破布葉組培快繁技術(shù)

關(guān)鍵詞：破布葉；組培快繁；種苗；中藥材

0 引言

破布葉（MicrocospaniculataL.）為椴樹(shù)科破布葉屬植物，其干燥葉是特色南藥布渣葉，是王老吉、加多寶等涼茶品牌的主要原材料之一，素有“涼茶瑰寶”之美譽(yù)。布渣葉微酸，涼，歸脾、胃經(jīng)，具有消食化滯、清熱利濕功效，還具有抗炎、抑菌等作用[1-3]。布渣葉化學(xué)成分較為復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)其含有生物堿、黃酮、揮發(fā)油和有機(jī)酸等多種成分[4-6]。破布葉主產(chǎn)于廣東省、海南省、云南省和廣西壯族自治區(qū)等地，兩廣地區(qū)資源豐富，并且藥用歷史悠久。破布葉的產(chǎn)區(qū)較多，各地的藥材質(zhì)量參差不齊[7-9]。近年來(lái)，涼茶等保健產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)破布葉的市場(chǎng)需求越來(lái)越大，破布葉野生資源日益匱乏，人工種植勢(shì)在必然。由于破布葉的傳統(tǒng)扦插繁殖成活率低，種子播種發(fā)芽率不高，市場(chǎng)對(duì)破布葉種苗的需求較大，探索破布葉種苗繁育新技術(shù)是有效的途徑和方式。植物組培技術(shù)是一種高新生物技術(shù)，已成功應(yīng)用于果樹(shù)、花卉、蔬菜、林木和中藥材等種苗產(chǎn)業(yè)化，目前開(kāi)展組培快繁研究的椴樹(shù)科植物品種比較多，如紫椴、蒙椴、南京椴等，而關(guān)于破布葉的組培快繁研究未見(jiàn)報(bào)道[10-14]。本研究通過(guò)植物組培快繁技術(shù)，培養(yǎng)成完整的破布葉脫毒植株，為破布葉種質(zhì)資源的保存、優(yōu)質(zhì)種苗的產(chǎn)業(yè)化及中藥材質(zhì)量的控制提供一種全新技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以破布葉半年生植株為試驗(yàn)材料，破布葉種子于2021年12月在廣東省茂名市電白區(qū)觀珠鎮(zhèn)廣東慧達(dá)康制藥有限公司的涼茶示范基地采集，2022年1月在中國(guó)科學(xué)院華南植物園種質(zhì)資源圃于沙土內(nèi)播種，設(shè)置遮光度95%黑網(wǎng)遮蓋，30d后發(fā)芽，3個(gè)月后高15cm帶2～3對(duì)對(duì)葉幼苗。之后開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行防蟲(chóng)、防菌、控水預(yù)處理，使其體內(nèi)的含菌量及含水量盡量降低，使外植體材料達(dá)到較佳狀態(tài)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇

在播種苗中選擇健壯無(wú)病蟲(chóng)害的破布葉幼苗，切取其幼嫩莖段，長(zhǎng)度1.5～2.0cm，切除葉片后用自來(lái)水沖洗1h，在超凈工作臺(tái)上用紙擦干表面水分備用。

1.2.2 外植體消毒

用75%的酒精擦拭30s后，用無(wú)菌水浸泡。放入10%次氯酸鈉溶液中消毒3～7min，無(wú)菌水沖洗3遍后用無(wú)菌濾紙吸干水分，在超凈工作臺(tái)上接種于預(yù)設(shè)的培養(yǎng)基。

1.2.3 培養(yǎng)基

在不同種類(lèi)和不同比例基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同培養(yǎng)階段添加不同種類(lèi)及濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，設(shè)定不同培養(yǎng)基配方，觀察各預(yù)設(shè)培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，篩選最適培養(yǎng)基配方。一般情況下，培養(yǎng)基均添加3%蔗糖、0.4%瓊脂，pH值6.0；出根培養(yǎng)基則用0.6%卡拉膠代替0.4%瓊脂。

1.2.4 培養(yǎng)條件

光照強(qiáng)度2000～3000lx，光照時(shí)間12h/d，培養(yǎng)溫度（25±1）°C。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)外植體滅菌效果的影響

外植體滅菌后接種到預(yù)設(shè)培養(yǎng)基中，10d后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)污染的外植體，20d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

由表1可知，次氯酸鈉溶液的滅菌處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)破布葉外植體的滅菌效果影響很大，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的污染數(shù)逐步減少，但同時(shí)其死亡芽數(shù)也隨之增加。因此，合理設(shè)定滅菌時(shí)間對(duì)外植體處理極為重要，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)滅菌時(shí)間6min時(shí)外植體成活率最高，為94%，并且植株保持鮮綠，所萌發(fā)側(cè)芽狀態(tài)正常，如圖1所示。

2.2 不同6-BA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

將經(jīng)過(guò)消毒步驟后存活的無(wú)污染外植體，接種于預(yù)設(shè)培養(yǎng)基中，經(jīng)35d培養(yǎng)后，開(kāi)始產(chǎn)生不定芽。觀察外植體的生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率。

由表2可知，在合適的培養(yǎng)基中可以誘導(dǎo)不定芽的形成，6-BA對(duì)破布葉不定芽誘導(dǎo)的影響較大，培養(yǎng)基中6-BA含量達(dá)到3mg/L時(shí)，不定芽出現(xiàn)明顯的玻璃化，而且繁殖率較低，表明高濃度的6-BA會(huì)抑制不定芽的誘導(dǎo)。從試驗(yàn)的培養(yǎng)基效果來(lái)看，A4較為合適，其6-BA含量0.5mg/L，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)92.5%，不定芽鮮綠，葉片展開(kāi)正常，基部有少量愈傷組織產(chǎn)生，如圖2所示。

2.3 不同基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽生長(zhǎng)的影響

在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，破布葉的不定芽即使在低濃度6-BA培養(yǎng)基中仍然會(huì)出現(xiàn)不同程度的玻璃化、黃葉、掉葉現(xiàn)象，推測(cè)可能是基本培養(yǎng)基需要調(diào)整。因此，在同一激素水平，設(shè)置多個(gè)不同種類(lèi)、不同比例的基本培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，不同基本培養(yǎng)基由于營(yíng)養(yǎng)含量不同，所以對(duì)不定芽生長(zhǎng)有較大影響。營(yíng)養(yǎng)含量過(guò)低（如1/2N6、1/4N6）會(huì)使不定芽無(wú)法誘導(dǎo)，甚至?xí)?dǎo)致原材料的死亡；營(yíng)養(yǎng)含量過(guò)高（如WPM、1/2WPM）則會(huì)導(dǎo)致原材料營(yíng)養(yǎng)失衡，雖然誘導(dǎo)出不定芽，但出現(xiàn)黃葉、掉葉，最后甚至死亡。因此，適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)含量對(duì)不定芽的生長(zhǎng)起重要的作用。本研究基本培養(yǎng)基為1/4MS，其營(yíng)養(yǎng)含量最適合破布葉的不定芽生長(zhǎng)。

2.4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽繼代增殖的影響

將獲得的叢生不定芽進(jìn)行分切，使得每個(gè)不定芽0.8～1.2cm，每一叢芽保留有3～5個(gè)不定芽。以1/4MS為基本培養(yǎng)基，加上0.5mg/L的6-BA，再配以不同濃度的GA3和NAA，進(jìn)行繼代增殖，重復(fù)3次，每次轉(zhuǎn)移周期35d。觀察不定芽的誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)及破布葉不定芽的生長(zhǎng)狀況。

由表4可知，NAA濃度過(guò)高會(huì)引起破布葉不定芽的玻璃化，適當(dāng)濃度的NAA有壯芽的作用。此外，NAA和GA3適量配合使用，能使繼代芽生長(zhǎng)青綠壯盛，如圖3所示。B6培養(yǎng)基1/4MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.1mg/LGA3，為破布葉不定芽繼代增殖的最佳培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)3.3。

2.5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA、IBA對(duì)出根誘導(dǎo)的影響

以1/4MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固劑將4%瓊脂改為6%卡拉膠，將高3cm左右的合適單芽接種到添加不同濃度的NAA、IBA組合的生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7～15d，根點(diǎn)發(fā)生，培養(yǎng)15～20d根系發(fā)生，長(zhǎng)成完整的植株。在培養(yǎng)室中培養(yǎng)35d后，統(tǒng)計(jì)破布葉的生根率。

由表5可知，在1/4MS為基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同濃度的IBA，對(duì)破布葉的誘導(dǎo)生根有明顯的作用，IBA添加的濃度過(guò)高會(huì)抑制根點(diǎn)的形成，濃度過(guò)低無(wú)法誘導(dǎo)根系的形成。同樣，適量的NAA也能促進(jìn)破布葉的根系誘導(dǎo)。誘導(dǎo)出根最適宜的培養(yǎng)基為C6：1/4MS+1.0mg/LIBA+0.1mg/LNAA，其出根時(shí)間只有12d、平均發(fā)根數(shù)達(dá)2.6條、生根率達(dá)93.1%，如圖4所示。

2.6 組培苗煉苗及移栽

將破布葉生根瓶苗放至溫室苗圃?xún)?nèi)，保持合適的溫度、光照，進(jìn)行煉苗7～10d，使其適應(yīng)瓶外的自然環(huán)境。

將完成煉苗的破布葉生根小苗的根部用清水清洗干凈，移栽至混合基質(zhì)（泥炭∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1）中，澆透定根水。移栽后7d內(nèi)用遮光率95%的黑網(wǎng)遮蔭，保持75%濕度，溫度控制在28°C以下。10d后，可掀開(kāi)黑網(wǎng)，保持通風(fēng)及其土壤濕潤(rùn)，待組培小苗長(zhǎng)出新葉，即移栽成活，如圖5所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，破布葉組培小苗移栽成活率98%。

3 結(jié)束語(yǔ)

布渣葉是嶺南特色中藥材，具有藥用和食用價(jià)值，為涼茶的主要原材料之一，是國(guó)內(nèi)中藥材市場(chǎng)上的常銷(xiāo)產(chǎn)品，市場(chǎng)需求量大，但由于長(zhǎng)時(shí)期是野生采收，質(zhì)量參差不齊。栽培種植又缺乏規(guī)范的技術(shù)規(guī)程，種子種苗來(lái)源雜亂，質(zhì)量不高。本研究采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)破布葉種苗的規(guī)模化生產(chǎn)，其組培技術(shù)指標(biāo)為外植體處理成功率94%、繁殖系數(shù)3.3、生根率93.1%及移栽成活率98%。破布葉組培種苗生產(chǎn)技術(shù)于2024年2月獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)[15]，其成功應(yīng)用為破布葉較大規(guī)模栽培種植奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，將促進(jìn)嶺南特色中藥材布渣葉產(chǎn)業(yè)化的形成，實(shí)現(xiàn)涼茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。