捏脊對不同日齡自閉癥大鼠海馬突觸相關蛋白表達及神經可塑性的影響

〔摘要〕 目的 通過觀察捏脊對23、37、51日齡自閉癥大鼠行為學及海馬區(qū)腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）、酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B， TrkB）、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cyclic AMP response elementbinding protein， CREB）、突觸素（synaptophysin， Syn）、突觸后致密蛋白-95（postsynaptic density-95， PSD-95） 蛋白表達的影響，探究捏脊對不同發(fā)育時期自閉癥大鼠神經可塑性的影響。方法 隨機選取42只由丙戊酸鈉誘導的自閉癥模型大鼠，分為模型組、PN23模型組、PN23捏脊組、PN37模型組、PN37捏脊組、PN51模型組和PN51捏脊組，每組6只；另選取6只正常大鼠為空白組。捏脊組在指定時間開始捏脊干預，每日1次，1次21遍，連續(xù)干預28 d；空白組和模型組僅模擬抓取和固定。各組大鼠于干預前后進行行為學檢測，取材選擇海馬組織，采用Western blot檢測BDNF、TrkB、CREB蛋白表達水平，免疫熒光法檢測Syn、PSD-95的平均光密度值。結果 與空白組比較，其余各組大鼠的站立次數減少、理毛次數增多（P＜0.05）；與空白組比較，模型組海馬BDNF、TrkB、CREB蛋白表達量降低（P＜0.05，P＜0.01）；與PN23模型組比較，PN23捏脊組大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB蛋白表達量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與PN37模型組比較，PN37捏脊組大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB蛋白表達量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與空白組相比，模型組Syn、PSD-95的平均光密度均降低（P＜0.01）；與同日齡的模型組比較，各捏脊組大鼠海馬Syn、PSD-95的平均光密度均升高（P＜0.01）。結論 捏脊可以改善自閉癥大鼠的行為障礙，上調不同日齡自閉癥模型大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB、Syn、PSD-95蛋白表達量，改善突觸功能，提高神經可塑性。同時，提示捏脊對發(fā)育早期的自閉癥模型大鼠治療效果較好。

〔關鍵詞〕 捏脊；小兒推拿；自閉癥；突觸素；神經營養(yǎng)因子；腦功能

〔中圖分類號〕R244.1 〔文獻標志碼〕A &nbF9l9C3rUqDM/vv88S7gdhifOBiMPzNiSY4+4NOJOe5Y=sp; 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.020

Effects of spinal manipulation on the expression of synaptic-related proteins and neuroplasticity in the hippocampus of autistic rats at

different ages

TANG Wenzheng1， TANG Jiayao1， TANG Qing1， GUO Xiaonan1， HUANG Qianhan2， LIN Lili1，3*

1. Fujian University of Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China; 2. Macau University of Science and Technology， Macau SAR 999078， China; 3. Fujian Academy of Chinese Medical Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of spinal manipulation on the behavior and expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， tyrosine kinase receptor B （TrkB）， cyclic AMP response element binding protein （CREB）， synaptophysin （Syn）， and postsynaptic dense-95 （PSD-95） in the hippocampus of 23， 37， and 51-day-old autistic rats， and to explore its impact on neuroplasticity in autistic rats at different developmental stages. Methods Forty-two autism model rats induced by sodium valproate were randomly divided into model group， PN23 model group， PN23 spinal manipulation group， PN37 model group， PN37 spinal manipulation group， PN51 model group， and PN51 spinal manipulation group， with six rats in each group. Additionally， six normal rats were selected as the blank group. The spinal manipulation group received daily spinal manipulation interventions， 21 repetitions per session， for 28 consecutive days， starting at the specified time points. The blank group and model groups only underwent simulated grasping and fixation. Behavioral tests were conducted on rats in each group before and after the interventions. Hippocampal tissue was selected， and the protein expression levels of BDNF， TrkB， and CREB were checked using Western blot， while the average optical density values of Syn and PSD-95 were measured by immunofluorescence. Results Compared with the blank group， the remaining groups showed a decrease in standing frequency an increase in hair grooming frequency （P<0.05）. Compared with the blank group， the protein expression levels of BDNF， TrkB， and CREB in the hippocampus of the model groups decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with the PN23 model group， the protein expression levels of BDNF， TrkB， and CREB in the hippocampus of PN23 spinal manipulation group increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with the PN37 model group， the protein expression levels of BDNF， TrkB， and CREB in the hippocampus of PN37 spinal manipulation group increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with the blank group， the average optical density of Syn and PSD-95 in the model groups decreased （P<0.01）. In comparison with the model groups of the same age， the average optical density of Syn and PSD-95 in the hippocampus of rats in all spinal manipulation groups increased （P<0.01）. Conclusion Spinal manipulation can improve behavioral disorders in autistic rats， upregulate the expression of BDNF， TrkB， CREB， Syn， and PSD-95 in the hippocampus of autistic model rats at different ages， enhance synaptic function， and improve neuroplasticity. Furthermore， it is suggested that spinal manipulation has a better therapeutic effect on autistic model rats in the early stages of development.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 spinal manipulation; pediatric massage; autism spectrum disorders; synaptophysin; neurotrophic factors; brain function

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorders， ASD），又稱自閉癥，是一種兒童神經系統(tǒng)異常疾病，臨床表現為情感淡漠、社交障礙、活動及興趣局限、行為重復刻板等。自閉癥的發(fā)病機制尚不明確，且仍缺乏治療自閉癥核心癥狀的特效藥物[1]。腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）是腦內含量最豐富的神經營養(yǎng)因子之一，對神經元的分化、存活、生長發(fā)育等過程都有重要意義，并且能夠防止神經元受損及死亡。酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B， TrkB）是其主要的功能受體，在機體所有神經營養(yǎng)因子中，TrkB與BDNF是唯一一對在時空表達上呈現高度一致性的受體配體復合體，兩者均廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)，TrkB通過與BDNF結合而啟動細胞內信號傳導，激活多條下游信號通路，發(fā)揮營養(yǎng)和保護神經的作用[2]。環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cyclic AMP response element binding protein， CREB）是一種核轉錄因子，參與調控突觸和神經元相關基因表達，CREB的激活也可以促進BDNF的轉錄[3]。突觸后致密蛋白-95（postsynap？鄄tic density-95， PSD-95）參與神經細胞間突觸連接的建立和塑造，并且與學習、認知以及記憶等高級腦功能的形成緊密相關[4]。突觸素（synaptophysin，Syn）是一種分布于突觸前囊泡膜上的膜結構蛋白，因其分布具有特異性，所以可以作為一種突觸標識蛋白，對Syn進行定位和定量研究，可分析突觸的分布、密度以及突觸可塑性[5]。而丙戊酸鈉（sodium valproab0+UhRf4zgWbfCHZ0oy1hQ==te， VPA）誘導的自閉癥模型大鼠，在生長過程中中樞神經系統(tǒng)的神經元凋亡和突觸發(fā)育往往存在異常[6]。

《素問·骨空論》曰：“督脈者……與太陽起于目內眥，上額交巔上，入絡腦?！蹦蠹汞煼ㄍㄟ^捏、提、推、捻等復合手法，直接作用于背部足太陽膀胱經和督脈?，F代研究認為，捏脊可以通過刺激脊神經及動靜脈叢，影響腦部發(fā)育繼而緩解中樞神經系統(tǒng)的功能障礙[7]。已有研究表明，捏脊可以調節(jié)抑郁癥大鼠海馬區(qū)免疫和炎癥相關基因的表達水平，并改善抑郁癥大鼠焦慮情緒[8]。自閉癥病因不清，一般于3歲前起病，且6歲以前兒童大腦發(fā)育最快，此時的大腦具有較強的神經可塑性，故0～6歲治療效果最佳[9]。目前，臨床中通過捏脊干預自閉癥兒童的最佳時間節(jié)點尚不明確，因此本課題擬在自閉癥模型大鼠發(fā)育的3個時間節(jié)點（23、37、51日齡）介入捏脊干預，觀察捏脊對不同發(fā)育時期自閉癥大鼠神經可塑性的影響，為優(yōu)化自閉癥的臨床治療方案提供部分研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF級健康Wistar大鼠50只，雌雄各半。雌性大鼠體質量為（250±20） g，雄性大鼠體質量為（300±20） g，由上海斯萊克試驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號：SYXK（閩）2019-0007。于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物房飼養(yǎng)（SPF級），溫度20～24 ℃，相對濕度40%～50%，自然照明，大鼠均自由攝食、自由飲水。本實驗經福建中醫(yī)藥大學倫理文員會批準許可（倫理審批號：2021-80）。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 曠場實驗檢測系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XZ301）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司，型號：5430R）；電泳儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司，型號：Mini-PROTEAN，ChemiDoc XRS+）；冰凍切片機（上海賽默飛世爾儀器有限公司，型號：NX50）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司，型號：DMIL）。

1.2.2 主要試劑 BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0010）；Marker（美國Thermo公司，批號：26616）；鼠單克隆抗體β-actin、兔多克隆抗體BDNF、兔多克隆抗體TrkB、兔重組抗體PSD-95（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：60008-1-lg、25699-AP、13129-1-AP、81106-PBS）；兔單克隆抗體CREB、鼠多克隆抗體Syn（英國Abcam公司，批號：ab32515、20665-1-AP）。

1.3 造模及分組

自閉癥模型大鼠制備參考SCHNEIDER等[10]的方法。雌雄大鼠以1∶1的比例于晚上7點進行合籠，于次日9點檢查有無陰栓脫落，有陰栓記為妊娠第0.5天。按照隨機數表法將Wistar孕鼠分為模型組孕鼠和空白組孕鼠。模型組孕鼠于孕12.5 d時腹腔注射VPA溶液（600 mg/kg，濃度250 mg/mL，生理鹽水配制），產下的大鼠經發(fā)育行為學檢測（體質量、睜眼時間、方向趨向性測試、足底熱痛試驗、游泳試驗）確認為模型大鼠，模型大鼠的體質量較空白組低，睜眼時間晚于空白組，方向趨向性測試、足底熱痛試驗、游泳試驗的表現均弱于空白組。空白組孕鼠于孕12.5 d時腹腔注射同等劑量的生理鹽水，產下的大鼠為空白大鼠，出生當天記為PN1（postnatal day1）。隨機選取6只空白組孕鼠產下的大鼠，記為空白組。隨機選取42只模型大鼠，隨機分為7組，每組6只，即模型組、PN23捏脊組、PN23模型組、PN37捏脊組、PN37模型組、PN51捏脊組、PN51模型組（組別以介入干預時捏脊組大鼠的日齡命名，空白組和模型組之間不做捏脊干預療效對比）。

1.4 干預方法

捏脊具體操作方法[11]：將大鼠從籠中取出來，待大鼠情緒穩(wěn)定自然平靜；操作者采取坐姿，呼吸均勻，肩部放松，在開始捏脊前至上而下輕撫大鼠背部1～3次；操作者左手以毛線手套蓋住大鼠頭部并以輕柔的方式固定，右手的食指、中指指尖放置于脊柱兩側，拇指指尖放置于脊柱上，食指、中指與拇指相對用力，提起大鼠脊柱兩側的皮膚；拇指指尖緊貼脊柱，食指、中指交替運動，從大鼠脊中線尾根部開始，邊捏邊向大鼠頭部推移，一直捏到大椎穴處停止，計為1遍，手法的刺激強度以大鼠忍耐為度（大鼠不發(fā)出尖叫，較平靜）。每只大鼠每日干預時長約為3 min。整個實驗中，捏脊操作由同一人進行操作，操作者事先經過培訓以保證手法穩(wěn)定性。各捏脊組干預于每天同一時間進行，每日1次，1次21 遍，連續(xù)干預28 d[12]?？瞻捉M與各模型組大鼠僅模擬抓取和固定，不予干預。

1.5 取材

干預結束第2天，用20%烏拉坦麻醉大鼠，麻醉成功后打開大鼠胸腔，將心臟充分暴露在視野下。用預冷過的生理鹽水勻速注入大鼠左心室并同時剪開右心耳，待血液流盡至肺、肝及腸系膜顏色表現為蒼白。將大鼠斷頭處死，取頭顱，剪開皮膚，露出顱骨。將大腦沿矢狀中線切開，取半側大腦浸泡于預冷過的4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h，以備后續(xù)進行免疫熒光檢測，另外半側大腦鈍性分離取出海馬組織，并立即置于干冰中保存，隨后轉移到-80 ℃冰箱中，以備進行免疫蛋白印跡檢測。

1.6 行為學檢測

將曠場實驗箱（規(guī)格為72 cm×72 cm×40 cm的長方體，四周及底部均為黑色）放置于環(huán)境光線強度為80～100 lux的無背景噪聲室內。實驗前用75%乙醇清潔曠場實驗箱。選取大鼠非活動期（8：00—16：00）進行，將大鼠依次放入曠場實驗箱中心區(qū)域內，每次1只，每只大鼠活動時長為5 min，人工記錄大鼠在箱內站立、理毛等行為。每只大鼠測試完用75%乙醇對曠場實驗箱內進行徹底消毒清潔，清除動物排泄物及異味，避免影響下一只大鼠。均在PN22及干預結束次日進行曠場實驗。

1.7 指標檢測

1.7.1 Western blot檢測大鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB蛋白的相對表達量 將海馬組織從-80 ℃冰箱中取出稱重，加入蛋白裂解液后離心提取上清液進行蛋白量檢測。根據說明書進行SDS-PAGE凝膠配制，上樣，100 V電泳60 min，濕轉，TBST溶液洗膜，封閉15 min后孵育一抗BDNF（1∶1 000）、TrkB （1∶1 000）、CREB（1∶2 000）、Syn（1∶2 000）、PSD-95（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）；與PVDF膜一起放入密封袋中置于搖床，4 ℃孵育過夜后，用TBST溶液清洗3次，1次5 min，二抗比例（兔二抗1∶10 000，鼠二抗1∶5 000）溫室孵育1 h后TBST溶液清洗3次，1次5 min；洗膜顯影，用Image Lab軟件分析各條帶的灰度值。

1.7.2 免疫熒光檢測大鼠海馬組織Syn、PSD-95的平均光密度值 從-20 ℃冰箱取出海馬冷凍切片，于室溫復溫約1 h，采用PBS溶液清洗后滴加適量封閉液（10%TritonX-100∶羊血清∶PBS為2∶5∶43），37 ℃烘箱封閉1 h后加入一抗[Syn（1∶100），PSD-95（1∶200），（一抗稀釋液，0.3％ TritonX-100∶羊血清為99∶1）]置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日洗滌后滴加二抗[抗Syn（1∶200），抗 PSD-95（1∶400）]，37 ℃烘箱孵育1 h，洗滌后滴加適量DAPI；最后使用×100熒光顯微鏡觀察，并通過Image J軟件計算Syn、PSD-95的平均光密度。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量資料均采用“ｘ±s”表示，符合正態(tài)分布的兩兩比較采用t檢驗，不滿足正態(tài)分布的兩兩比較采用非參數檢驗，滿足正態(tài)分布的組間比較采用單因素方差分析，方差齊進行LSD檢驗，方差不齊則用Dunnett T3法。以P＜0.05為數據差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠曠場實驗指標檢測結果

與空白組比較，其余各組大鼠站立次數均減少（P＜0.01），大鼠理毛次數均增多（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖1—2。

2.2 各組大鼠海馬組織BDNF、CREB、TrkB蛋白相對表達結果

與空白組比較，模型組大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB蛋白表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與PN23模型組比較，PN23捏脊組大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB蛋白表達水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與PN37模型組比較，PN37捏脊組大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB蛋白表達水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與PN51模型組比較，PN51捏脊組BDNF、TrkB、CREB蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖3、表1。

2.3 各組大鼠海馬組織Syn、PSD-95免疫熒光檢測結果

與空白組比較，模型組Syn、PSD-95的平均光密度均降低（P＜0.01）；分別與同日齡的模型組比較，各捏脊組大鼠海馬Syn、PSD-95平均光密度均升高（P＜0.01）。詳見圖4—6。

3 討論

自閉癥成因復雜?，F代研究表明，妊娠期間暴露于VPA與許多疾病明顯相關，其中在妊娠前3個月暴露于VPA是后代患自閉癥的高風險因素之一[13]。因此，VPA被廣泛用于建立自閉癥動物模型的誘導劑（在孕鼠妊娠12.5 d時對其進行VPA溶液的腹腔注射），與單一孤獨癥相關基因突變的模型動物相比，該模型表現更符合環(huán)境/表觀遺傳所引起的特發(fā)性孤獨癥行為缺陷[14]。在曠場實驗中，各模型組大鼠較空白組站立及理毛次數均明顯增加，說明模型大鼠對新環(huán)境探索興趣降低，且出現重復刻板行為，處于焦慮狀態(tài)，符合臨床中自閉癥患兒的行為特征，表明自閉癥模型建立成功。

突觸可塑性是神經可塑性的主要表現之一[15]。突觸可塑性取決于突觸膜上的特定蛋白質，Syn作為一種神經元特有的鈣結合蛋白：一方面能夠調節(jié)囊泡的內吞和胞吐，參與神經遞質的釋放；另一方面能夠調節(jié)突觸可塑性，包括突觸的發(fā)生、穩(wěn)定和傳遞[16-17]。PSD-95是與興奮性突觸后膜相鄰的致密細胞內結構，可以通過與膜和胞質蛋白結合，成為多蛋白復合物組裝的中心[18]。PSD-95在突觸后信號轉導系統(tǒng)的組織裝配中有不可替代的作用，與突觸穩(wěn)態(tài)和突觸可塑性密切相關[19]。研究表明，小鼠出現自閉癥相關表現可能與Syn表達下降或功能異常及神經元發(fā)育受損有關[20]。而PSD-95的異常表達是自閉癥等多種神經發(fā)育障礙疾病的原因之一[21]。免疫熒光檢測結果表明，模型組和空白組相比，海馬齒狀回Syn和PSD-95平均光密度值均降低；和同日齡的模型組相比，捏脊組的海馬齒狀回Syn和PSD-95平均光密度值均升高。結果提示捏脊干預可以上調Syn和PSD-95表達，提高突觸信息交換效率，維持神經可塑性，促進神經系統(tǒng)的正常發(fā)育。并且介入時間對Syn和PSD-95表達的影響較小，從3個時間點介入干預均可以顯著改善突觸功能。

BDNF對中樞神經系統(tǒng)有保護作用，主要在中樞神經系統(tǒng)中合成[22]。在中樞神經發(fā)育過程中，神經營養(yǎng)因子和生長因子的表達在時空上遵循特定規(guī)律，可以影響細胞分化、神經元發(fā)育和存活、神經發(fā)生、突觸發(fā)生和突觸可塑性，以保證神經系統(tǒng)正常發(fā)育和功能執(zhí)行[23]。CREB參與調控突觸和神經元相關基因表達，與神經可塑性關系密切，同時也是認知功能的重要靶點之一[24]。本實驗結果表明，模型組和空白組相比，海馬區(qū)BDNF、TrkB、CREB的蛋白表達均降低，表明自閉癥模型鼠海馬區(qū)神經細胞發(fā)育異常，神經遞質的合成與釋放受到抑制，影響突觸功能，海馬功能障礙；和PN23、PN37的模型組相比，其捏脊組的海馬區(qū)BDNF、TrkB、CREB的蛋白表達水平均升高，即捏脊干預可以改善神經元病理狀態(tài)，促進神經細胞正常生長發(fā)育，促進神經遞質的合成與釋放，提高突觸可塑性，有助于恢復海馬功能。PN23、PN37的捏脊與模型組間差異更為明顯，說明處于發(fā)育早期的神經系統(tǒng)有更強的神經可塑性，機體可以更好的響應外界刺激，此時介入捏脊療法對自閉癥大鼠海馬影響更顯著。

本研究從自閉癥的疾病特點和治療難點出發(fā)，探討早期介入捏脊療法對自閉癥的治療意義。鑒于大鼠PN21的腦發(fā)育程度和人類2～3歲的腦發(fā)育程度相似，PN42相當于人類的青春期[25]。因此，本實驗選取PN23、PN37、PN51作為介入治療的時間，對應人類從嬰幼兒時期到青春期的生長發(fā)育階段。本研究結果表明，捏脊對23、37、51日齡自閉癥模型大鼠都有一定治療效果，并且在與同日齡模型組大鼠的療效對照中，23日齡和37日齡自閉癥模型大鼠的療效優(yōu)于51日齡自閉癥模型大鼠，提示捏脊對發(fā)育早期的自閉癥模型大鼠治療效果較好，且這與不同發(fā)育階段神經系統(tǒng)的可塑性相關。同時，本課題驗證了捏脊療法能夠提高海馬區(qū)腦神經營養(yǎng)因子的表達，改善突觸功能，這提示捏脊療法或具備廣泛的腦功能效應，課題組后續(xù)將對前額葉、杏仁核、小腦等不同腦區(qū)進行深入研究，以進一步觀察捏脊對腦功能的影響。

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