硝普鈉誘導(dǎo)下川西獐牙菜的LC-MS非靶向代謝組分析

〔摘要〕 目的 研究基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)的川西獐牙菜在硝普鈉處理后的代謝響應(yīng)，為相關(guān)研究提供參考。方法 以1.0 mmol/L硝普鈉處理的川西獐牙菜為實(shí)驗(yàn)組，蒸餾水處理的川西獐牙菜為對(duì)照組，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的川西獐牙菜中差異代謝物進(jìn)行主成分分析（principal component analysis， PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）以及KEGG富集分析。結(jié)果 從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處理的川西獐牙菜中共檢測(cè)到523種代謝物，通過(guò)OPLS-DA模型的數(shù)據(jù)分析，根據(jù)VIP>1和P<0.05 條件共篩選出104 種差異顯著代謝物，其中有36 種代謝物上調(diào)、68 種代謝物下調(diào)，這些差異代謝物包括黃酮類、生物堿類、有機(jī)酸、氨基酸、糖類、維生素、香豆素類化合物及其他化合物。KEGG富集結(jié)果顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差異代謝物富集到121條途徑中。結(jié)論 推測(cè)川西獐牙菜的差異代謝物顯著富集的12條代謝途徑主要與抗氧化有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 川西獐牙菜；硝普鈉；非靶向代謝組學(xué)；次生代謝；差異代謝物；抗氧化

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.019

LC-MS based non-targeted metabolomics analysis of Swertia mussotii Franch induced by sodium nitroprusside

WANG Wenjing， WANG Yi， ZHANG Yamei， YANG Pu， LIU Wenying， HE Shuping， XIANG Beibei*

Tianjin University of Chinese Medicine， Tianjin 301617， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the metabolic response of Swertia mussotii Franch after sodium nitroprusside treatment based on non-targeted metabolomics technology， and to provide reference for related research. Methods The experimental group consisted of Swertia mussotii Franch treated with 1.0 mmol/L sodium nitroprusside， while the control group consisted of Swertia mussotii Franch treated with distilled water. Principal component analysis （PCA）， orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） and KEGG enrichment analysis were performed on the differential metabolites in the experimental group and the control group. Results A total of 523 metabolites were measured in Swertia mussotii Franch from the experimental group and the control group. Through the data analysis of the OPLS-DA model， 104 significantly different metabolites were screened according to VIP>1 and P<0.05 conditions. Among them， 36 metabolites were up-regulated and 68 metabolites were down-regulated. These differential metabolites include flavonoids， alkaloids， organic acids， amino acids， sugars， vitamins， coumarins compounds and other compounds. The results of KEGG enrichment analysis showed that the differential metabolites between the control group and the experimental group were enriched into 121 pathways. Conclusion It is speculated that 12 metabolic pathways of significantly enriched differential metabolites of Swertia mussotii Franch is mainly related to anti-oxidation.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Swertia mussotii Franch; sodium nitroprusside; non-targeted metabolomics; secondary metabolism; differential metabolites; anti-oxidation

川西獐牙菜（Swertia mussotii Franch）是龍膽科（Gentianaceae）獐牙菜屬（Swertia）的一年生草本，為傳統(tǒng)的八珍藏藥之一，也是藏茵陳的基原植物之一[1]。川西獐牙菜主要分布于我國(guó)西藏、云南（德欽）、青海西南部、四川西北部等?！毒е楸静荨酚涊d川西獐牙菜具有清肝、利尿、通筋骨、止血的作用，臨床上用于治療肝膽疾病，通常以干燥全草入藥，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。

硝普鈉（sodium nitroprusside， SNP）是一種外源一氧化氮（nitric oxide，NO）供體，NO是一種小型氣體生物活性信號(hào)分子，在介導(dǎo)植物生理過(guò)程和非生物脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[2]，如干旱、強(qiáng)光、鹽堿、寒熱和病原感染等[3]。適宜濃度的NO可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和提高植物的抗逆性[4]。通過(guò)SNP提供給植物的外源NO也可以提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性[5]，同時(shí)對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑產(chǎn)生影響[6]。外源施加SNP到植物體，能夠刺激植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，引起多種植物次生代謝產(chǎn)物的迅速積累。外源SNP可以顯著增加青錢(qián)柳中總多酚和多糖的含量[7]；SNP處理可以提高天仙子毛狀根中的東莨菪堿含量[8]。本研究應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析SNP處理和蒸餾水處理川西獐牙菜的代謝物變化情況，為進(jìn)一步研究SNP脅迫響應(yīng)的代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

川西獐牙菜種子來(lái)自青海師范大學(xué)，將種子置于滅菌的培養(yǎng)土中，在恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)，光照16 h，黑暗8 h，溫度25 ℃。選取長(zhǎng)勢(shì)相近的3月齡的土培苗，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用1.0 mmol/L SNP溶液隔天進(jìn)行噴灑20 mL、澆灌30 mL處理；以等量蒸餾水代替SNP溶液進(jìn)行噴灑、澆灌處理的川西獐牙菜植株作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組沒(méi)有相互影響。每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，川西獐牙菜植株培養(yǎng)處理10 d后收集全株新鮮樣品用于非靶向代謝組分析。

1.2 主要儀器

冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1850-R）；混勻儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：BE-96）；組織研磨器（浙江美壁儀器有限公司，型號(hào)：MB-96）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KW-100TDV）；濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：0.22 μm PTFE）；玻璃珠（美國(guó)西格瑪奧德里奇公司，型號(hào)：G8772-500G）；液相色譜儀、質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào)Vanquish、Q Exactive）。

1.3 主要試劑

乙腈、甲醇（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，批號(hào)： 75-05-8、67-56-1）；甲酸（東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：64-18-6）；甲酸銨（美國(guó)西格瑪奧德里奇公司，批號(hào)：540-69-2）；2-氯-L-苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）（阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：103616-89-3）；硝普鈉（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：13755-38-9）。

1.4 檢測(cè)樣本制備

將樣本精確稱取200 mg置于2 mL離心管中，加入600 μL含有2-氯-L-苯丙氨酸（4 ppm）的甲醇溶液，并進(jìn)行渦旋振蕩30 s。加入100 mg玻璃珠，并使用組織研磨器進(jìn)行60 Hz研磨90 s。在室溫下使用超聲波處理15 min。最后在13 400 ×g下，4 ℃離心10 min，取上清液并通過(guò)0.22 μm 濾膜過(guò)濾。過(guò)濾后的液體被收集到檢測(cè)瓶中，用于LC-MS檢測(cè)。質(zhì)量控制（quality control， QC）樣本是從提取好的待測(cè)樣本中取部分混合成的。

1.5 色譜和質(zhì)譜采集條件

液相色譜相關(guān)參數(shù)為色譜柱：ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流速：0.25 mL/min；柱溫：40 ℃；上樣體積：2 μL。正離子模式流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水；負(fù)離子模式流動(dòng)相為乙腈和 5 mmol/L甲酸銨水。從色譜柱上洗脫的小分子通過(guò)高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件：Thermo Q Exactive質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧離子源（ESI）。正離子噴霧電壓3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb，毛細(xì)管溫度325 ℃，一級(jí)離子掃描范圍m/z 81～1 000（分辨率70 000），二級(jí)裂解碰撞電壓30%（分辨率17 500）。

1.6 通路分析

采用MetaboAnalyst軟件包對(duì)篩選差異代謝分子進(jìn)行功能通路富集和拓?fù)鋵W(xué)分析。富集得到的通路采用KEGG Mapper可視化工具進(jìn)行差異代謝物與通路圖的瀏覽。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用RXCMS軟件包進(jìn)行峰檢測(cè)、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊處理。采用公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB、massbank、LipidMaps、mzcloud、KEGG及自建物質(zhì)庫(kù)進(jìn)行物質(zhì)的鑒定，參數(shù)設(shè)置為ppm<30?；赒C樣本的LOESS信號(hào)校正方法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)矯正，消除系統(tǒng)誤差。數(shù)據(jù)質(zhì)控中過(guò)濾掉QC樣本中RSD>30%的物質(zhì)。

采用R軟件包Ropls分別對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis， PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriiminate analysis， PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）降維分析。當(dāng)P＜0.05和VIP＞1時(shí)，認(rèn)為代謝物分子具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS圖譜

對(duì)SNP處理和蒸餾水處理的川西獐牙菜進(jìn)行LC-MS非靶向代謝組學(xué)分析，結(jié)果顯示總離子流色譜圖（total ion chromatogram， TIC）圖譜趨勢(shì)相似，證明重復(fù)性好，結(jié)果可靠。詳見(jiàn)圖1。

2.2 代謝組數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

在樣品進(jìn)行檢測(cè)前用QC評(píng)價(jià)質(zhì)譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，正負(fù)離子模式下QC樣本PCA得分圖詳見(jiàn)圖2，結(jié)果表明質(zhì)譜系統(tǒng)穩(wěn)定。為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，潛在的特征峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不能超過(guò)30%，不符合要求的特征峰應(yīng)予以刪除。在QC的基礎(chǔ)上，通常會(huì)進(jìn)行質(zhì)量保證（quality assurance，QA）來(lái)刪除QC樣本中重復(fù)性差的特征峰。QA結(jié)果詳見(jiàn)圖3。

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

使用R語(yǔ)言ropls包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到正負(fù)離子模式下的OPLS-DA模型和PLS-DA模型，詳見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別在正負(fù)離子模式下獨(dú)立聚類，進(jìn)一步說(shuō)明SNP脅迫使川西獐牙菜的代謝物產(chǎn)生了顯著變化，模型建立成功。

建立的OPLS-DA和PLS-DA模型均在正離子模式和負(fù)離模式下具有較高的驗(yàn)證參數(shù)，R2Y分別為0.999和0.996。這表明該模型能夠很好地解釋樣本數(shù)據(jù)的變異，并與真實(shí)情況擬合度高。同時(shí)，Q2值也較高，正離子模式Q2值分別為0.821和0.725，負(fù)離子模式Q2值分別為0.91和0.864，表明該模型具有良好的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力。詳見(jiàn)圖5。

2.4 差異代謝物鑒定與分析

用1.0 mmol/L SNP處理川西獐牙菜10 d后，收獲對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的川西獐牙菜進(jìn)行LC-MS非靶向代謝組學(xué)分析。非靶向代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)表明，在川西獐牙菜中檢測(cè)出大約523種代謝物，通過(guò)OPLS-DA模型的數(shù)據(jù)分析，根據(jù)VIP>1和P<0.05條件共篩選出104種差異顯著代謝物，其中有36種代謝物上維生素及其衍生物、糖類、香豆素類化合物和其他化合物。主要的上調(diào)差異代謝物相關(guān)信息見(jiàn)表1。

2.5 差異代謝物KEGG富集分析

利用KEGG通路富集分析SNP處理后川西獐牙菜代謝途徑的變化情況，根據(jù)圖6所示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組差異代謝物富集到121條途徑中，其中P<0.05的代謝途徑有12條：分別是苯丙烷生物合成、亞油酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基苯甲酸降解、谷胱甘肽代謝、生物素代謝、色氨酸代謝、磷脂酶D信號(hào)通路、β-丙氨酸代謝、維生素的消化和吸收通路。在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的川西獐牙菜代謝組中，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的川西獐牙菜中，L-谷氨酸、谷胱甘肽和亞精胺顯著富集到谷胱甘肽代謝途徑中，三者均為氨基酸及其衍生物，與對(duì)照組相比分別上調(diào)2.43倍、2.25倍和4.33倍。亞精胺和谷胱甘肽也參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑。此外，L-谷氨酸和木糖顯著富集到ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑，木糖與對(duì)照組相比上調(diào)1.63倍。

3 討論

NO是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要分子，為探究SNP處理后川西獐牙菜中的代謝物變化，對(duì)蒸餾水處理和SNP處理的川西獐牙菜進(jìn)行LC-MS非靶向代謝組分析，共檢測(cè)出104種差異顯著代謝物，其中有36種代謝物上調(diào)、68種代謝物下調(diào)，顯著差異代謝通路有12條。

SNP處理川西獐牙菜能夠影響谷胱甘肽的生物合成，谷胱甘肽生物合成的標(biāo)準(zhǔn)途徑是谷胱甘肽的主要來(lái)源之一[9]，在谷胱甘肽生物合成途徑中，篩選到谷胱甘肽合成的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸及谷胱甘肽含量顯著上調(diào)。SNP處理可能通過(guò)影響谷胱甘肽生物合成標(biāo)準(zhǔn)途徑影響谷胱甘肽的合成。有研究表明，SNP處理小麥幼苗[10]和苜蓿幼苗[1]谷胱甘肽還原酶基因上調(diào)。谷胱甘肽作為細(xì)胞內(nèi)最豐富的抗氧化劑，能夠保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)以及其他大分子物質(zhì)抵抗氧化損傷，清除過(guò)量的活性氧，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[12]。SNP處理川西獐牙菜后，可能通過(guò)谷胱甘肽生物合成標(biāo)準(zhǔn)途徑促進(jìn)谷胱甘肽生成，該結(jié)果與SNP處理香榧[13]谷胱甘肽含量升高的結(jié)果一致。

本研究在代謝組中發(fā)現(xiàn)亞精胺顯著上調(diào)，它同時(shí)參與了苯丙烷途徑、谷胱甘肽途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑和β-丙氨酸代謝途徑。亞精胺在植物中具有刺激生長(zhǎng)、抗氧化、抗腫瘤等作用[14]。據(jù)報(bào)道，亞精胺可能在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[15]，外源亞精胺可以提高苜蓿的抗氧化能力，維持細(xì)胞滲透平衡，從而緩解干旱對(duì)苜蓿幼苗的傷害[16]。SNP處理川西獐牙菜后亞精胺顯著上調(diào)，表明川西獐牙菜應(yīng)對(duì)外源脅迫的能力增加。

同時(shí)，SNP處理也影響ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)多肽、糖類、生物堿和谷胱甘肽等多種物質(zhì)，具有抵抗生物和非生物脅迫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病毒防御等多種功能[17]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。有研究表明，部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了巨大側(cè)耳對(duì)鎘離子脅迫的反應(yīng)[18]；野生大豆ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因響應(yīng)干旱脅迫[19]。SNP處理川西獐牙菜后ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白出現(xiàn)響應(yīng)表明SNP處理后川西獐牙菜的抗逆性增強(qiáng)，提高了川西獐牙菜對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，有研究表明SNP處理后，NO可以調(diào)節(jié)代謝物的表達(dá)保護(hù)植物免受脅迫[20-21]。

人們普遍認(rèn)為，植物為了應(yīng)對(duì)外源脅迫做出的防御反應(yīng)之一就是積累更多的次生代謝產(chǎn)物[22]。類黃酮化合物是天然存在的代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性[23]，類黃酮化合物具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化和抗糖尿病等多種藥理活性[24]。SNP處理川西獐牙菜代謝組學(xué)數(shù)據(jù)表明，在類黃酮生物合成途徑中葉黃素酚和木犀草素含量明顯增加。研究表明[25]，類黃酮物質(zhì)的積累可能是由于SNP處理川西獐牙菜后使內(nèi)源性一氧化氮含量升高，繼而刺激Ca2+和ROS信號(hào)來(lái)誘導(dǎo)參與類黃酮化合物基因的表達(dá)；這與SNP處理茶樹(shù)[26]后，使內(nèi)源性一氧化氮含量呈劑量依賴性增加，繼而使茶樹(shù)中類黃酮物質(zhì)積累觀點(diǎn)一致。呫噸酮類化合物構(gòu)成了川西獐牙菜抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[27]，但是其在川西獐牙菜中含量低且分離提取困難。SNP處理后，呫噸酮合成途徑中關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物2，3'，4，6-四羥基二苯甲酮含量升高了5.87倍。SNP處理后川西獐牙菜中類黃酮化合物的積累是川西獐牙菜應(yīng)對(duì)SNP處理的結(jié)果，這與前人的研究相符[28]，這也為我們提高川西獐牙菜中的中藥藥用成分提供了思路。

本研究通過(guò)測(cè)定1.0 mmol/L SNP處理下川西獐牙菜的代謝物變化情況，發(fā)現(xiàn)主要的差異代謝物主要集中在抗氧化系統(tǒng)上，類黃酮化合物也呈現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，這讓我們了解了SNP處理川西獐牙菜的代謝響應(yīng)，并且為川西獐牙菜的其他研究提供參考。

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