柴胡皂苷D通過(guò)NLRP3介導(dǎo)細(xì)胞焦亡抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

〔摘要〕 目的 研究柴胡皂苷D通過(guò)NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。方法 培養(yǎng)未分化甲狀腺癌細(xì)胞株HTh83和KMH2，不同濃度柴胡皂苷D（1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 μmol/L）作用48 h后檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）；細(xì)胞分為對(duì)照組（0 μmol/L柴胡皂苷D）、低濃度組（2.2 μmol/L柴胡皂苷D）、中濃度組（11 μmol/L柴胡皂苷D）、高濃度組（22 μmol/L柴胡皂苷D）、si-NC組（轉(zhuǎn)染NC siRNA）、高濃度+si-NC組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯(lián)合轉(zhuǎn)染NC siRNA）、高濃度+si-NLRP3組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯(lián)合轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA），處理48 h后檢測(cè)克隆形成數(shù)目，NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD氨基末端片段（GSDMD N terminal fragment， GSDMD-N）的表達(dá)水平及培養(yǎng)基中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18， IL-18）的水平。結(jié)果 柴胡皂苷D以濃度依賴的方式降低HTh83細(xì)胞和KMH2細(xì)胞的存活率（P<0.05）；低濃度組、中濃度組、高濃度組的細(xì)胞克隆數(shù)目低于對(duì)照組（P<0.05），NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達(dá)水平及培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18的水平高于對(duì)照組（P<0.05）；高濃度+si-NLRP3組細(xì)胞的存活率及克隆數(shù)目高于高濃度+si-NC組（P<0.05），NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達(dá)水平及培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18的水平低于高濃度+si-NC組（P<0.05）。結(jié)論 柴胡皂苷D能顯著抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與激活NLRP3，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 未分化甲狀腺癌；柴胡皂苷D；增殖；NOD樣受體蛋白3；焦亡

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.011

Mechanism of saikosaponin D in inhibiting the proliferation of anaplastic thyroid cancer cells via NLRP3-mediated pyroptosis

GAO Fang1， LI Jun1， GUO Yanxia2， LI Hong3*

1. Department of Pharmacy， Tangshan Fengnan District Hospital of Chinese Medicine， Tangshan， Hebei 063300， China;

2. Department of Pharmacy Preparation， Tangshan Fengnan District Hospital of Chinese Medicine， Tangshan， Hebei 063300， China; 3. Department of Pharmacy， Tangshan Hospital of Chinese Medicine， Tangshan， Hebei 063300， China.

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the effects and mechanism of saikosaponin D in inhibiting the proliferation of anaplastic thyroid cancer cells via NOD-like receptor protein 3 （NLRP3）-mediated pyroptosis. Methods Anaplastic thyroid cancer cell lines HTh83 and KMH2 were cultured and treated with various concentrations of saikosaponin D （1， 4， 7， 10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37 μmol/L） for 48 h. Cell survival rate was subsequently measured and half-maximal inhibitory concentration （IC50） was calculated. The cells were divided into control group （0 μmol/L saikosaponin D）， low concentration group （2.2 μmol/L saikosaponin D）， medium concentration group （11 μmol/L saikosaponin D）， high concentration group （22 μmol/L saikosaponin D） and si-NC group （transfected with NC） siRNA）， high concentration+si-NC group （22 μmol/L saikosaponin D co-transfected with NC siRNA）， and high concentration+si-NLRP3 group （22 μmol/L saikosaponin D co-transfected with NLRP3 siRNA）. After 48 h of treatment， the colony formation was quantified， the expression levels of NLRP3， cleaved caspase-1， and GSDMD N terminal fragment （GSDMD-N） as well as the levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-18 （IL-18） in the medium were measured. Results Saikosaponin D reduced the survival rate of HTh83 cells and KMH2 cells in a concentration-dependent manner. The number of cell clones in low-， medium-， and high-concentration groups was lower than that in the control group （P<0.05）， while the expression levels of NLRP3， cleaved caspase-1， and GSDMD-N， and the levels of IL-1β and IL-18 in the medium were higher than those in the control group （P<0.05）. The survival rate and clone number in high concentration +si-NC group were higher than those in high concentration+si-NC group， while the expression levels of NLRP3， cleaved caspase-1， and GSDMD-N， and the levels of IL-1β and IL-18 in the medium were lower than those in high concentration+si-NC group （P<0.05）. Conclusion Saikosaponin D significantly inhibits the proliferation of anaplastic thyroid cancer cells， and its mechanism is probably related to the activation of NLRP3 and the mediation of pyroptosis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 anaplastic thyroid cancer; saikosaponin D; proliferation; Nod-like receptor protein 3; pyroptosis

未分化甲狀腺癌是一種具有極高惡性程度的甲狀腺惡性腫瘤，患者的臨床預(yù)后差、生存期往往不超過(guò)半年[1-2]。雖然未分化甲狀腺癌的分子機(jī)制尚不完全明確，但相關(guān)研究資料認(rèn)為，細(xì)胞焦亡是調(diào)控未分化甲狀腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的重要靶點(diǎn)[3]。細(xì)胞焦亡過(guò)程中伴隨著大量炎癥物質(zhì)的釋放，因而該過(guò)程又稱炎癥性死亡。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是調(diào)控焦亡的重要受體蛋白，NLRP3通過(guò)介導(dǎo)Gasdermin D（GSDMD）氨基末端的切割、形成GSDMD氨基末端片段（GSDMD N terminal，GSDMD-N）的方式執(zhí)行細(xì)胞焦亡[4-6]。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，甲狀腺癌屬“石癭”范疇。柴胡疏肝散合二陳湯具有活血止痛、行氣解郁的功效，臨床研究證實(shí)該方劑對(duì)甲狀腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)具有抑制作用[7]。柴胡疏肝散合二陳湯中柴胡的活性成分柴胡皂苷D具有抗癌活性，可通過(guò)激活NLRP3/GSDMD-N介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[8]，但柴胡皂苷D對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖及焦亡的調(diào)控作用尚不明確。基于此，本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)柴胡皂苷D通過(guò)NRLP3介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制展開(kāi)探索。

1 材料與方法

1.1 材料

未分化甲狀腺癌細(xì)胞株HTh83和KMH2、CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：CL-0806、CL-0623、P-CA-001，武漢普諾賽生命科技有限公司）；柴胡皂苷D（批號(hào)：B20150，上海源葉生物科技有限公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、結(jié)晶紫（批號(hào)：D2650、Y0000418，美國(guó)Sigma公司）；NLRP3一抗、裂解型Caspase-1一抗、GSDMD-N一抗（批號(hào)：ab263899、ab286125、ab210070，美國(guó)Abcam公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號(hào)：PK20001，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Galaxy 170S型，Eppendorf公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ReadMax 1500型，上海閃譜生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（ECLIPSE Ts2型，日本Nikon公司）；凝膠成像系統(tǒng)（1600R型，上海天能生命科學(xué)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 用DMSO溶解柴胡皂苷D，制備成濃度為1 mmol/L的藥物母液，放置在－20 ℃避光保存。進(jìn)行細(xì)胞分組處理時(shí)，用培養(yǎng)基稀釋至終濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HTh83和KMH2細(xì)胞均在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃及5%CO2。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTh83和KMH2細(xì)胞，按照2 000個(gè)/孔接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁培養(yǎng)24 h后更換為含有不同濃度柴胡皂苷D（1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 μmol/L[9]）的培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組，并于每個(gè)濃度重復(fù)5次。培養(yǎng)48 h后加入CCK-8檢測(cè)液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光值（A）。細(xì)胞存活率=（A處理組－A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算柴胡皂苷D的半數(shù)抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù)目 消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTh83和KMH2細(xì)胞，按照1 000個(gè)/孔接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁培養(yǎng)24 h后按照對(duì)照組（0 μmol/L柴胡皂苷D）、低濃度組（2.2 μmol/L柴胡皂苷D）、中濃度組（11 μmol/L 柴胡皂苷D）、高濃度組（22 μmol/L 柴胡皂苷D）、si-NC組（轉(zhuǎn)染NC siRNA）、高濃度+si-NC組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯(lián)合轉(zhuǎn)染NC siRNA）、高濃度+si-NLRP3組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯(lián)合轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA）處理。每2天更換1次培養(yǎng)液，第14天時(shí)棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗3次后用4%多聚甲醛固定20 min，再次清洗后用0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min，洗凈結(jié)晶紫并拍照，計(jì)算克隆數(shù)目。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTh83和KMH2細(xì)胞，按照5×105個(gè)/孔接種在12孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁培養(yǎng)24 h后按照對(duì)照組（0 μmol/L柴胡皂苷D）、低濃度組（2.2 μmol/L柴胡皂苷D）、中濃度組（11 μmol/L柴胡皂苷D）、高濃度組（22 μmol/L柴胡皂苷D）、si-NC組（轉(zhuǎn)染NC siRNA）、高濃度+si-NC組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯(lián)合轉(zhuǎn)染NC siRNA）、高濃度+si-NLRP3組（22 μmol/L柴胡皂苷D聯(lián)合轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA）作用48 h。棄培養(yǎng)基，采用蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，按照Western blot流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18水平 按照“1.2.5”的方法接種細(xì)胞和分組處理，收集處理后的細(xì)胞培養(yǎng)基，采用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18， IL-18）的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及制圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以“ｘ±s”表示，進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷D對(duì)HTh83和KMH2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，不同濃度柴胡皂苷D（1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 μmol/L）作用HTh83和KMH2細(xì)胞48 h后細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05），HTh83細(xì)胞和KMH2細(xì)胞柴胡皂苷D作用48 h的IC50分別為22.20、22.90 μmol/L。詳見(jiàn)圖1。根據(jù)IC50的0.1倍、0.5倍和1.0倍選擇低濃度（2.2 μmol/L）、中濃度（11 μmol/L）、高濃度（22 μmol/L）柴胡皂苷D作用48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 柴胡皂苷D對(duì)HTh83和KMH2細(xì)胞克隆形成的影響

柴胡皂苷D作用48 h時(shí)，低濃度組、中濃度組、高濃度組HTh83和KMH2細(xì)胞的克隆數(shù)目均低于對(duì)照組（P<0.05），且HTh83和KMH2細(xì)胞的克隆數(shù)目隨柴胡皂苷D濃度升高而降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3 柴胡皂苷D對(duì)HTh83和KMH2細(xì)胞中NLRP3介導(dǎo)焦亡的影響

柴胡皂苷D作用48 h時(shí)，低濃度組、中濃度組、高濃度組HTh83和KMH2細(xì)胞的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達(dá)水平以及培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18的水平均高于對(duì)照組（P<0.05），且HTh83和KMH2細(xì)胞的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N的表達(dá)水平以及培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18的水平隨柴胡皂苷D濃度升高而增加（P<0.05）。詳見(jiàn)圖2、表2。

2.4 NLRP3 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)柴胡皂苷D促進(jìn)HTh83和KMH2細(xì)胞中NLRP3介導(dǎo)焦亡的影響

高濃度+si-NC組HTh83和KMH2細(xì)胞處理48 h時(shí)的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N表達(dá)水平以及培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18的水平均高于si-NC組（P<0.05）；高濃度+si-NLRP3組HTh83和KMH2細(xì)胞處理48 h時(shí)的NLRP3、裂解型Caspase-1、GSDMD-N表達(dá)水平以及培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18的水平均低于高濃度+si-NC組（P<0.05）。詳見(jiàn)圖3、表3。

2.5 抑制NLRP3表達(dá)對(duì)柴胡皂苷D抑制HTh83和KMH2細(xì)胞增殖和克隆形成的影響

高濃度+si-NC組HTh83和KMH2細(xì)胞處理48 h時(shí)的細(xì)胞存活率及克隆數(shù)目均低于si-NC組（P<0.05）；高濃度+si-NLRP3組HTh83和KMH2細(xì)胞處理48 h時(shí)的細(xì)胞存活率及克隆數(shù)目均高于高濃度+si-NC組（P<0.05）。詳見(jiàn)表4。

3 討論

未分化甲狀腺癌是一種起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的高度惡性腫瘤，常規(guī)手術(shù)切除、放化療的療效均不理想，患者確診后的平均生存期為6～8個(gè)月[1-2]。未分化甲狀腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出極強(qiáng)的增殖活性，與之相關(guān)的可能機(jī)制包括細(xì)胞凋亡、焦亡、鐵死亡等生物學(xué)環(huán)節(jié)異常[10-11]，但具體分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，研究疾病的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和治療手段對(duì)改善未分化甲狀腺癌的治療現(xiàn)狀、延長(zhǎng)患者的生存期具有重要意義。中藥材及其活性成分是近些年抗癌研究的熱點(diǎn)，本研究對(duì)中藥柴胡的活性成分柴胡皂苷D抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制展開(kāi)分析。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為甲狀腺癌歸屬于“石癭”范疇，其發(fā)病與肝郁氣滯、痰濕凝聚有關(guān)，以柴胡為君藥的柴胡疏肝散合二陳湯能夠針對(duì)甲狀腺癌的中醫(yī)病機(jī)發(fā)揮活血止痛、行氣解郁的功效[7]。研究資料顯示，甲狀腺癌術(shù)后應(yīng)用柴胡疏肝散合二陳湯治療能顯著降低腫瘤復(fù)發(fā)率，提示該方劑具有抗甲狀腺癌的功效[7]。柴胡疏肝散合二陳湯中柴胡的活性成分為柴胡皂苷D，多項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)，柴胡皂苷D對(duì)肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用[8， 12-16]。本研究在兩種未分化甲狀腺癌細(xì)胞株HTh83和KMH2中探究柴胡皂苷D抑制增殖的作用。結(jié)果顯示，柴胡皂苷D以濃度依賴性的方式抑制HTh83細(xì)胞和KMH2細(xì)胞增殖。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度柴胡皂苷D能顯著抑制HTh83細(xì)胞和KMH2細(xì)胞克隆形成。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柴胡皂苷D對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制效應(yīng)。

焦亡作為一種新的程序性細(xì)胞死亡形式，其與未分化甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系受到越來(lái)越多的關(guān)注。焦亡過(guò)程中伴隨大量炎癥物質(zhì)釋放，調(diào)控炎癥反應(yīng)的受體蛋白NLRP3是激活細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑，NLRP3能夠使細(xì)胞內(nèi)裂解型Caspase-1生成增加，后者切割GSDMD形成的GSDMD-N是執(zhí)行焦亡的蛋白[17-18]。GSDMD-N能定位于細(xì)胞膜并聚集成膜孔，使細(xì)胞中的炎癥物質(zhì)從膜孔釋放并引起細(xì)胞發(fā)生炎癥性死亡，即細(xì)胞焦亡[19-22]。非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的研究證實(shí)，柴胡皂苷D通過(guò)激活NLRP3/GSDMD-N介導(dǎo)的焦亡抑制癌細(xì)胞增殖[8]。本研究對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞中柴胡皂苷D調(diào)控細(xì)胞焦亡的作用進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，不同濃度柴胡皂苷D顯著增加HTh83細(xì)胞和KMH2細(xì)胞中NLRP3、裂解型Caspase-1及GSDMD-N的表達(dá)。這一結(jié)果與柴胡皂苷D在非小細(xì)胞肺癌中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[8]，表明柴胡皂苷D對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞的焦亡具有促進(jìn)作用，進(jìn)而提示柴胡皂苷D可能通過(guò)促進(jìn)焦亡的方式抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖。

多項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)，抑制焦亡對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用[23-25]。本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)染siRNA的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證細(xì)胞焦亡在柴胡皂苷D抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖中的作用。通過(guò)轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA的方式在柴胡皂苷D作用于細(xì)胞的過(guò)程中抑制NLRP3表達(dá)，進(jìn)而阻礙NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。細(xì)胞增殖及克隆形成的檢測(cè)結(jié)果顯示，柴胡皂苷D作用于細(xì)胞的同時(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA的方式抑制NLRP3表達(dá)后，柴胡皂苷D在HTh83細(xì)胞和KMH2細(xì)胞中抑制增殖和克隆形成、促進(jìn)焦亡的作用均明顯減弱，提示柴胡皂苷D對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用與促進(jìn)NLRP3介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的激活有關(guān)。

綜上所述，柴胡皂苷D對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，這一抑制作用與促進(jìn)NLRP3介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的激活有關(guān)。本研究結(jié)果為探索柴胡皂苷D在未分化甲狀腺癌中的治療價(jià)值及深入認(rèn)識(shí)細(xì)胞焦亡在未分化甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)價(jià)值提供了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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