基于網絡藥理學探究黃芩苷抗骨肉瘤的作用機制及其與SP600125協(xié)同效應的研究

〔摘要〕 目的 本研究通過網絡藥理學和體外實驗探討黃芩苷治療骨肉瘤的潛在靶點和作用機制以及其與SP600125協(xié)同效應的研究。方法 運用PharmMapper、Swiss Target Prediction、 Genecards、OMIM和TTD數據庫檢索黃芩苷和骨肉瘤的潛在靶點。通過STRING平臺構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖和篩選核心靶點。使用R語言進行GO和KEGG富集分析。在GEO數據庫篩選出骨肉瘤中的差異表達基因。采用分子對接方法評估其與核心靶點的結合潛力。利用CCK-8細胞增殖實驗、細胞遷移實驗、細胞凋亡檢測、透射電子顯微鏡和Western blot驗證其作用機制。結果 通過數據庫確定46個黃芩苷治療骨肉瘤的潛在靶點。通過蛋白質-蛋白質相互作用網絡篩選出23個核心靶點。GO和KEGG富集分析表明，磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路和凋亡通路在黃芩苷治療骨肉瘤中起著關鍵作用。核心靶點與骨肉瘤差異性表達基因比對的結果發(fā)現(xiàn)，AKT1、熱休克蛋白90α （heat shock protein 90 alpha， HSP90AA1）、膜聯(lián)蛋白A5（annexin A5， ANXA5）、細胞周期檢驗點激酶1（checkpoint kinase 1， CHEK1）和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator， PLAU）在骨肉瘤組織中的表達高于正常骨組織。分子對接揭示黃芩苷與AKT1、HSP90AA1、ANXA5、CHEK1和PLAU靶點有較好的結合活性。體外細胞實驗表明，黃芩苷抑制HOS和143B骨肉瘤細胞的增殖和遷移，并促進細胞凋亡。此外，聯(lián)合使用c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）抑制劑SP600125進一步增強了黃芩苷的抗骨肉瘤作用。透射電子顯微鏡顯示，黃芩苷增加骨肉瘤細胞內自噬小體的數量，但與SP600125聯(lián)合時，黃芩苷誘導的自噬小體的增多會受到抑制。Western blot分析結果表明，黃芩苷抑制了AKT1蛋白的磷酸化和p-AKT/AKT表達水平，并與SP600125共處理可增強該抑制作用。另外，黃芩苷可誘導骨肉細胞內LC3-II和p62以及p-JNK/JNK的表達，但與SP600125聯(lián)用會顯著抑制此效應。結論 黃芩苷通過多靶點和多通路的相互作用發(fā)揮抗骨肉瘤效應。此外，SP600125協(xié)同增強了黃芩苷治療骨肉瘤的效應，為骨肉瘤的治療提供了研究依據和理論支持。

〔關鍵詞〕 骨肉瘤；黃芩苷；網絡藥理學； 蛋白激酶B1；自噬；SP600125

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.018

Mechanism of action of baicalin against osteosarcoma and its synergistic effects with SP600125 based on network pharmacology

LIAO Xinghua， PANG He， WU Hang， WEI Bo*

Orthopedic Center， Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524001， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the potential targets and mechanism of action of baicalin in treating osteosarcoma and its synergistic effects with SP600125 by network pharmacology and in vitro experimentation. Methods Using PharmMapper， Swiss Target Prediction， Genecards， OMIM， and TTD databases， potential targets for baicalin and osteosarcoma were retrieved. A protein-protein interaction network was constructed and core targets were screened through the STRING platform. GO and KEGG enrichment analyses were performed using R language. Differentially expressed genes in osteosarcoma were identified from the GEO database. Molecular docking was employed to assess the binding potential with the core targets. The mechanism of action was validated through CCK8 cell proliferation assays， cell migration assays， apoptosis detection， transmission electron microscopy， and Western blot. Results Through database analysis， 46 potential targets for baicalin in the treatment of osteosarcoma were identified. Among these， 23 core targets were screened via the protein-protein interaction network. GO and KEGG enrichment analyses indicated that the phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （PKB/AKT） pathway， the mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway， and the apoptosis pathway play pivotal roles in the treatment of osteosarcoma with baicalin. By comparing the core targets with differentially expressed genes in osteosarcoma， it was found that AKT1， heat shock protein 90 alpha （HSP90AA1）， annexin A5 （ANXA5）， checkpoint kinase 1 （CHK1）， and urokinase-type plasminogen activator （PLAU） were expressed at higher levels in osteosarcoma tissues than in normal bone tissues. Molecular docking revealed that baicalin exhibited good binding activity with AKT1， HSP90AA1， ANXA5， CHK1， and PLAU targets. In vitro cell experiments demonstrated that baicalin inhibited the proliferation and migration of HOS and 143B osteosarcoma cells while promoting cell apoptosis. Furthermore， the combination with the c-Jun N-terminal kinase （JNK） inhibitor SP600125 further enhanced the anti-osteosarcoma effects of baicalin. Transmission electron microscopy showed that baicalin increased the number of autophagosomes within osteosarcoma cells， but this increase was inhibited when combined with SP600125. Western blot analysis indicated that baicalin inhibited the phosphorylation of AKT1 protein and reduced the p-AKT/AKT expression level， and cotreatment with SP600125 enhanced this inhibitory effect. Additionally， baicalin induced the expression of LC3-II， p62， and p-JNK/JNK in osteosarcoma cells， but this induction was significantly suppressed when combined with SP600125. Conclusion Baicalin exerts anti-osteosarcoma effects through interaction with multiple targets and pathways. Furthermore， SP600125 synergistically enhances the therapeutic efficacy of baicalin in treating osteosarcoma， providing research evidence and theoretical support for the treatment of this disease.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 osteosarcoma; baicalin; network pharmacology; protein kinase B1; autophagy; SP600125

骨肉瘤是一種常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，主要發(fā)生四肢長骨干骺端，如股骨遠端和脛骨近端[1]。骨肉瘤以其高度的惡性特征而著稱，具有快速的生長速度和轉移能力，因此治療起來相當困難，導致患者的致殘率和死亡率較高[2]。據統(tǒng)計，骨肉瘤患者的綜合5年生存率僅為60%～70%，而一旦出現(xiàn)遠處轉移或復發(fā)的情況，這一比例會驟降至20%，其中轉移性病灶的存在是預后不良的主要因素[3]。在初次診斷時，已有80%的骨肉瘤患者體內存在可測量的轉移性或微轉移性病灶。因此，幾乎所有患者在接受手術切除治療后，還需要進行新輔助化學治療[4-5]。目前，大劑量甲氨蝶呤聯(lián)合阿霉素和順鉑的化療方案已成為治療骨肉瘤標準化學治療方案。然而，由于其毒副作用，在臨床應用受到一定的限制[6]。此外，對于已發(fā)生轉移、復發(fā)或不可切除的腫瘤患者通常會對當前化學治療方案產生耐藥[7]。因此，尋找有效的新型抗骨肉瘤藥物具有重要意義。

植物天然有效成分，因其多靶點和多途徑的協(xié)同作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移以及免疫調節(jié)等各個階段都展現(xiàn)出治療潛力，成為抗腫瘤先導化合物的重要來源[8]。黃芩苷（Baicalin，C21H18O11）是一種從黃芩植物中提取的黃酮類化合物，具備多種藥理活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗菌和保護心腦血管功能等[9]。在抗腫瘤方面，黃芩苷表現(xiàn)出顯著效果，并且對健康組織無顯示毒性[9-10]。SP600125（C14H8N2O）是一種具有強大滲透能力的小分子化合物，它通過ATP競爭機制與JNK結合，有效地抑制了JNK1、JNK2和JNK3的活性，從而干擾了細胞的生物過程[11]。體內外的研究揭示，該化合物對多種腫瘤表現(xiàn)顯著的治療潛力，特別是對膀胱癌、骨肉瘤和肺癌等，其能夠通過影響腫瘤細胞周期阻滯、抑制轉移行為、促進凋亡和抑制自噬，以及增強腫瘤細胞對藥物的敏感性來發(fā)揮作用[12]。

1 網絡藥理學方法

1.1 網絡藥理學數據庫及軟件

PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），PharmMapper數據庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/），OMIM數據庫（https：//omim.org/），TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/），DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），STRING數據庫（https：//string-db.org/），Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/），GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），Cytoscape 3.8.2軟件，R4.0.5軟件等。

1.2 黃芩苷-骨肉瘤共同靶點的篩選

通過PubChem數據庫獲取其化學結構信息。隨后，將此結構數據輸入到PharmMapper數據庫中，篩選出Norm Fit值大于0.6的潛在靶點。同時，利用Swiss Target Prediction數據庫進一步預測黃芩苷可能作用的靶點。通過UniProt數據庫校正所獲得靶點的名稱。以“Osteosarcoma”作為關鍵詞在Gene？鄄Cards、OMIM和TTD數據庫中搜索與骨肉瘤相關的靶點。收集這些疾病相關靶點的信息后，使用Venny 2.1在線工具繪制韋恩圖，找出藥物靶點與疾病靶點之間的交集。最終，采用Cytoscape軟件構建一個“疾病-靶點-成分”網絡圖。

1.3 靶點相互作用網絡構建及核心靶點分析

將篩選出的共同靶點輸入STRING數據庫中檢索共同靶點之間的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡關系。設置篩選條件為“Homo sapiens”以確保蛋白種類Human，并將相互作用閾值設定為0.4，以檢索置信度較高的PPI網絡數據。隨后，將獲得的PPI數據導入Cytoscape軟件，繪制出詳細的PPI網絡圖。接著，利用Cytoscape中的NetworkAnalyzer工具對PPI網絡數據進行拓撲分析?；贒egree值參數進行排序，選取Degree值高于平均值的基因作為核心靶點。最后，使用R軟件對選定的核心靶點進行數據可視化。

1.4 GO和KEGG富集分析

利用R軟件結合Bioconductor生物信息學軟件包，對篩選出的潛在靶點進行了基因本體論（gene ontology， GO）和京都基因與基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）的富集分析，其中設定P<0.05和Q<0.05作為篩選條件。挑選各部分GO富集分析P值排名前10的條目，通過柱狀圖形式呈現(xiàn)。富集分析基于P值排序，選出KEG富集分析的前30個條目，并采用氣泡圖的方式展現(xiàn)了涉及的信號傳導通路。

1.5 核心靶點的差異表達基因分析

從GEO數據庫下載了GSE99671數據集，該數據集包括18例骨肉瘤組織和18例正常骨組織的序列文件。接著，提取了骨肉瘤患者的基因表達矩陣，并對數據進行了歸一化處理，將原始的Counts數據轉換成TPM（transcripts per million），以實現(xiàn)表達量的標準化。然后利用平臺注釋文件對基因名進行注釋。結合PPI分析確定的核心靶點與歸一化后的基因表達數據，篩選出在正常樣本和骨肉瘤樣本之間表現(xiàn)出顯著差異的差異表達基因。

1.6 分子對接

黃芩苷的結構來自PubChem數據庫，然后導入Schr dinger軟件經過加氫、結構優(yōu)化和能量最小化保存后作為分子對接的配體。蛋白結構AKT1（PDB

ID：7NH5）、HSP90AA1（PDB ID：3O0I）、ANXA5（PDB ID：2XO3）、CHEK1（PDB ID：2HXL）和PLAU（PDB ID：1C5Y）來自RCSB數據庫（https：//www.rcsb.org/）。蛋白結構在Schr？觟dinger Maestro軟件進行處理，使用Protein Preparation Wizard模塊去除蛋白結晶水，補充缺失的氫原子，修復缺失的肽鍵和肽段信息，進行能量最小化和幾何結構的優(yōu)化。在Glide模塊中進行篩選時，根據蛋白結構的小分子配體確定對接位點，位點盒子大小設為15 ？魡×15 ？魡×15 ？魡。最后通過Standard Precision Glide Docking方法進行分子對接和篩選。對接后的復合物使用Pymol2.1軟件進行可視化，分析黃芩苷和靶點蛋白的作用模式。

2 材料

2.1 主要藥品和試劑

黃芩苷（HPLC≥98%；上海源葉生物科技有限公司，批號：B20570）；SP600125（HPLC≥99.7%； Medchem Express公司，批號：HY-12041）；抗體p-AKT1（批號：9018）、AKT1（批號：2938）、JNK（批號：9252）、p-JNK（批號：4668）、Bax（批號：2772）、Bcl-2（批號：4223）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（批號：7074）和抗小鼠IgG（批號：7076）均購買于Cell Signaling Technology公司；抗體p-AKT（批號： ab192623）、AKT（批號：ab179463）、LC3（批號：ab48394）和p62（批號：ab56416）抗體購買于Abcam公司；抗體GAPDH（批號：21612）購買于Signalway Antibody公司；1%青霉素-鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1400）；10%胎牛血清FBS（批號：A5669401）、MEM基礎培養(yǎng)基（批號：11095080）均購買于Thermo Fisher Scientific公司；ECL顯色劑（Zeta Life公司，批號：310212）；0.1%結晶紫（批號：C0121）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062M）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010S）、5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號：P0015）均購自碧云天生物技術研究所。

2.2 主要儀器

微孔板讀取（型號：MK3，Thermo Fisher Scientific公司）；流式細胞儀（型號：FACSCelesta，BD Biosciences公司）；熒光成像系統(tǒng)（型號：Tanon-5200Multi，Tanon公司）；透射電子顯微鏡（型號：JEM-1400，JEOL公司）；超薄切片機（型號：Leica EM UC7，Leica Microsystems公司）。

3 體外細胞實驗

3.1 細胞培養(yǎng)

將143B和HOS骨肉瘤細胞以10×105的密度接種在10 cm×10 cm的細胞培養(yǎng)瓶中，使用添加了1%青霉素-鏈霉素混合液和10%胎牛血清FBS的MEM基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。細胞被放置在恒溫37 ℃和5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。定期檢查細胞的生長狀態(tài)，并適時更換培養(yǎng)基。當細胞生長接近密集單層，即達到80%～90%的融合度時，便進行傳代操作。

3.2 CCK-8檢測細胞增殖實驗

將骨肉瘤細胞懸液以每孔3.0×103個細胞的密度接種于96孔板中，并在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。之后，細胞被不同濃度（0、20、40、80 μmol·L-1）的黃芩苷或不同濃度（0、10、20、40 μmol·L-1）SP600125處理48 h。若需聯(lián)合使用20 μmol·L-1濃度的SP600125，則在黃芩苷干預前對細胞進行4 h的預處理。為了評估細胞活力，向每個孔中加入10 μL

CCK-8檢測溶液，在37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)孵育2～4 h，測定450 nm的波長的吸光度值。

3.3 細胞遷移實驗

為了評估黃芩苷或SP600125對骨肉瘤細胞遷移能力的影響，使用Transwell小室進行實驗。首先，將骨肉瘤細胞用MEM培養(yǎng)基重新懸浮，并取100 μL的細胞懸液（含2.0×104個細胞）加入Transwell小室的上室中。在下室中加入500 μL含有10% FBS的MEM培養(yǎng)基，然后放入恒溫37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，輕輕用棉簽擦去上室內未發(fā)生遷移的細胞。對于遷移至膜內側的細胞，使用甲醇固定15 min，隨后以0.1%結晶紫染色10 min。PBS徹底清洗掉多余的染料。最后，在放大倍數400×顯微鏡視野下觀察染色后的細胞，并在隨機選取的5個視野拍照。所得圖片可通過Image J軟件進行定量分析

3.4 流式細胞凋亡檢測

為準確評估骨肉瘤細胞的凋亡比例，采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑檢測。骨肉瘤細胞先經80 μmol·L-1黃芩苷單獨處理或與20 μmol·L-1 SP600125聯(lián)合處理48 h。處理后，用5 μL Annexin

V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液對細胞進行染色，再加入195 μL Annexin V-FITC結合緩沖液重懸細胞。隨后，在室溫下將細胞避光孵育30 min以促進染料結合。孵育結束后，采用流式細胞儀對細胞樣本進行檢測，并通過BD FACSDiva軟件來定量染色后的凋亡細胞比例。

3.5 透射電子顯微鏡觀察及樣品制備

前固定：骨肉瘤細胞在4 ℃下用3%戊二醛固定4 h，隨后用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液換洗3次，每2 h一次。后固定：樣本在4 ℃下用1%鋨酸浸泡2 h，然后用0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液沖洗2次，15 min/次。染色：室溫下用飽和醋酸鈾染料染色2 h。脫水與滲透：樣本依次在4 ℃的50%、70%乙醇和室溫的80%、90%乙醇中脫水，然后在室溫下用100%乙醇處理2次，接著用丙酮滲透2次，15 min/次。最后，樣本在室溫下用完全包埋液（Eponate12環(huán)氧樹脂）與丙酮的混合液（比例1∶1）滲透3 h，然后比例1∶2滲透3 h，最后用完全包埋液滲透過夜。包埋：樣本在40 ℃下用完全包埋液浸泡12 h，然后在60 ℃條件移至包埋板并溫育48 h。超薄切片：使用超薄切片機制作90 nm厚的切片。電鏡觀察：使用透射電子顯微鏡在80 kV的工作電壓下觀察樣本，并用DigitalMicrograph軟件進行圖像采集。

3.6 Western bolt檢測

收集經黃芩苷或與SP600125聯(lián)合干預后的骨肉瘤細胞沉淀，在4 ℃條件下加入適量預混有PMSF（PMSF∶RIPA=1∶100）的RIPA裂解液。使用細胞刮刀徹底將細胞碎片收集到EP管中，并在冰上持續(xù)裂解30 min。隨后進行30 s的超聲處理，以促進細胞充分裂解。完成裂解后，樣本在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心（離心半徑9 cm）15 min，然后將上層清澈的蛋白溶液轉移到新的EP管中。根據BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書配制BCA定量標準曲線，并測定及調整各組蛋白樣品濃度一致。向每組蛋白樣品加入適量的5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，混合均勻后在99 ℃下煮沸10 min使蛋白變性。使用配制好的10%或12% SDS-PAGE凝膠，每個樣本孔道加載20 μg蛋白質，在100 V電壓下電泳60 min進行分離。之后，在250 mA恒流條件下，將凝膠上的蛋白轉印2.5 h至0.2 μm孔徑的PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉60 min。根據Marker位置和目標蛋白，裁剪相應的膜片，并加入一抗p-AKT1、AKT1、JNK、p-JNK、p-AKT、AKT、Bax、Bcl-2、LC3、p62和GAPDH（均按1∶1 000稀釋）在4 ℃冰箱中孵育12 h。然后與相應的二抗（均按1∶5 000稀釋）在室溫避光孵育1 h。最后，使用ECL顯色劑結合熒光成像系統(tǒng)曝光膜上的蛋白條帶。利用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，并以GAPDH為內參計算目標蛋白的表達水平。

3.7 統(tǒng)計學分析

所有數據均表示為3次獨立實驗的“ｘ±s”，并使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖。對于兩組間的比較，采用獨立樣本t檢驗。當涉及3組及以上之間的統(tǒng)計分析時，則采用單因素方差分析（ANOVA）配合Tukey事后多重比較檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 黃芩苷治療骨肉瘤的潛在靶點

在PharmMapper和Swiss Target Prediction數據庫中檢索后，確定了202個黃芩苷潛在作用靶點。同時，通過Genecards、OMIM和TTD數據庫的篩選，發(fā)現(xiàn)了1 258個與骨肉瘤疾病相關的潛在靶點。對兩組數據進行交集分析，揭示了46個共同靶點（圖1A）。進一步整合這些共同靶點信息，繪制了“疾病-靶點-成分”交互網絡圖（圖1B）。

4.2 黃芩苷治療骨肉核心靶點的篩選

通過STRING數據庫檢索黃芩苷治療骨肉瘤的潛在作用數據，將數據整合并構建得到46個節(jié)點、317個邊緣和3個同心圓的PPI網絡圖（圖2A）。其中，節(jié)點的大小、顏色深淺變化根據Degree 值大小變化。PPI數據進行拓撲分析，篩取Degree值大于平均分（23個）的基因作為核心靶點（圖2B）。在核心靶基因中，AKT1（36邊）、CASP3（33邊）、EGFR（30邊）、HSP90AA1（30邊）、ESR1（29邊）和TNF（29邊）具有較高的連接節(jié)點度。

4.3 GO和KEGG富集分析

對46個共同靶點進行GO富集分析，得到涉及生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）的三大類別信息。GO分析的結果共富集到1 569條與BP相關的條目、29條與CC相關的條目以及109條與MF相關的過程。結果根據P值選取每部分排前10位的條目繪制柱狀圖（圖3A）。KEGG富集分析篩選出111條黃芩苷治療骨肉瘤相關的潛在通路，選取P值前30的通路繪制KEGG富集的氣泡圖，其中富含與癌癥相關信號通路，如PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路以及細胞凋亡等（圖3B）。

4.4 核心靶點與骨肉瘤差異性表達基因的比對

PPI的核心靶點（23個）與CEO數據庫的骨肉瘤基因進行差異性表達分析。結果顯示AKT1（P<0.01）、HSP90AA1（P<0.001）、ANXA5（P<0.01）、CHEK1（P<0.05）和PLAU（P<0.05）在骨肉瘤組織中的表達高于正常骨組織（圖4）。然而，其他核心靶點基因，包括EGFR、CASP3、ESR1、TNF、SRC、PGR、PPARG、AR、IG？鄄F1R、MAPK14、MAPK8、CCNA2、CDK2、KDR、CDK6、IL2、MET和MMP3，在骨肉瘤和正常骨組織之間的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

4.5 核心靶點的分子對接分析

骨肉瘤差異表達的核心靶點AKT1、HSP90AA1、ANXA5、CHEK1和PLAU與黃芩苷進行分子對接，通過結合能和氫鍵相互作用來評價結合強度。根據結合模式清晰地顯示出黃芩苷結構（圖5A）與靶蛋白活性位點相互作用的氨基酸殘基。結合情況如下：AKT1（結合能：-10.94 kcal/mol）活性位點的GLN-79，ASN-54和ARG-273氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5B）；HSP90AA1（結合能：-9.36 kcal/mol）活性位點的ASN-106、LYS-112、ASN-52和LYS-58氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5C）；ANXA5 （結合能：-8.62 kcal/mol）活性位點的SER-246、ILE-244、GLN-3和VAL-4氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5D）；CHEK1（結合能：-9.11 kcal/mol）活性位點的GLU-17、GLU-134、ASN-135、CYS-87和GLU-91氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5E）；PLAU（結合能：-8.64 kcal/mol）活性位點的ASP-97、HIS-99和SER-195氨基酸與黃芩苷形成氫鍵相互作用（圖5F）。

4.6 黃芩苷對骨肉瘤細胞增殖及核心靶點AKT1的影響

CCK-8細胞增殖結果顯示，在0～80 μmol·L-1的黃芩苷濃度范圍內，143B和HOS骨肉瘤細胞活力均明顯降低（P<0.01）（圖6A）。鑒于黃芩苷與核心靶點AKT1具有很好的結合活性，并且AKT1在PPI網絡中的Degree值最高，進一步通過Western blot實驗檢測了黃芩苷對骨肉瘤細胞內AKT1蛋白水平變化的影響。與未處理的對照組相比，經黃芩苷處理后的143B細胞中AKT1蛋白的磷酸化水平顯示出濃度依賴性的抑制效果（P<0.01）（圖6B）。

4.7 SP600125增強黃芩苷抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲以及促進凋亡的作用

在研究SP600125單獨或與黃芩苷聯(lián)合對骨肉瘤細胞增殖、遷移和凋亡影響的過程中，CCK-8細胞增殖實驗結果揭示，相較于單獨使用黃芩苷，其與SP600125的聯(lián)合應用能顯著協(xié)同抑制143B和HOS兩種骨肉瘤細胞系的增殖能力（P<0.05）。相比之下，SP600126僅在40 μmol·L-1濃度下才顯示出對骨肉瘤細胞的抑制效應（P<0.01）（圖7A）。在細胞遷移實驗中，與空白組相比，單獨應用黃芩苷可以增強對細胞遷移的抑制率（P<0.05）。而當SP600125與黃芩苷共處理時，這種聯(lián)合作用可以進一步增強對細胞遷移能力的抑制效果（P<0.05）（圖7B）。通過Annexin V-FITC/PI雙染法評估細胞凋亡情況，流式細胞凋亡結果顯示，與未處理的空白組相比，單獨應用黃芩苷能增加細胞的凋亡率（P<0.01）。同時，SP600125與黃芩苷共處理時，可進一步增強黃芩苷誘導的細胞凋亡效果（P<0.05）（圖7C）。此外，與空白組相比，黃芩苷組的凋亡相關Bcl-2蛋白表達量顯著下降（P<0.01），而Bax蛋白表達量則顯著增加（P<0.001）。當與SP600125聯(lián)合處理時，相較于單獨使用黃芩苷組，Bcl-2蛋白的表達量進一步降低（P<0.001），同時Bax蛋白的表達量也進一步增加（P<0.05）。這一結果進一步驗證了SP600125和黃芩苷在促進細胞凋亡方面的協(xié)同增效作用（圖7D）。

4.8 SP600125通過抑制AKT通路和調節(jié)自噬過程增強黃芩苷的抗骨肉瘤作用

KEGG富集分析的結果揭示了黃芩苷抗骨肉瘤作用與PI3K/AKT和MAPK信號通路的潛在關聯(lián)。因此，本研究進一步檢測了PI3K/AKT信號通路中AKT蛋白的表達變化。結果顯示，黃芩苷的處理顯著降低p-AKT/AKT的表達水平（P<0.001），并且聯(lián)合SP600125共處理后，AKT磷酸化水平得到進一步抑制（P<0.05）（圖8A）。為了進一步探討JNK抑制劑SP600125如何增強黃芩苷誘導的細胞死亡效應。在處理143B細胞時，應用了80 μmol·L-1的黃芩苷或與SP600125的聯(lián)合處理。透射電子顯微鏡結果顯示，經黃芩苷處理的骨肉瘤細胞內自噬小體的數量顯著增加。然而，聯(lián)合SP600125時，由黃芩苷誘導的自噬小體的增多被明顯減弱（圖8B）。Western

blot結果顯示，黃芩苷處理組的JNK蛋白被磷酸化激活。此外，自噬相關蛋白LC3-II與LC3-I的比值以及p62蛋白的表達均因黃芩苷的處理而顯著增加（P<0.01）。然而，當使用SP600125抑制JNK時，黃芩苷所誘導的143B細胞中p62和LC3-II表達的激活被逆轉（P<0.05）（圖8C）。

5 討論

本研究通過網絡藥理學共篩出46個共同靶點，其中，AKT1、CASP3、EGFR、HSP90AA1、ESR1和TNF等23個核心靶點與黃芩苷治療骨肉瘤的機制密切相關。KEGG富集顯示，PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路以及細胞凋亡等參與黃芩苷抗骨肉瘤的機制。核心靶點AKT1、HSP90AA1、ANXA5、CHEK1和PLAU在骨肉瘤組織中的表達顯著高于正常骨組織。分子對接顯示，黃芩苷與這些靶點都有較強的結合潛力。其中，AKT1與黃芩苷的結合具有很高的適配性，且在PPI網絡中占據核心位置。另外，Western

blot結果顯示，黃芩苷能降低143B細胞內AKT1蛋白的磷酸化水平，這為AKT1作為核心靶點提供了初步的驗證。

骨肉瘤細胞的轉移與預后不佳密切相關，是導致擴散、耐藥及病情惡化的病理基礎[13]。細胞凋亡機制是細胞受到特定信號的刺激，發(fā)生自主程序性細胞死亡，涉及染色質固縮、DNA斷裂和凋亡小體形成的過程[14]。Bax與Bcl-2之間的比例變化能夠影響線粒體膜電位，進而觸發(fā)細胞色素C的釋放，從而誘導Caspase系列反應，最終引發(fā)細胞凋亡[15]。目前，SP600125能協(xié)同增強抗腫瘤藥物的治療效果已在多種癌癥模型中得到證實，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用來減弱腫瘤的耐藥性[16]。本研究通過CCK-8測定和細胞遷移實驗揭示，黃芩苷顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移能力。流式細胞凋亡檢測和Western

bolt揭示了黃芩苷能明顯誘導的骨肉瘤細胞的凋亡比例增高。此外，當SP600125與黃芩苷聯(lián)合應用時，結果顯示出SP600125能夠協(xié)同增強黃芩苷抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移的效果，并促進細胞凋亡。相比之下，單獨使用JNK抑制劑SP600125對骨肉瘤細胞的影響卻十分有限。

PI3K/AKT通路在骨肉瘤中被固定激活，并參與調控骨肉瘤細胞的轉移、凋亡和自噬等過程[17]。此外，抑制該通路及其相關上下游分子的活性已成為骨肉瘤治療的重要策略[18]。JNK是調控癌細胞凋亡和自噬的重要介質，它的激活在骨肉瘤細胞的生長、侵襲、凋亡和自噬等機制發(fā)揮重要作用[19-20]。研究表明，這兩種信號通路存在相互干擾的現(xiàn)象，并組成一個復雜的調控網絡[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，SP600125通過增強柴胡皂苷D對AKT通路的阻斷作用，抑制骨肉瘤細胞的惡性特性，并激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9依賴的細胞凋亡[22]。自噬的激活通常與骨肉瘤細胞的增殖、轉移、凋亡、化療耐藥和免疫治療有關[23]。自噬與凋亡之間的相互作用構成了一個復雜且精確的平衡系統(tǒng)，其中一種過程的激活或抑制可以顯著影響另一種過程的活性。此相互作用涉及眾多信號通路及調節(jié)蛋白，包括Caspase-8、P53、Bcl-2和JNK等[24]。在自噬過程中，細胞質內LC3被水解成LC3-Ⅰ，與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ連接于自噬小體膜中[25]。此外，p62的表達與腫瘤形成、癌癥促進和化療耐藥有關，是自噬的適配體[26]的LC3-Ⅱ和p62-Nrf2表達，活化凋亡相關蛋白的表達，觸發(fā)自噬向凋亡的轉換，增強C-2抗膀胱癌的敏感性[27]。此外，SP600125通過抑制JNK調控的自噬增強非小細胞肺癌細胞對mTORC1/2抑制劑的敏感性[28]。同時，在另一項研究中發(fā)現(xiàn)p62被pKAL以ROS依賴的方式顯著上調，而SP600125抑制JNK介導p62的下調增強pKAL誘導的結直腸癌細胞凋亡[29]。本研究結果顯示，黃芩苷和SP600125的聯(lián)合應用能夠有效抑制AKT的磷酸化，表明AKT通路參與其抗骨肉瘤的作用機制。透射電子顯微鏡觀察顯示，黃芩苷的處理能顯著增加骨肉瘤細胞中自噬小體的數量。然而，當聯(lián)用SP600125時，黃芩苷所誘導的自噬小體的增加受到抑制。另外，黃芩苷能增加自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和p62的表達水平，以及促進JNK的磷酸化，而這種現(xiàn)象被JNK抑制劑SP600125所逆轉。此外，SP600125的共處理增強了黃芩苷所誘導的細胞凋亡效應，這表明SP600125通過調節(jié)自噬過程，與黃芩苷協(xié)同發(fā)揮抗骨肉瘤的治療效能。

綜上所述，本研究運用了網絡藥理學和分子對接系統(tǒng)性分析黃芩苷抗骨肉瘤的潛在分子靶點和通路機制。在體外實驗中，黃芩苷顯著地抑制了骨肉瘤細胞的增殖與遷移，并有效地誘導骨肉瘤細胞凋亡。當與JNK抑制劑SP600125聯(lián)合使用時，這一組合療法通過降低AKT的磷酸化水平和調節(jié)自噬過程，進一步強化了對骨肉瘤治療的協(xié)同效應。黃芩苷展現(xiàn)出針對多個靶點及其相應信號通路的顯著作用，顯示了其作為一種新型抗骨肉瘤藥物的潛力。特別是與SP600125聯(lián)合使用的策略，這為骨肉瘤的治療提供了新的方向。

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