慢性心力衰竭氣虛血瘀證模型大鼠腸道菌群誘發(fā)心肌炎癥的特征變化

〔摘要〕 目的 探究慢性心力衰竭氣虛血瘀證模型大鼠腸道菌群失調(diào)誘發(fā)心肌炎癥的特征變化。方法 采用皮下多點注射異丙腎上腺素復(fù)合力竭及控食方法制備慢性心力衰竭模型大鼠。造模成功后，基于心力衰竭模型大鼠的病證結(jié)合研究方法驗證證型。從造模成功的18只大鼠中隨機選取7只作為模型組，另設(shè)空白組7只。經(jīng)胸心臟超聲檢測心功能變化；根據(jù)曠場實驗評價大鼠行為學(xué)變化；通過HE染色觀察心肌組織病理變化；采用ELISA檢測腦鈉素（brain natriuretic peptide， BNP）和脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）水平；全自動生化分析儀檢測肌酸激酶（creatine kinase， CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehy drogenase， LDH）和肌酸激酶同工酶（MB isoenzyme of creatine kinase， CK-MB）含量；采用血液流變儀測定全血黏度的低、高切值；RT-qPCR及Western blot檢測心肌NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis related spot like protein， ASC）、胱天蛋白酶-1（cysteine aspartic acid specific protease-1， Caspase-1）和白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）的mRNA和蛋白表達；同時Western blot檢測結(jié)腸緊密連接蛋白（zonula occluden-1， ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）和密封蛋白5（Claudin5）的表達；收集兩組大鼠新鮮糞便，利用16S rDNA高通量測序技術(shù)測定大鼠腸道微生物群的差異。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening， LVFS）顯著降低（P＜0.01）；在曠場的運動速度和總路程降低（P＜0.05，P＜0.01）；血清BNP和LPS水平顯著增加（P＜0.01），CK、LDH和CK-MB含量顯著升高（P＜0.01），表現(xiàn)出心功能減退的“心氣虛”癥狀；心肌組織可見大量纖維水腫，細胞質(zhì)疏松，組織邊緣可見心肌纖維溶解，伴有少量炎癥細胞浸潤；全血黏度的低、高切值顯著升高（P＜0.01），表現(xiàn)出“血瘀”癥狀；NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA和蛋白表達均升高（P＜0.05，P＜0.01），ZO-1、Occludin、Claudin5表達均明顯降低（P＜0.01）。腸道菌群測定結(jié)果證實：與空白組比較，模型組大鼠腸道菌群物種發(fā)生改變，菌群的ɑ和β多樣性也存在明顯差異，物種差異在門水平上，擬桿菌門（Bacteroidota）和螺旋菌門（Spirochaetota）的豐度上調(diào)，厚壁菌門（Bacillota）的豐度下調(diào)；種水平上，普雷沃氏菌屬（Segatella copri）和琥珀酸密螺旋體菌（Treponema succinifaciens）的豐度上調(diào)，Kineothrix alysoides（P＜0.05）、伶俐瘤胃球菌（Ruminococcus callidus）和普雷沃氏菌（Prevotellamassilia timonensis）的豐度下調(diào)。結(jié)論 慢性心力衰竭氣虛血瘀證模型大鼠存在腸道菌群紊亂和心肌炎癥反應(yīng)，并且伴隨心功能和微循環(huán)障礙，這可能由腸道共生菌Kineothrix alysoides的豐度下調(diào)后LPS上調(diào)所介導(dǎo)。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性心力衰竭；氣虛血瘀證；腸道菌群；心肌炎癥；Kineothrix alysoides

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.008

Characteristic changes of gut microbiota-induced myocarditis in a rat model of chronic heart failure with qi deficiency and blood stasis pattern

LYU Lifei， ZHU Tingting， DING Fan， LU Yingdong， CUI Xiangning*

Guang'anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the characteristic changes of gut microbiota dysbiosis-induced myocardial inflammation in a rat model of chronic heart failure （CHF） with qi deficiency and blood stasis pattern. Methods CHF model rats were prepared by subcutaneous multi-point injection of isoprenaline combined with exhaustive exercise and controlled feeding. After the successful modeling， the pattern of qi deficiency and blood stasis in the rats was verified based on the combined research method of disease and pattern in heart failure model rats. Seven rats were randomly selected from the 18 successfully modeled rats to form the model group， and a blank group of 7 rats was set up additionally. Changes in cardiac function were checked by transthoracic echocardiography; behavioral changes in rats were evaluated through the open-field test; pathological changes in myocardial tissue were observed by HE staining; brain natriuretic peptide （BNP） and lipopolysaccharide （LPS） levels were checked by ELISA; content of creatine kinase （CK）， lactate dehydrogenase （LDH） and MB isoenzyme of creatine kinase （CK-MB） was determined by automatic biochemical analyzers. Whole blood viscosity at low and high shear rates was measured using a hemorheometer. RT-qPCR and Western blot were used to examine the mRNA and protein expressions of myocardial NOD-like receptor protein 3 （NLRP3）， apoptosis related spot like protein （ASC）， cysteine aspartic acid specific protease-1 （Caspase-1）， and interleukin-1β （IL-1β）; Western blot was also used to check the expressions of colonic tight junction proteins such as ZO-1， Occludin， and Claudin-5. Fresh feces were collected from the two groups of rats， and the differences in gut microbiota between the two groups were analyzed by 16S rDNA high-throughput sequencing. Results Compared with the blank group， rats in the model group showed significantly decreased left ventricular ejection fraction （LVEF） and left ventricular fraction shortening （LVFS） （P<0.01）， significantly reduced movement speed and total distance in the open field test （P<0.05， P<0.01）， significantly elevated serum BNP and LPS levels （P<0.01）， and significantly increased content of CK， LDH， and CK-MB （P<0.01）， which were the manifestations of cardiac hypofunction， indicating "heart qi deficiency". In addition， the myocardial tissue of the model group exhibited extensive fibrous edema with loose cytoplasm， and dissolved myocardial fibers observed at the tissue edges， accompanied by a mild inflammatory cell infiltration; the whole blood viscosity at low and high shear rates significantly increased （P＜0.01）， indicating symptoms of "blood stasis". The mRNA and protein expressions of NLRP3， ASC， Caspase-1， and IL-1β in the model group were significantly higher （P<0.05， P<0.01）， while the expressions of ZO-1， Occludin， and Claudin-5 were significantly lower （P＜0.01）. The gut microbiota analysis revealed that the gut microbiota species of rats in the model group had been altered compared with those of the blank group， with significant differences in both ？琢 and β diversity of the microbiota. At the phylum level， the abundances of Bacteroidota and Spirochaetota were up-regulated while the abundance of Bacillota was down-regulated; at the species level， the abundances of Segatella copri and Treponema succinifaciens were up-regulated while the abundances of Kineothrix alysoides （P<0.05）， Ruminococcus callidus， and Prevotellamassilia timonensis were down-regulated. Conclusion Rats with CHF of qi deficiency and blood stasis pattern exhibit gut microbiota dysbiosis and myocardial inflammation， accompanied by cardiac dysfunction and microcirculation disturbance， which may be mediated by the upregulation of LPS following the downregulation of the abundance of the intestinal symbiotic Kineothrix alysoides.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 chronic heart failure; qi deficiency and blood stasis pattern; gut microbiota; myocardial inflammation; Kineothrix alysoides

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各種心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）發(fā)展的終末期表現(xiàn)，是一組由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常引起的心室充盈或射血能力受損的復(fù)雜臨床綜合征，隨著CHF患者發(fā)病率、死亡率和再入院率的持續(xù)上升，CHF已成為最嚴重的CVD疾病之一，始終威脅人類健康[1]。因此，為CHF尋求潛在的生物標志物和治療靶點是臨床預(yù)防CHF的重要方法。最近研究表明，腸道微生物組（gut microbiome，GM）可通過多種機制和途徑影響宿主的器官和細胞功能，微生物-宿主串擾與CHF的發(fā)病機制密切相關(guān)，主要涉及炎癥和代謝途徑等[2]。腸-心軸相關(guān)研究已成為CHF治療策略研發(fā)的重要方向[3]。

中醫(yī)學(xué)將CHF歸屬于“心衰”范疇，并認為氣虛血瘀是其形成的關(guān)鍵原因，氣虛日久伴有陽虛，陽少則內(nèi)寒生，內(nèi)寒又容易招致外寒使病情惡化。目前國內(nèi)專家擬定中西醫(yī)聯(lián)合干預(yù)的共識，將治療CHF的中藥逐步納入治療指南[4-5]。因此，將心衰病-證結(jié)合于同一模型動物，是中西醫(yī)結(jié)合研究CHF的重要基礎(chǔ)，也是現(xiàn)階段中醫(yī)藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵進程。

“腸漏”是指腸道菌群的長期失調(diào)會產(chǎn)生內(nèi)源性有毒產(chǎn)物，經(jīng)受損的腸道屏障吸收后再循環(huán)入血，主要歸因于腸道灌注受損導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，而腸道屏障由腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)維持。腸漏致使內(nèi)毒素、微生物組分和微生物代謝產(chǎn)物移位到宿主體循環(huán)中，這一過程容易導(dǎo)致促炎狀態(tài)，繼而誘導(dǎo)促炎因子的釋放，激活NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）。因此，基于菌群和炎癥的精準調(diào)控能更好地保護和改善心肌功能，為CHF的潛在治療提供新的靶點和策略[6]。如三甲胺-N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）能誘導(dǎo)心肌細胞肥大，進而加速心肌纖維化并導(dǎo)致心臟舒張功能障礙，TMAO濃度升高也會破壞心肌線粒體丙酮酸和脂肪酸的氧化，導(dǎo)致能量代謝紊亂，進一步加重CHF[7-9]?？梢娔c道微生態(tài)的調(diào)節(jié)失衡會產(chǎn)生一些敏感性的疾病標志物，這些物質(zhì)的代謝水平與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

因此，本研究以CHF氣虛血瘀證模型大鼠為研究對象，通過16S rDNA技術(shù)初步評估CHF大鼠腸道菌群失調(diào)后的特征變化，旨在從微生物區(qū)系角度闡明“菌群紊亂-心肌炎癥”的初步誘發(fā)機制及CHF的發(fā)病機制，也希望從微生態(tài)理論對CHF氣虛血瘀證的本質(zhì)提出新見解，同時潛在輔助CHF的中醫(yī)藥治療。

1 材料與方法

1.1 動物

30只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量（200±20） g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2021-0011。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所SPF級屏障動物房，使用許可證號SYXK（京）2021-0017，室溫23～25 ℃，相對濕度55%～70%，循環(huán)光照/黑暗12 h，自由進食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始實驗。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：IACUC-GAMH-2024-019）。

1.2 主要實驗藥物、試劑與儀器

鹽酸異丙腎上腺素（批號：S31064，上海源葉生物科技有限公司）；HE染液（批號：G1076）、NLRP3抗體（批號：GB114320）、胱天蛋白酶-1（cysteine aspartic acid specific protease-1， Caspase-1）抗體（批號：GB11383）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；大鼠腦鈉素（brain natriuretic peptide， BNP）ELISA測定試劑盒（批號：SEKR-0058）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）抗體（批號：K009661P）均購自北京索萊寶科技有限公司；凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis related spot like protein， ASC）抗體（批號：abs155599，上海愛必信生物科技有限公司）；緊密連接蛋白（zonula occluden-1， ZO-1）抗體（批號：21773-1-AP）、閉合蛋白（Occludin）抗體（批號：13409-1-AP）、密封蛋白5（Claudin5）抗體（批號：29767-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；大鼠脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）ELISA試劑盒（批號：MM-0647R2，江蘇酶免實業(yè)有限公司）。

80 cm×80 cm×40 cm大鼠曠場箱，自制；Vevo2100型超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）；R500IE型小動物麻醉機（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；CKX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；H1650-W型臺式微量高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；ZIQ7003T0C 型Milli-Q純水儀（美國Millpore公司）；EG1150型包埋機、SM2010R型病理切片機（德國Leica公司）；Chemray 800型全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；SA-6600型全自動血液流變測試儀（北京賽科希德科技股份有限公司）；Thermomixer C型恒溫混勻儀（德國Eppendorf公司）；HiSeq 2500型測序儀（美國Illumina公司）；Agilent2100型生物分析儀（美國Agilent公司）；TopScanTM3.0型動物行為分析軟件（美國CleverSys Inc公司）。

1.3 造模及分組

30只大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組（n=7）、實驗組（n=23）。實驗組先采用異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）皮下注射，誘導(dǎo)CHF模型[10]，大鼠予以ISO（85 mg/kg）連續(xù)2 d皮下注射，間隔24 h，1次/d。再采用游泳力竭+限制飲食制備氣虛血瘀證模型[11-12]，ISO注射第3天開始力竭性游泳，將大鼠置于400 mm×500 mm×700 mm水槽內(nèi)，室溫24～25 ℃，水溫22～24 ℃，水深約40 cm，保證大鼠在水中漂浮而不觸及底部，當大鼠被動游泳至全身力竭時（以大鼠頭面沒入水中5～10 s為準），及時撈出，擦干鼠身，持續(xù)21 d。造模全程限制飲食，每天攝食量為正常食量的1/2。造模結(jié)束后（第27天）對存活的模型大鼠行脫毛備皮，禁食不禁水12 h，次日完成模型大鼠超聲心動圖檢測。參考文獻[10]標準判斷，左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜45%表明CHF模型制作成功?？瞻捉M注射等量生理鹽水。造模期間觀察并記錄大鼠一般情況。

基于“勞則耗氣”“饑則損氣”理論[12-13]及心衰動物模型分析[14]驗證模型大鼠的毛色、精神及活動情況等，綜合一般情況指標評價模型大鼠是否符合氣虛血瘀證動物模型標準。剔除死亡及未造模成功的5只大鼠，從18只模型大鼠中隨機選取7只作為模型組。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況 實驗過程中觀察大鼠毛色、精神及飲食情況。

1.4.2 心臟超聲檢查 大鼠左胸部備皮后，3%異氟烷麻醉，通過高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)對大鼠進行超聲心動圖檢查。通過乳頭中部區(qū)域的胸骨旁長、短軸視野拍攝二維圖像（M型超聲），然后分別測量LVEF、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LEVDD），連續(xù)測量3個心動周期，取平均值，計算左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。LVFS（%）=（LEVDD-LVESD）/LEVDD×100%。

1.4.3 曠場實驗 大鼠提前置于測試室中心適應(yīng)1 h。于自制曠場箱（80 cm×80 cm×40 cm）中心點放入大鼠并觀察5 min。采用動物行為軟件TopScanTM3.0定義中心區(qū)，分析大鼠運動路程和運動時間，計算平均速度。測試完畢，用75%乙醇擦拭干凈箱底，以避免不同大鼠間的氣味、糞便及尿液相互影響。平均速度（mm/s）=運動路程（mm）/運動時間（s）。

1.4.4 血清及生化指標檢測 超聲檢測后，所有大鼠禁食不禁水24 h。20%烏來糖腹腔注射（0.8 mL/100 g）麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺上。腹主動脈采血，常溫靜置2 h，4 ℃、4 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min取血清。按ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測BNP和LPS水平。采用全自動生化分析儀測定大鼠血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehy drogenase，LDH）和肌酸激酶同工酶（MB isoenzyme of creatine kinase， CK-MB）含量。

1.4.5 血液流變學(xué)指標檢測 采用抗凝試管于大鼠腹主動脈采全血5 mL，測試前將試管顛倒混勻再置于血液流變檢測儀中，按設(shè)定程序測定大鼠全血黏度的低、高切值。

1.4.6 HE染色 取大鼠心肌組織，生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定。組織修剪后乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色，封片。顯微鏡下觀察心肌組織病理改變，采圖并分析。

1.4.7 RT-qPCR檢測 取心肌組織0.1 g，充分剪碎后置于勻漿管中，加入Trizol試劑，研磨儀充分研磨。16 000×g離心10 min，吸取上清液，加入250 μL三氯甲烷。顛倒混勻后，常溫靜置3 min，4 ℃、16 000×g離心10 min，吸取400 μL上清液置于新EP管中，加入0.8倍體積異丙醇混勻。-20 ℃靜置15 min，4 ℃、16 000×g離心10 min。用75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、16 000×g離心5 min，棄去上清液。沉淀干燥后，加入無酶水15 μL，60 ℃孵育10 min。采用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA濃度及純度。根據(jù)Servicebio?RT Enzyme Mix試劑盒說明書將RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，按2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性15 s， 60 ℃退火和延伸持續(xù)30 s，共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算目標基因mRNA相對表達量。引物由北京擎科生物科技股份有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

1.4.8 Western blot 檢測 取各組大鼠心肌及結(jié)腸組織，加入強RIPA裂解液，用研磨儀研磨成勻漿，冰上裂解30 min。4 ℃、16 000×g離心15 min，取上清液，分裝后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，BCA試劑盒測定蛋白濃度。用SDS-PAGE制膠試劑盒分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng)一抗[NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、IL-1β（1∶1000）、ZO-1（1∶3 000）、Occludin（1∶3 000）、Claudin5（1∶3 000）]，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次后，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST再洗膜5 min×3次，然后用ECL試劑盒顯色。用Image J軟件定量分析，并以GAPDH和Tubulin蛋白標準化。

1.5 16S rDNA擴增子測序分析

無菌鑷鉗夾取大鼠新鮮糞便放入凍存管，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。采用MagPure Stool DNA試劑盒從6只空白組大鼠和5只CHF大鼠的冷凍糞便樣本中提取微生物群落基因組。樣本的總DNA提取操作步驟嚴格依據(jù)DNA抽提試劑盒說明書進行。采用Qubit和瓊脂糖凝膠電泳對DNA的濃度及純度進行質(zhì)檢。使用細菌16S rDNA（V3-V4）可變區(qū)域引物，前引物為341F-5'ACTCCTACGGGAGG？鄄CAGCAG-3'，后引物為806R-5'GGACTACHVGGGTW？鄄TCTAAT-3'，進行PCR純化和擴增。純化后的產(chǎn)物采用華大基因平臺提供的HiSeq測序儀完成測序。濾除低質(zhì)量的reads后，分析剩余高質(zhì)量的Clean data，包括Tags拼接、OTU聚類和物種注釋。？琢多樣性應(yīng)用于物種多樣性的復(fù)雜性分析，利用R（3.2.1）軟件計算Shannon和Simpson指數(shù)，將所得數(shù)值進行Wilcox檢驗和差異性比對。加權(quán)的UniFrac是在未加權(quán)的UniFrac基礎(chǔ)上納入分析序列的豐度信息，兩者均可評估腸道微生物群的差異分組。β多樣性主要針對因環(huán)境而造成的物種異質(zhì)性。本研究基于加權(quán)或未加權(quán)的UniFrac，采用R（3.2.1）軟件進行兩組大鼠偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）及盒型圖的可視化分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。符合正態(tài)分布的實驗數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊者采用校正t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證型評價

模型組大鼠扎堆活動減少，體質(zhì)量減輕，食少，毛發(fā)凌亂、稀疏枯槁、萎黃易掉；胞瞼下垂、無神呆滯；舌面絳紫，鼻青唇黯；行超聲備皮前可見胸部皮色晦滯；反應(yīng)遲緩，蜷縮嗜睡，應(yīng)激反應(yīng)減弱，甚則倦怠萎靡；爪色青紫，抓捕時見甲掉出血。參照“1.3”中造模及中醫(yī)證型評價標準，判斷本研究模型大鼠與氣虛血瘀證相符。

2.2 心臟超聲結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS顯著降低（P＜0.01），符合CHF大鼠造模評價標準。詳見表2、圖1。

2.3 曠場行為學(xué)結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠活動時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而運動速度和運動路程降低（P＜0.05，P＜0.01），提示模型大鼠出現(xiàn)行為學(xué)異常，符合氣虛證表現(xiàn)。詳見圖2。

2.4 血清學(xué)指標檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清BNP、LPS、CK、CK-MB及LDH含量均顯著增加（P＜0.01）。詳見表3。

2.5 全血黏度指標檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠在低切和高切下的全血黏度明顯升高（P＜0.01），提示微循環(huán)功能異常。詳見表4。

2.6 HE染色結(jié)果

空白組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，心肌細胞間隙正常，未見水腫，間質(zhì)間隙無炎癥浸潤。模型組大鼠心肌呈波浪狀，心肌纖維水腫，細胞質(zhì)疏松，細胞質(zhì)中可見圓形空泡變性；局部組織可見較多心肌纖維溶解，被增生的結(jié)締組織取代，伴有炎癥細胞點狀浸潤。詳見圖3。

2.7 心肌炎癥相關(guān)mRNA表達結(jié)果

與空白組比較，模型組心肌NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β mRNA表達均明顯升高（P<0.01）。詳見表5。

2.8 心肌炎癥及腸道緊密連接相關(guān)蛋白表達結(jié)果

與空白組比較，模型組心肌NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白表達均升高（P＜0.05，P＜0.01）；而結(jié)腸ZO-1、Occludin、Claudin5蛋白表達均明顯降低（P＜0.01）。詳見圖4。

2.9 腸道菌群分析結(jié)果

為了更清楚地展示CHF大鼠腸道菌群的變化，通過分析ISO造模后對微生物菌群的影響，得出兩組大鼠腸道微生物群物種的組成已經(jīng)發(fā)生變化。在門水平（圖5A），厚壁菌門（Bacillota）、擬桿菌門（Bacteroidota）和螺旋菌門（Spirochaetota）是3個占有優(yōu)勢的類群；在屬水平（圖5B），Segatella屬、乳酸菌屬（Lactobacillus）和密螺旋體屬（Treponema）等是模型組較為豐富的微生物群。此外，Shannon和Simpson等指數(shù)能評估GM的α多樣性，其中Shannon（P=0.017 3）和Simpson（P=0.017 3）指數(shù)均有差異（P＜0.05），表明兩組大鼠腸道微生物的群落多樣性有明顯改變（圖5C）。PLS-DA得分結(jié)果顯示，兩組差異有顯著分離趨勢。表明基于metaX軟件建立的PLS-DA模型，可用于CHF氣虛血瘀證模型的腸道菌群差異物的篩選。β多樣性組間差異盒型圖的統(tǒng)計值P=0.022 6（P＜0.05）。綜合PLS-DA及盒型圖所得結(jié)果，可知兩組大鼠的腸道微生物群落間存在差異（圖5D）。

在關(guān)鍵物種差異比較方面，與空白組相比，模型組腸道菌群在門水平上，Bacteroidota菌和Spirochaetota菌的豐度上調(diào)，Bacillota菌的豐度下調(diào)；在種水平上，Segatella copri菌和Treponema succinifaciens菌的豐度上調(diào)，Kineothrix alysoides菌、Ruminococcus callidus菌和Prevotellamassilia timonensis菌的豐度下調(diào)。選取豐度前10的物種，用R軟件展示種水平核心微生物組的平均相對豐度以及差異檢驗的顯著性（圖5E）。得出CHF大鼠腸道菌群中Bacillota/Bacteroidota比值下調(diào)；與腸道共生的Kineothrix alysoides菌群豐度也下調(diào)（P＜0.05），而與炎癥相關(guān)的Treponema succinifaciens菌的豐度上調(diào)。

3 討論

ISO是一種合成的兒茶酚胺和β-腎上腺素能激動劑，研究證實其在實驗動物的心臟組織中能有效模擬人類心肌梗死（myocardial infarction，MI）所觀察到的缺血、缺氧等病變過程，也涉及炎癥反應(yīng)[15-16]。

腸道菌群的紊亂主要影響MI后衰竭心臟的修復(fù)過程，包括心肌炎癥因子的表達、炎癥因子的釋放和炎癥微環(huán)境的形成[17-19]。CHF也常伴隨炎癥反應(yīng)和腸道菌群的雙重功能紊亂，同時也伴有NLRP3的激活。因此，推測腸道菌群可能通過“腸道菌群-NLRP3-心肌炎癥”這一關(guān)鍵的通路與CHF相聯(lián)系，靶向抑制NLRP3的激活能調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的代謝失衡和腸道菌群紊亂，進而防治CHF[20-22]。

本研究Bacillota/Bacteroidota的比率在暴露ISO后下調(diào)，這可能是腸道微生物生態(tài)失調(diào)的典型特征。但目前研究表明，其暫不能作為腸道菌群失調(diào)的標志物[23]。Segatella copri菌能通過胰島素介導(dǎo)葡萄糖的代謝，并導(dǎo)致胰島素抵抗，與腸道菌群失調(diào)和腸道屏障破壞相關(guān)[24]；Treponema succinifaciens菌的豐度與促炎因子（IL-1β和TNF-α）的水平呈正相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，這兩種菌群在CHF大鼠菌群中的豐度均上調(diào)，這可能與腸道微生物介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。Ruminococcus callidus菌與DNA的復(fù)制和修復(fù)密切相關(guān)，可降低免疫治療不良反應(yīng)的嚴重程度[26]；Prevotellamassilia timonensis屬于普雷沃氏菌屬，被視為“益生菌”的代表，能接受益生元3-巖藻糖基乳糖的激發(fā)而在腸道定殖富集[27-28]。本研究結(jié)果顯示，此兩者在CHF大鼠菌群中的豐度下調(diào)，但腸道和菌落的具體作用機制有待進一步研究。

Kineothrix alysoides已被鑒定為一種能產(chǎn)丁酸的菌群，是本研究篩選出的關(guān)鍵差異菌群，由于其兼?zhèn)淇寡缀兔庖哒{(diào)節(jié)雙重特性，因此對腸道屏障和腸道健康的維持具有重要意義。然而，本研究Kineothrix

alysoides在CHF大鼠腸道呈現(xiàn)耗竭趨勢。研究結(jié)果表明，輔助Kineothrix alysoides飲食治療能有效增加顫螺菌科（Oscillospiraceae）的表達，Oscillospiraceae也是本研究空白組大鼠的優(yōu)勢腸道菌群，這與既往研究結(jié)果相似[29-30]。而且該菌屬以產(chǎn)短鏈脂肪酸（short

chain fatty acid，SCFA），尤其以高產(chǎn)丁酸被廣泛關(guān)注和研究。丁酸鹽是一種微生物來源的SCFA，可減輕炎癥和心肌肥大等病癥，改善MI后的心功能，其含量在心力衰竭（heart failure，HF）患者中降低[29-30]。MI后，HF會顯著影響心臟的代謝，在HF期間，ATP產(chǎn)生的途徑由脂肪酸氧化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒夂屯w代謝，使循環(huán)酮水平升高，酮體主要在肝臟中產(chǎn)生，也可在禁食cb1508d09147c8728b41fea84b9657a6期間或在受傷心臟中產(chǎn)生[29]，與中醫(yī)學(xué)“饑則損氣”含義相似；另一方面，腸道菌群紊亂導(dǎo)致Th17/Treg的失衡[31]，炎癥和線粒體反應(yīng)等誘導(dǎo)大量活性氧產(chǎn)生，繼而激活NLRP3，并導(dǎo)致炎癥損傷[6]。此外，研究表明，疲勞宿主產(chǎn)丁酸鹽核心菌群處于缺乏狀態(tài)[31]，與中醫(yī)學(xué)“勞則耗氣”相契合。腸道屏障 “滲漏”的特征在于ZO-1、Occludin和Claudin5等緊密連接蛋白的損傷，從而導(dǎo)致有害代謝物的增加，如LPS，能引發(fā)煽動性的全身炎癥，進而加劇MI后心肌的損傷[32-33]。本研究結(jié)果表明，MI后心臟炎癥和腸道緊密連接蛋白的共同變化趨勢與腸-心軸有關(guān)，心臟和腸道菌群之間存在一定的調(diào)節(jié)關(guān)系，這可能與Kineothrix alysoides菌群的豐度下調(diào)，導(dǎo)致 LPS進入循環(huán)，最后促進心肌炎癥的蛋白表達有關(guān)。

綜上所述，CHF氣虛血瘀證的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)和信號通路，是綜合性功能障礙相互作用的結(jié)果。Kineothrix alysoides菌可作為調(diào)控CHF氣虛血瘀證的潛在靶點，“腸道菌群-NLRP3-心肌炎癥”在CHF的發(fā)生發(fā)展中起著樞紐調(diào)控的作用，針對腸道菌群的紊亂和炎癥的干預(yù)能緩解CHF進程。盡管本研究對腸道菌群失調(diào)和心肌炎癥反應(yīng)之間的潛在機制尚未完全闡明，但為CHF氣虛血瘀證提供了微生物學(xué)的可靠依據(jù)。腸-心軸可能為探索CHF的藥物干預(yù)機制提供一個新的視角，并有助于研究者更好地基于中醫(yī)辨證思維理解腸-心軸在CHF中的特異性。

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