"穗頸瘟抗性鑒定

275份水稻品系的穗頸瘟抗性人工接種鑒定結(jié)果為：病級(jí)為1、3、5、7、9的品系數(shù)量分別為56、60、32、34、93個(gè)，分別占總數(shù)的20.4%、21.8%、11.6%、12.4%和33.8%，無(wú)病級(jí)為0的品系（圖2）。結(jié)果顯示，揚(yáng)輻粳系列新品系的稻瘟病抗性差異較大，表明在育種材料的前期選擇過(guò)程中沒(méi)有對(duì)穗頸瘟抗性進(jìn)行嚴(yán)格篩選。

2.3"稻瘟病抗性基因與穗頸瘟抗性的相關(guān)性分析

對(duì)試驗(yàn)品系的抗病基因數(shù)量與穗頸瘟病級(jí)進(jìn)行回歸分析，回歸系數(shù)r為-0.68，r²為0.46，P值為0.21，表明試驗(yàn)材料的穗頸瘟抗性強(qiáng)弱與攜帶的抗病基因數(shù)量之間不存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系（圖3-A）。有的品系僅攜帶少數(shù)幾個(gè)基因但卻表現(xiàn)較強(qiáng)的穗頸瘟抗性，有的攜帶抗性基因數(shù)較多卻表現(xiàn)出對(duì)穗頸瘟高感（表1）。以上結(jié)果表明，在水稻的抗稻瘟病育種中應(yīng)當(dāng)充分結(jié)合表型鑒定與抗病基因檢測(cè)，而不能通過(guò)簡(jiǎn)單地增加抗病基因數(shù)量來(lái)改良品種抗性。

為分析單個(gè)基因?qū)λ腩i瘟抗性的貢獻(xiàn)，對(duì)攜帶單個(gè)基因的品系進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示攜帶Pi2或Pigm基因的品系穗頸瘟病級(jí)顯著低于不攜帶任何檢測(cè)基因的品系（圖3-B），表明Pi2和Pigm在單基因水平上能夠顯著增強(qiáng)水稻的穗頸瘟抗性。含Pigm的品系病級(jí)顯著低于Pi2，說(shuō)明Pigm對(duì)本次所用稻瘟病菌生理小種的抗性作用要好于Pi2。進(jìn)一步采用多因素有序邏輯回歸方法分析各基因與病級(jí)的相關(guān)性（表2），結(jié)果顯示Pi2、Pik和Pigm均與病級(jí)顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.001），表明Pi2、Pik和Pigm可能通過(guò)與其他基因間的互作提高水稻的穗頸瘟抗性。

3"討論與結(jié)論

穗頸瘟是稻瘟病中對(duì)水稻產(chǎn)量影響最大的類型，最經(jīng)濟(jì)有效的防治方法是種植抗病品種^［13］。傳統(tǒng)抗病育種主要通過(guò)抗性鑒定進(jìn)行表型選擇， 育種周期長(zhǎng)而且限制條件多。近年來(lái)，越來(lái)越多的抗稻瘟病基因被定位或克隆，利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行水稻抗病育種已經(jīng)成為常規(guī)手段^［14-16］。然而，稻瘟病生理小種復(fù)雜多變，不同地區(qū)或不同年份流行的生理小種存在差異，會(huì)導(dǎo)致新品種的抗性逐漸喪失^［17］。因此，利用新近流行的稻瘟病病菌生理小種進(jìn)行水稻品種的抗性鑒定，并解析稻瘟病抗性基因與水稻稻瘟病抗性之間的關(guān)系，對(duì)稻瘟病抗性品種的選育具有指導(dǎo)作用。

本研究利用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所2023年分離得到的菌株進(jìn)行揚(yáng)輻粳系列新品系的穗頸瘟抗性鑒定，對(duì)6個(gè)稻瘟病抗性基因Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測(cè)，并分析了稻瘟病抗性基因和水稻稻瘟病抗性之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6個(gè)稻瘟病抗性基因出現(xiàn)頻率分別為27.3%、10.5%、33.5%、4.7%、36.7%、23.3%。其中Pigm出現(xiàn)頻率最高，說(shuō)明揚(yáng)輻粳系列新品系在選育過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行了選擇。Pigm是一個(gè)廣譜、持久的稻瘟病抗性基因，來(lái)源于我國(guó)四川秈稻地方品種谷梅4號(hào)^［18］。該基因?qū)Σ煌镜貐^(qū)的大部分優(yōu)勢(shì)稻瘟病菌生理小種具有良好的抗性，在水稻抗稻瘟病育種中得到廣泛應(yīng)用^［19-23］。本研究發(fā)現(xiàn)Pigm對(duì)提高水稻穗頸瘟抗性具有極顯著的貢獻(xiàn)，證明了Pigm基因在水稻稻瘟病抗性改良中具有很高的育種利用價(jià)值。另外，Pi2也能夠顯著增強(qiáng)水稻稻瘟病抗性，同樣具有較高的育種利用價(jià)值。而Pi5、Pia、Pik和Pita單個(gè)基因?qū)μ岣邠P(yáng)輻粳系列新品系穗頸瘟抗性的貢獻(xiàn)不顯著，這可能是由于樣本總數(shù)不夠多、稻瘟病菌生理小種或生態(tài)環(huán)境差異導(dǎo)致的。

本研究試驗(yàn)材料中，大部分品系攜帶的稻瘟病抗性基因數(shù)量為1個(gè)或2個(gè)，沒(méi)有攜帶5個(gè)及以上數(shù)量抗性基因的品系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，穗頸瘟抗性與抗病基因數(shù)量之間不存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系，與前人的研究結(jié)果一致^{［7，10，24］}。通過(guò)多因素有序邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)，Pi2、Pik和Pigm均與病級(jí)極顯著負(fù)相關(guān)，表明這3個(gè)基因可能通過(guò)與其他基因的互作提高水稻的穗頸瘟抗性。例如，Pi2+Pia+Pik組合品系的病級(jí)低于Pi2+Pia，Pi2+Pia+Pik+Pita組合品系病級(jí)低于Pi2+Pia+Pita。然而，由于Pigm、Pi2和Pik相互組合的品系數(shù)量缺乏，本研究沒(méi)有對(duì)不同基因組合的抗性貢獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在稻瘟病抗性育種中，聚合主效抗性基因是改良水稻稻瘟病抗性的有效策略^［25］。宛柏杰等對(duì)80份骨干親本材料進(jìn)行接種鑒定和基因型分析，發(fā)現(xiàn)高抗的材料都聚合了2個(gè)及以上的抗病基因，其中主效抗病基因?yàn)镻ita或Pigm^［26］。王小秋等研究發(fā)現(xiàn)，Pita+Pi5以及Pita+Pia基因組合對(duì)增加江蘇粳稻品種的稻瘟病抗性具有顯著作用^［10］。周坤能等發(fā)現(xiàn)，Pi5和Pia基因?qū)λ久缥量剐杂酗@著貢獻(xiàn)，Pi5+Pia基因組合的抗性高于單個(gè)基因，Pi5+Pia+Pik基因組合抗性更強(qiáng)^［26］。綜上可知，除了挖掘和利用廣譜持久的單個(gè)抗性基因，通過(guò)基因聚合也是一種提高水稻品種稻瘟病抗性的重要育種策略。

本研究明確了揚(yáng)輻粳系列水稻新品系中主要稻瘟病抗性基因的基因型和穗頸瘟抗性，鑒定出穗頸瘟抗性較好的新品系，為揚(yáng)輻粳系列水稻新品種的選育提供了理論指導(dǎo)。此外，抗性基因和穗頸瘟抗性的相關(guān)性分析，有助于鑒別對(duì)江蘇省稻瘟病菌生理小種具有高效抗性的基因，為江蘇省抗稻瘟病粳稻新品種的選育提供參考。

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