金黃地鼠不同病理狀態(tài)頰囊黏膜的近紅外熒光成像差異分析

[摘要]目的 探討分析吲哚菁綠（ICG）近紅外熒光（NIF）成像技術(shù)對(duì)口腔潛在惡性疾患及口腔鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的可行性。方法 利用二甲基苯并蒽丙酮溶液，給予金黃地鼠頰囊黏膜不同時(shí)間的局部刺激，誘導(dǎo)建立輕/中度異常增生、重度異常增生、鱗狀細(xì)胞癌等病理狀態(tài)的頰黏膜病變模型。采用ICG-NIF技術(shù)對(duì)病變組織進(jìn)行熒光信號(hào)定量分析，免疫組織化學(xué)染色法對(duì)不同病理狀態(tài)黏膜的微血管密度（MVD）、微淋巴管密度（MLVD）進(jìn)行分析。結(jié)果 ICG-NIF熒光定量分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中黏膜病變組織的熒光強(qiáng)度均高于正常黏膜，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），且實(shí)驗(yàn)組中黏膜病變惡性程度越高，其熒光強(qiáng)度越高。組織學(xué)分析顯示，隨著黏膜病變惡性程度增加，MVD增加（Plt;0.05），MLVD減小（Plt;0.05）。結(jié)論 金黃地鼠異常增生的頰部黏膜病變與正常黏膜組織間具有ICG-NIF熒光信號(hào)差異，熒光定量分析方法具有輔助鑒別的臨床應(yīng)用潛能。

[關(guān)鍵詞]吲哚菁綠；近紅外熒光成像；口腔潛在惡性疾患；口腔鱗狀細(xì)胞癌

[中圖分類(lèi)號(hào)]R780.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[doi]10.7518/hxkq.2024.2024150

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，oscc）是口腔頜面部最常見(jiàn)的上皮來(lái)源的惡性腫瘤之一，目前公認(rèn)的治療方案是以手術(shù)治療為主的綜合治療，但是OSCC患者的5年生存率為60％左右，晚期患者生存率更低。因此OSCC患者的早期診斷及治療至關(guān)重要?？谇火つぐ装?、紅斑、扁平苔蘚等是一類(lèi)具有癌變潛能的口腔潛在惡性疾患（oral potentially malignant disorders，OPMD），臨床工作中需要對(duì)OPMD患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪和定期復(fù)查，以早期發(fā)現(xiàn)早期治療OSCC，降低死亡率。組織病理活檢是診斷OPMD和OSCC的金標(biāo)準(zhǔn)，但活檢屬于有創(chuàng)檢查，存在創(chuàng)傷大、耗時(shí)長(zhǎng)、患者接受程度低等問(wèn)題，不適合作為OPMD早期診斷及長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的手段。積極探索OPMD及OSCC的無(wú)創(chuàng)篩查、早期診斷方法具有重大意義。

近年來(lái)，自體熒光技術(shù)（autofluorescence imaging，AFI）、窄帶成像技術(shù)（narrow band imaging，NBI）、反射式共聚焦顯微鏡（reflectance confocalmicroscopy，RCM）、光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)（optical coherence tomography，OCT）等光學(xué)診斷技術(shù)逐漸得到發(fā)展川。吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）近紅外熒光（near-infrared fluorescence，N1F）成像技術(shù)的推廣應(yīng)用，為光學(xué)診斷提供了一種新的選擇。ICG-NIF的原理是利用病變組織血管、淋巴管缺陷形成的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)，使靜脈注射的ICG在病變部位聚集，繼而在近紅外光的激發(fā)下（常用的激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為820 nm）與周?chē)＝M織形成對(duì)比。目前ICG-NIF技術(shù)已經(jīng)在多種腫瘤疾病的熒光引導(dǎo)手術(shù)（fluorescence guided surgery，F(xiàn)GS）中被廣泛應(yīng)用，通過(guò)對(duì)ICG-NIF圖像的分析可以輔助區(qū)分腫瘤病變和正常組織。本研究旨在應(yīng)用二甲基苯并蒽（7，12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA）丙酮溶液誘導(dǎo)建立不同病理狀態(tài)的金黃地鼠頰黏膜病變模型，依靠ICG-NIF成像技術(shù)定量分析不同病變組織的熒光信號(hào)差異，探索通過(guò)熒光定量法輔助區(qū)分黏膜病變的可行性，為OPMD及OSCC的早期熒光輔助診斷提供一種新的策略。

1材料和方法

1.1主要材料和儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

金黃地鼠，清潔級(jí)，鼠齡4～6周，體重約為150 g，雌雄各半，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)操作符合南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.1.2主要試劑及儀器

DMBA（Sigma公司，美國(guó)），注射用ICG（25 mg/支，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司），CK5/6、CD31、LYVE1抗體購(gòu)買(mǎi)自艾博抗貿(mào)易有限公司。小動(dòng)物活體成像儀（IVIS Lumina，Perkin Elmer公司，美國(guó)），熒光手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)（Real-IGS，南京諾源醫(yī)療器械有限公司）。

1.2金黃地鼠頰黏膜癌變模型構(gòu)建

將40只金黃地鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、輕／中度異常增生組、重度異常增生組、OSCC組，每組10只。將金黃地鼠分別固定于自制鼠架上，拉開(kāi)頰囊，在實(shí)驗(yàn)組小鼠右側(cè)（病變側(cè)）頰囊黏膜下注射50 uL的0.5％DMBA丙酮溶液，在對(duì)照組小鼠頰囊黏膜及實(shí)驗(yàn)組左側(cè)（對(duì)照側(cè)）黏膜涂布丙酮溶液，每周處理3次。輕沖度異常增生組、重度異常增生組、OSCC組造模處理時(shí)間分別為4、6、10周，處理后禁食、禁飲2h。觀察監(jiān)測(cè)并記錄頰囊黏膜顏色、質(zhì)地變化以及增生、糜爛情況。初次處理后每2周于各組隨機(jī)挑選1只金黃地鼠，取頰囊黏膜進(jìn)行組織病理檢查，免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記CK5/6，確認(rèn)病理狀態(tài)。在造模結(jié)束后對(duì)各組小鼠拍照記錄頰囊黏膜狀態(tài)，之后進(jìn)行熒光成像及定量分析。

1.3ICG-NIF技術(shù)進(jìn)行熒光成像及定量分析

黏膜病變模型構(gòu)建成功后，4組中隨機(jī)選取5只金黃地鼠，腹腔注射2％戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，靜脈注射5 mg/kg ICG溶液，在注射后1、6、12、24 h通過(guò)熒光手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)采集頰部組織熒光信號(hào)進(jìn)行定量分析，24 h后拍攝熒光圖像。隨后安樂(lè)處死金黃地鼠，解剖其頰囊黏膜，置于小動(dòng)物活體成像儀拍攝熒光圖像。根據(jù)ImageJ軟件對(duì)目標(biāo)區(qū)域的熒光圖像定量分析，獲取其平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI），計(jì)算實(shí)驗(yàn)組中病變組織與正常組織的熒光信號(hào)對(duì)比（signalto backgroundratio， SBR）， SBR=MFI（病變黏膜）/MFI（對(duì)照側(cè)正常黏膜）。

1.4組織學(xué)分析

熒光檢測(cè)完成后，將頰囊組織固定于4％多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋、切片后進(jìn)行蘇木精，伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，免疫組織化學(xué)染色法CD31標(biāo)記微血管，LYVE1標(biāo)記微淋巴管，進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估。采用Weidner法進(jìn)行微血管密度（microvessel density，MVD）、微淋巴管密度（microlymphatic vesseldensity，MLVD）計(jì)數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。不同組別的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同病理狀態(tài)頰囊黏膜模型構(gòu)建

根據(jù)不同處理時(shí)間構(gòu)建金黃地鼠頰囊黏膜病變模型，熒光成像定量分析后進(jìn)行病理驗(yàn)證。肉眼大體觀察（圖1上），對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組對(duì)照側(cè)頰囊黏膜表面紅潤(rùn)光滑，彈性良好，微血管充盈清晰。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組病變側(cè)黏膜顏色較灰暗蒼白，黏膜增厚，表面粗糙，彈性減弱，微血管模糊，黏膜表面可見(jiàn)散在乳頭狀新生物。隨著造模時(shí)間增長(zhǎng)至6-10周時(shí)，黏膜病變累及范圍擴(kuò)大，新生物增生明顯呈菜花狀，突向口腔內(nèi)側(cè)，表面糜爛不規(guī)整，觸之易出血。

對(duì)黏膜組織進(jìn)行HE及CK5/6染色切片觀察（圖1中、下），對(duì)照組頰囊黏膜為復(fù)層鱗狀上皮，表面角化，黏膜厚度為4-6層細(xì)胞，基底細(xì)胞層結(jié)構(gòu)清晰，與人類(lèi)正常黏膜結(jié)構(gòu)相似。與對(duì)照組相比，輕／中度異常增生組病變側(cè)頰囊黏膜細(xì)胞整體排列尚規(guī)整，表面出現(xiàn)過(guò)度角化，顆粒細(xì)胞層明顯，棘層增厚，基底細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整；重度異常增生組病變側(cè)頰囊黏膜鱗狀上皮異常增生明顯，上皮分層不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂層次超過(guò)上皮2/3，上皮釘突增生呈指狀、水滴狀，細(xì)胞大小不一，核深染，核漿比增大，核分裂象增多，但基底膜仍完整；黏膜癌變組病變側(cè)頰囊黏膜細(xì)胞異常增生，核分裂象明顯增加，可見(jiàn)病理性核分裂象，瘤細(xì)胞突破基底膜，呈團(tuán)塊狀、條索狀侵犯黏膜下結(jié)締組織，形成浸潤(rùn)癌巢。

2.2熒光成像結(jié)果及定量分析

ICG-NIF熒光定量分析結(jié)果（圖2）顯示，各組中黏膜組織熒光強(qiáng)度均在注射后持續(xù)衰減，實(shí)驗(yàn)組癍變側(cè)黏膜熒光強(qiáng)度始終高于對(duì)照組。靜脈注射24h后對(duì)頰囊黏膜進(jìn)行熒光成像及定量分析（圖3，表1），對(duì)照組中頰囊黏膜組織內(nèi)熒光信號(hào)微弱，MFI為（65+9.16）AU；實(shí)驗(yàn)組中病變側(cè)黏膜組織熒光信號(hào)均高于對(duì)照側(cè)黏膜，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；各實(shí)驗(yàn)組中，隨著黏膜病變惡性程度增加，黏膜組織MFI升高，3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中OSCC組病變黏膜的MFI達(dá)到了（325±47.46） AU，SBR為4.97±0.87。

2.3不同病理狀態(tài)頰囊黏膜組織學(xué)分析

對(duì)各組黏膜下層組織MVD和MLVD進(jìn)行分析（圖4，表1），與對(duì)照維相比，各實(shí)驗(yàn)組病變側(cè)黏膜均表現(xiàn)出MVD增加，MLVD減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（plt;0.05）。各實(shí)驗(yàn)組中，隨著黏膜病變惡性程度增加，MVD密度增加，3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中OSCC組織內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)豐富，MVD計(jì)數(shù)達(dá)到了101.2±15.30。隨著刺激時(shí)間增長(zhǎng)，MLVD在實(shí)驗(yàn)組中有下降的趨勢(shì)，OSCC組織中MLVD計(jì)數(shù)為4.2±1.14，與異常增生組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），而2個(gè)異常增生組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

3討論

研究表明，5％-18％的OPMD會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y，其中伴有中度或重度異常增生的病損癌變可能性更高。針對(duì)OPMD的早期篩查及診斷有利于降低oscc發(fā)病率，一直是研究的熱點(diǎn)。目前，臨床已較廣泛地應(yīng)用AFI、甲苯胺藍(lán)染色技術(shù)作為傳統(tǒng)口腔檢查的輔助手段，以幫助臨床醫(yī)生無(wú)創(chuàng)篩查OPMD，并輔助判斷取材活檢的部位。AFI通過(guò)識(shí)別健康口腔黏膜熒光基團(tuán)的淡綠色熒光（波長(zhǎng)515 nm），與黏膜病變熒光缺失區(qū)域進(jìn)行區(qū)分，但該技術(shù)特異性較低，出血區(qū)域會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性，高度角化區(qū)域會(huì)出現(xiàn)假陰性，且圖像判斷依賴(lài)檢查者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，具有較強(qiáng)的主觀性。甲苯胺藍(lán)染色技術(shù)可以增強(qiáng)局部病損的可視性，從而顯示病變部位，甚至發(fā)現(xiàn)隱匿、無(wú)臨床表現(xiàn)的OPMD病損，但具有較高的假陽(yáng)性，且存在誤食風(fēng)險(xiǎn)。ICG-NIF成像技術(shù)目前已在口腔癌的FGS中被逐漸應(yīng)用，能夠較好地顯示腫瘤邊界，輔助界定手術(shù)切緣。相較NBI、RCM、OCT等技術(shù)，ICG-NIF的熒光具備更深的組織穿透，檢查結(jié)果具有可定量分析的優(yōu)勢(shì)。將該技術(shù)應(yīng)用于口腔黏膜癌變組織的篩查，能較好輔助判斷黏膜狀態(tài)，符合OPMD的長(zhǎng)期隨訪和狀態(tài)監(jiān)測(cè)的臨床需求。但其臨床應(yīng)用需要注射熒光造影劑，并需要特定成像設(shè)備的支持，這對(duì)該技術(shù)的廣泛推廣具有一定的限制。

利用金黃地鼠的頰囊誘導(dǎo)口腔癌模型是較為理想且成熟的動(dòng)物模型。頰囊是金黃地鼠特有的解剖結(jié)構(gòu)，相關(guān)動(dòng)物模型已被廣泛用于口腔癌前病變、口腔癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究及口腔器械的生物學(xué)評(píng)價(jià)。本研究利用該動(dòng)物模型，在給予不同時(shí)間的局部刺激后，成功誘導(dǎo)出黏膜輕/中度異常增生、重度異常增生及OSCC等不同病理階段，且較好地模擬了臨床中口腔黏膜癌變的進(jìn)展規(guī)律。本研究對(duì)該動(dòng)物模型中不同病理階段的黏膜組織進(jìn)行熒光成像定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著黏膜病變惡性程度的增加，ICG-MF熒光信號(hào)增強(qiáng)，且黏膜表面角化物對(duì)ICG-NIF熒光強(qiáng)度的影響微弱，利用該定量分析方法對(duì)于輔助區(qū)分正常黏膜與癌前病變黏膜、癌變黏膜有一定的參考價(jià)值。

目前認(rèn)為，熒光分子在病變組織的蓄積主要依賴(lài)EPR效應(yīng)。本研究從組織學(xué)層面分析不同病理階段的黏膜組織，發(fā)現(xiàn)金黃地鼠黏膜病變惡性程度的進(jìn)展伴隨著MVD的增加及MLVD的減少，揭示了黏膜組織在異常增生進(jìn)展過(guò)程中微血管、淋巴管的改建規(guī)律。這些改變會(huì)導(dǎo)致病變黏膜組織中更多的ICG灌注以及更長(zhǎng)時(shí)間的蓄積，從而與正常黏膜形成熒光信號(hào)對(duì)比，解釋了惡性程度更高的黏膜病變模型中ICG熒光信號(hào)增強(qiáng)的原因。實(shí)際應(yīng)用中，炎癥組織血管通透性的增強(qiáng)會(huì)對(duì)ICG-MF成像的結(jié)果產(chǎn)生干擾，本研究的動(dòng)物模型具有一定局限性，無(wú)法模擬并排除炎癥組織的干擾。Pal等報(bào)道了“熒光壽命”在熒光診斷中的重要性，強(qiáng)調(diào)癌變細(xì)胞對(duì)于熒光分子ICG更多的攝取也會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)的增強(qiáng)，提示細(xì)胞生物學(xué)行為的改變?cè)陴つげ∽冞M(jìn)展過(guò)程中也同樣需要被關(guān)注。

綜上所述，本研究表明通過(guò)ICG-NIF熒光定量分析，可輔助鑒別不同病理狀態(tài)的黏膜病變，具備臨床應(yīng)用的潛能。當(dāng)然，本研究采用的標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型具有一定局限性，后續(xù)研究還需要進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。