補腎活血湯及其拆方對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力及其CXCR4表達的影響

〔摘要〕 目的 探討補腎活血湯及其拆方組（補腎組、活血組）對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲能力及CXCR4蛋白表達的影響。方法 分別以補腎活血湯（1.23 g/mL、1.845 g/mL、2.46 g/mL）、補腎中藥（0.873 g/mL、1.31 g/mL、1.746 g/mL）、活血中藥（0.36 g/mL、0.54 g/mL、0.72 g/mL）湯劑灌胃SD雄性大鼠，制備含藥血清。以乳腺癌細胞MDA-MB-231為研究對象，分為對照組，補腎活血湯高、中、低濃度組，補腎中藥高、中、低濃度組，活血中藥高、中、低濃度組，紫杉醇組。采用MTT法探究上述各組MDA-MB-231細胞增殖活力；細胞劃痕試驗、Transwell小室侵襲實驗檢測對照組、補腎活血湯高濃度組、補腎中藥高濃度組、活血中藥高濃度組、紫杉醇組MDA-MB-231細胞遷移、侵襲能力；Western blot 法檢測各組高濃度藥物對MDA-MB-231細胞中CXCR4蛋白表達的影響。結(jié)果 與對照組比較，補腎活血湯低、中、高濃度，補腎中藥中、高濃度，活血中藥中、高濃度以及紫杉醇可顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖活性；補腎活血湯高濃度、活血中藥高濃度、補腎中藥高濃度和紫杉醇均顯著抑制MDA-MB-231細胞遷移、侵襲能力（P<0.05或P<0.01）和CXCR4蛋白表達水平（P<0.05），其中，補腎活血湯高濃度組和紫杉醇組效果更佳（P<0.05）。結(jié)論 補腎活血湯可抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲、遷移能力，可能與下調(diào)MDA-MB-231細胞表面CXCR4蛋白表達水平相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 補腎活血湯；三陰性乳腺癌；MDA-MB-231；CXCR4；增殖；遷移；侵襲

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.009

Effects of Bushen Huoxue Decoction and its disassembled formulas on proliferation， migration， invasion， and CXCR4 expression of

MDA-MB-231 breast cancer cells

YANG Zheng， HU Yudie， YUAN Bo， GE Anqi， ZHU Yutong， ZHANG Linyu， FAN Hongqiao，

LIU Hui， HU Jinhui*

The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Bushen Huoxue Decoction （BSHXD） and its disassembled groups （Bushen group and Huoxue group） on the proliferation， migration， invasion， and CXCR4 protein expression of human breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods BSHXD （1.23 g/mL， 1.845 g/mL， 2.46 g/mL）， kidney-tonifying Chinese medicines decoction （0.873 g/mL， 1.31 g/mL， 1.746 g/mL）， and blood-circulating Chinese medicines decoction （0.36 g/mL， 0.54 g/mL， 0.72 g/mL） were given by gavage to prepare drug-containing serum. The breast cancer cell MDA-MB-231 was used as the research object and divided into control group， high-， medium-， and low-concentration BSHXD groups， high-， medium-， and low-concentration kidney-tonifying Chinese medicines groups， and high-， medium-， and low-concentration blood-circulating Chinese medicines groups， and paclitaxel group. The MTT assay was used to investigate the proliferation activity of MDA-MB-231 cells in the aforementioned groups. Cell scratch test and Transwell chamber invasion test were conducted to determine the migration and invasion abilities of MDA-MB-231 cells in the control group， high-concentration BSHXD group， high-concentration kidney-tonifying Chinese medicines group， high-concentration blood-circulating Chinese medicines group， and paclitaxel group. Western blot was used to examine the effects of high concentration drugs in each group on CXCR4 protein expression in MDA-MB-231 cells. Results Compared with the Control group， Low， Medium， and High concentrations of Bushen Huoxue Tang， Medium and High concentrations of Bushen Chinese herbal medicine， Medium and High concentrations of Huoxue Chinese herbal medicine， and Paclitaxel can significantly inhibit the proliferation activity of MDA-MB-231 cells; The high concentration of Bushen Huoxue Tang， High concentration of Huoxue traditional Chinese medicine， High concentration of Bushen traditional Chinese medicine， and Paclitaxel all significantly inhibited the migration and invasion ability of MDA-MB-231 cells （P<0.05 or P<0.01） and the expression level of CXCR4 protein （P<0.05）. Among them， the high concentration group of Bushen Huoxue decoction and the paclitaxel group had better effects （P<0.05）. Conclusion BSHXD can inhibit the proliferation， invasion， and migration abilities of human breast cancer MDA-MB-231 cells， which may be related to the down-regulation of CXCR4 gene expression on the surface of MDA-MB-231 cells.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Bushen Huoxue Decoction; triple negative breast cancer; MDA-MB-231; CXCR4; proliferation; migration; invasion

乳腺癌是女性最常見的癌癥，在世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計中，乳腺癌已經(jīng)取代了肺癌成為全球發(fā)病率排名第一的癌癥，患者預(yù)后不良且發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。目前，乳腺癌的主要治療方式有手術(shù)、化學(xué)治療、靶向治療、放射治療等。但藥物治療不良反應(yīng)較大，后期常伴隨耐藥現(xiàn)象。其中三陰型乳腺癌較為特殊，具有侵襲性強、轉(zhuǎn)移率高、生存率低、預(yù)后較差等特點[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)暫無治療該亞型乳腺癌的靶向藥物，嚴重影響患者預(yù)后及生命。因此，尋找新的靶向防治三陰性乳腺癌且毒副作用較小的有效手段具有重大臨床意義。

CXCR4是一種趨化因子受體，與基質(zhì)細胞衍生因子1（SDF-1）結(jié)合而發(fā)揮作用，CXCR4常通過降解細胞與細胞之間的連接、維持腫瘤細胞的極性、招募免疫抑制細胞等功能，參與腫瘤細胞趨化、侵襲、增殖、免疫抑制微環(huán)境形成等多個環(huán)節(jié)[3]。研究表明，肺是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，CXCR4的基因敲除或表達抑制可顯著防止乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]；CXCR4高的表達水平的乳腺癌患者遠處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險更大[5]，因此，CXCR4表達被認為與器官特異性轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]；與非三陰性乳腺癌相比，三陰性乳腺癌組織中的CXCR4表達更多，預(yù)后也更差[7]。因此，CXCR4有望成為治療三陰性乳腺癌的潛在靶基因。

補腎活血湯來自《傷科大成》，具有補益肝腎、活血化瘀之效，方由熟地黃12 g、補骨脂15g、菟絲子10 g、杜仲15 g、枸杞子15g、山茱萸15 g、肉蓯蓉15 g、歸尾12 g、沒藥6 g、獨活16 g、紅花6 g組成。此方臨床運用多年，在治療乳腺癌病癥中療效顯著[8-9]。本研究旨在探索補腎活血湯對三陰性乳腺癌細胞的影響及其潛在調(diào)控機制，以期為治療乳腺癌、預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的治療手段。

1 材料

1.1 細胞與動物

MDA-MB-231細胞株購自長沙遠泰公司（批號：CL-0151A）；SD雌性大鼠購自湖南斯萊克景達公司，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心實驗室[許可證號：SYCK（湘）2020-0038、倫理批號：LL2021041404]，飼養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，濕度為50%～70%。

1.2 主要藥品與試劑

CXCR4抗體（批號：ab181021，Abcam）；HRP goat anti-mouse IgG抗體（批號：SA00001-1，Proteintech）；結(jié)晶紫染色劑（批號：#MKCK3154，Sigma）；MTT溶劑（批號：299-93-1，Sigma-Aldrich）。

中藥飲片：熟地黃12 g（批號：2106031）、補骨脂15 g（批號：HY21051901）、菟絲子10 g（批號：CK21042906）、杜仲15 g（批號：21050406）、枸杞子15 g（批號：HH21050701）、山茱萸15 g（批號：SX21052806）、 肉蓯蓉15 g（批號：2105245）、當(dāng)歸尾12 g（批號：TH2105702）、沒藥6 g（批號：21051901）、獨活16 g（批號：TH21052606）、紅花6 g（批號：SX21052806），上述藥物均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)張裕民主任藥師鑒定均為正品；藥品質(zhì)量均符合《中華人民共和國藥典》（2020年版）規(guī)定[10]。

1.3 主要儀器

Bio-Tek酶標(biāo)儀購自賽默飛公司（型號：Multiskan FC）；煎藥壺購自一壺百飲有限公司（型號：FTS-10A）；搖床購自其林貝爾公司（型號：TS-1）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自中天儀器科技有限公司（型號：RE-2000A）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自勤翔公司（型號：ChemiScoupe6100）。

2 方法

2.1 制備藥物

補腎活血湯組（以下簡稱BSHXT）：熟地黃12 g、補骨脂15 g、菟絲子10 g、杜仲15 g、枸杞子15 g、山茱萸15 g、肉蓯蓉15 g、當(dāng)歸尾12 g、沒藥6 g、獨活16 g、紅花6 g，共137 g/劑；補腎組（BS）：熟地黃12 g、補骨脂15 g、菟絲子10 g、 杜仲15 g枸杞子15 g、山茱萸15 g、肉蓯蓉15 g，共97 g/劑；活血組（HX）：當(dāng)歸尾12 g、沒藥6 g、獨活16 g、紅花6 g，共40 g/劑。

各組藥物根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范〔2009〕》[11]規(guī)范分開煎煮，第一次加8倍水量（1 096、776、320 mL）煎煮30 min，第二次加6倍水量煎煮20 min，最后分別于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至藥物濃度約1.23 g/mL（BSHXT低濃度，BSHXT-L）、1.845 g/mL（BSHXT中濃度，BSHXT-M）、2.46 g/mL（BSHXT高濃度，BSHXT-H）；0.873 g/mL（BS低濃度，BS-L）、1.31 g/mL（BS中濃度，BS-M）、1.746 g/mL（BS高濃度，BS-H）；0.36 g/mL（HX低濃度，HX-L）、0.54 g/mL（HX中濃度，HX-M）0.72 g/mL（HX高濃度，HX-H），其中低濃度為人-大鼠臨床等效劑量，中濃度為1.5倍人-大鼠臨床等效劑量，高濃度為2倍人-大鼠臨床等效劑量，上述藥液分裝保存于4 ℃冰箱，備用。

紫杉醇組（以下簡稱PTX）：將紫杉醇粉針劑溶于DMSO溶液中配成母液，再將母液加入完全培養(yǎng)基中配置成終濃度為10 nmol/L紫杉醇培養(yǎng)基溶液。

2.2 制備含藥血清

54只SD雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后以隨機數(shù)字表法隨機分為9組，分別為BSHXT低、中、高濃度組，BS低、中、高濃度組，HX低、中、高濃度組，每組6只。第4天開始灌胃，按大鼠體質(zhì)量給藥，每100 g灌胃1 mL，1次/d，各組灌以對應(yīng)藥液，連續(xù)灌胃7 d。最后一次灌胃后1 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置3 h，3 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心10 min，取上清液，過濾后凍存于-80 ℃冰箱，備用。

2.3 細胞培養(yǎng)與傳代

人乳腺癌MDA-MB-231細胞用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2，每48 h換液一次，待細胞長至約占80%～90%時進行傳代，大約每4天傳代1次。

2.4 MTT試驗

取對數(shù)生長期人乳腺癌MDA-MB-231細胞，5 000個/孔接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，對照組更換完全培養(yǎng)基，BSHXT低、中、高濃度組，BS低、中、高濃度組，HX低、中、高濃度組對應(yīng)更換為15%含藥血清培養(yǎng)基，紫杉醇組更換為紫杉醇培養(yǎng)基溶液，另設(shè)一空白組（僅為完全培養(yǎng)基），每組設(shè)5個復(fù)孔，干預(yù)24 h后每孔加入0.5%MTT溶液20 μL，4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加150 μL DMSO溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀分析490 nm處吸光度（OD）值。

2.5 細胞劃痕試驗

取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，以5 000個/孔的數(shù)量接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)72 h待細胞長滿后，分為對照組、BSHXT-H組、BS-H組、HX-H組、PTX組，200 μL無菌槍頭劃痕并拍照記錄（0 h），對照組更換完全培養(yǎng)基，其余各組更換對應(yīng)含藥培養(yǎng)基，干預(yù)24 h后拍照。運用Image J軟件對劃痕面積進行分析，計算愈合率，繪制相關(guān)統(tǒng)計圖。

2.6 Transwell侵襲試驗

將對應(yīng)處理過的對照組、BSHXT-H組、BS-H組、HX-H組、PTX組MDA-MB-231細胞用0.25%胰酶消化3～5 min，離心，去上清液，PBS洗2遍，無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，接種于內(nèi)鋪Matrigel膠的上室（500 μL）。下室加入DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），培養(yǎng)24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，無菌棉簽拭去上室面殘余細胞，揭膜，移至載玻片上中性樹脂封片，鏡下觀察，隨機選5個視野（上、中、下、左、右）拍照并計數(shù)呈紫色的陽性細胞，統(tǒng)計分析結(jié)果。

2.7 Western blot檢測各組高濃度藥物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞中CXCR4蛋白的表達

提取各組細胞總蛋白，BCA定量配平后取蛋白樣本，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，依次一抗（CXCR4抗體，1∶

1 000稀釋、β-actin，1∶5 000稀釋）、二抗（HRP goat anti-mouse IgG，1∶5 000稀釋）與膜一起各孵育90 min。ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光。Image Lab Software測定光密度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參條帶比值表示相對表達量。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用“ｘ±s”表示。不滿足正態(tài)分布時，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。滿足正態(tài)分布，方差齊性時用單因素方差分析，組間比較采用LSD法；不滿足方差齊性時采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補腎活血湯對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響

與對照組相比，BS-L組和HX-L組細胞活力無顯著變化（P>0.05）；BSHXT-L和BSHXT-H組、BS-H組、HX-H組細胞活力出現(xiàn)不同程度下降（P<0.05或P<0.01）。與同方低濃度劑量組相比，BSHXT-H組、BS-H組、HX-H組細胞活力下降（P<0.05）。詳見表1。

3.2 補腎活血湯對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

0 h時各組劃痕面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)24 h后，對照組劃痕面積顯著縮小。與對照組相比，BSHXT-H組、BS-H組、HX-H組、PTX組MDA-MB-231細胞的遷移能力降低（P<0.05），其中BSXHT-H組和PTX組遷移能力降低更明顯（P<0.05）。詳見圖1。

3.3 補腎活血湯對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響

與對照組相比，其余各干預(yù)組穿越小室的MDA-MB-231細胞數(shù)量不同程度減少（P<0.05），BSHXT-H組、PTX組減少最明顯（P<0.05）。詳見圖2。

3.4 補腎活血湯對MDA-MB-231細胞CXCR4蛋白表達水平的影響

與對照組相比，BSHXT-H組、HX-H組、BS-H含藥血清組、PTX組中細胞CXCR4蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），其中BSXHT-H組、PTX組抑制效果較HX-H組、BS-H組更顯著（P<0.05）。詳見圖3。

4 討論

隨著乳腺癌發(fā)病率的不斷升高，現(xiàn)已成為全世界密切關(guān)注的公共衛(wèi)生話題，三陰性乳腺癌的主要治療手段為手術(shù)與化學(xué)治療，內(nèi)分泌治療及靶向治療的效果對其均不太理想，缺乏術(shù)后輔助治療手段。更重要的是該類型的乳腺癌細胞相比其余類型具有更強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，故三陰性乳腺癌患者具有更高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險[12]。基于以上問題，尋找治療該亞型的新手段是臨床亟待解決的重要問題之一。中醫(yī)藥作為古人智慧的結(jié)晶，其具有療效佳、毒副作用小、個體辨證論治、患者接受度高和依從性好等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的全過程[13]?？赏ㄟ^發(fā)揮治未病的中醫(yī)藥主流思想，探索預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的中藥方劑，以期有效提高三陰性乳腺癌患者無病生存期，造福更多患者。

CXCR4在乳腺癌進展中扮演著重要角色，其在許多細胞類型中表達，包括免疫細胞、干細胞和癌細胞[14]。CXCR4的激活觸發(fā)了腫瘤微環(huán)境中與侵襲性腫瘤行為相關(guān)的細胞內(nèi)信號通路，最經(jīng)典的為CX？鄄CL12/CXCR4通路[15]。研究表明，核因子κB信號通路位于CXCL12/CXCR4的下游，調(diào)節(jié)乳腺癌進展以及炎癥、細胞增殖、遷移和入侵[16]。癌癥干細胞具有自我更新、分化并重建腫瘤的潛力，CSC的特征表明它們是轉(zhuǎn)移進展和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動因素，其表面高水平表達CXCR4，引導(dǎo)著血液循環(huán)中CSC向特定部位的歸巢運動[17]。CXCR4拮抗劑-多西紫杉醇共軛物通過納米藥物遞送系統(tǒng)能有效降低三陰性乳腺癌BALB/c小鼠模型肺轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生風(fēng)險[18]。以上表明，CXCR4是調(diào)控癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因之一，目前缺乏針對其的靶向藥物，因此CXCR4有望成為防治乳腺癌的關(guān)鍵靶標(biāo)。

中醫(yī)學(xué)認為“虛、瘀”病機是癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，邪之所湊、其氣必虛，故發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之部位必伴隨“虛”的病理變化，諸虛責(zé)之于腎，腎乃一身陰陽之根本，主先天之元氣，腎虛則易累及它臟，反之亦然。乳腺癌患者多伴有肝氣郁結(jié)，肝失疏泄，氣血運行不暢，加之氣虛無力行血、生血，最終導(dǎo)致瘀毒內(nèi)生、膠著難解，釀成乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，益腎填精、化瘀通滯、標(biāo)本兼治是預(yù)防轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要治則治法[19]。補腎活血湯方中熟地黃、補骨脂、菟絲子、杜仲、枸杞子、山茱萸、肉蓯蓉益腎壯骨、填補精血，為君藥；當(dāng)歸尾、沒藥、獨活、紅花活血祛瘀、通絡(luò)行滯，且可以防方中補益之品，以免滋膩之弊，故而既為臣藥，亦為佐藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中多種成分如枸杞子[20]、菟絲子[21]、紅花[22]、沒藥[23]等多種中藥成分均具有抗腫瘤活性，前期研究發(fā)現(xiàn)補腎活血湯可以通過抑制PI3K/AKT通路介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有效預(yù)防乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展[24]。以上表明，補腎活血湯具有防治腫瘤發(fā)生發(fā)展的巨大潛力。

本研究通過體外試iNlV97Th8l/E+m7mQCr0LA==驗發(fā)現(xiàn)補腎藥、活血藥、補腎活血湯、紫杉醇均能有效抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖活力，高濃度的補腎藥、活血藥、補腎活血湯抑制作用強于相應(yīng)組方的低、中濃度。補腎藥、活血藥、補腎活血湯的高濃度以及陽性藥物PTX干預(yù)均可有效抑制MDA-MB-231細胞的遷移、侵襲能力，同時下調(diào)CXCR4的蛋白表達水平，其中BSHXT-H組和PTX組的干預(yù)效果優(yōu)于其余兩組，而BS-H與HX-H兩組之間無明顯差異。以上表明BSHXT與PTX抗腫瘤療效優(yōu)于單用補腎類中藥或活血類中藥，機制可能與下調(diào)CXCR4表達相關(guān)。由于補腎活血湯藥味眾多，本試驗通過拆方干預(yù)的方式探究單用方中補腎類和活血類中藥是否等同或優(yōu)于補腎活血湯療效，以明確藥味是否可以精減應(yīng)用。結(jié)果表明，補腎藥與活血藥同用方能發(fā)揮最優(yōu)療效，因此后續(xù)研究應(yīng)著重于闡明BSHXT抑制乳腺癌生長轉(zhuǎn)移的具體機制、解析BSHXT眾多化學(xué)成分、垂釣BSHXT靶向CXCR4的小分子先導(dǎo)化合物、開發(fā)針對CXCR4天然靶向抑制劑。

綜上，補腎藥、活血藥、補腎活血湯均能抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、遷移、侵襲能力，其中高濃度補腎活血湯效果最佳，為補腎活血湯在三陰性乳腺癌靶向治療藥物的開發(fā)中奠定了基礎(chǔ)。

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