自擬益氣止咳方對肺脾氣虛證大鼠的藥效及其機制

〔摘要〕 目的 探索自擬益氣止咳方對肺脾氣虛證大鼠的影響及其機制。方法 將60只SPF級健康SD雄性大鼠隨機分為正常組（n=12）和造模組（n=48），造模組以脂多糖氣管滴注加煙熏建立肺氣虛證模型，煙熏2周后番瀉葉灌胃建立脾氣虛證模型。4周后，造模組大鼠隨機分為模型組（灌胃等體積生理鹽水）、陽性對照組（灌胃香砂六君子丸混懸液2.7 g/kg）及益氣止咳方低、高劑量組（灌胃益氣止咳方藥液2.45、9.8 g/kg），每組12只，均灌胃治療4周。治療結束后，稱量大鼠體質(zhì)量；檢測抓力觀察大鼠肌肉力量；HE染色觀察大鼠肺和胃組織病理改變；磷鉬酸比色法檢測肺、胃、股四頭肌組織中腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate， ATP）含量；ELISA法檢測肺和胃組織中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α， TNF-α）和白細胞介素-8（interleukin-8， IL-8）的含量。結果 與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、抓力均降低（P<0.01或P<0.05）；肺組織小支氣管管壁充血、炎癥細胞浸潤，黏膜上皮細胞纖毛粘連、倒伏，甚或脫落，管腔內(nèi)有炎性滲出物，胃黏膜出現(xiàn)腺體排列不規(guī)則、炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象；肺、胃和股四頭肌組織中ATP含量降低（P<0.01）；肺和胃組織中TNF-α和IL-8含量升高（P<0.01）。與模型組比較，益氣止咳方低、高劑量組大鼠體質(zhì)量和抓力增加（P<0.01）；肺組織中炎癥細胞浸潤改善，管壁增厚減輕，炎性滲出物及充血減輕，胃組織中腺體層數(shù)增加，排列較整齊，炎癥細胞浸潤減少；肺、胃和股四頭肌組織中ATP的含量增加（P<0.01或P<0.05），肺和胃中TNF-α和IL-8的含量減少（P<0.01）。結論 自擬益氣止咳方能有效改善肺脾氣虛證大鼠的臨床癥狀，其機制可能與抑制炎癥反應、促進ATP合成有關。

〔關鍵詞〕 益氣止咳方；肺脾氣虛證；藥效；炎癥；藏醫(yī)藥

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.007

Efficacy and mechanism of self-drafted Yiqi Zhike Formula on rats

with lung and spleen qi deficiency pattern

WANG Zhuwei1， SUN Shengnan1， YE Fei1， XIA Weina1， BAI Junjie2*， LIAO Xingxu3， ZHAXI Dongzhi3， WANG Kun1， DU Qinghong1， XU Ya1*

1. School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2. Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China;

3. Xizang Golden Khada Pharmaceutical Co.， LTD， Lhasa， Xizang 100037， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects and mechanism of a self-drafted Yiqi Zhike Formula （YQZKF） on rats with lung and spleen qi deficiency pattern. Methods Sixty SPF-grade healthy SD male rats were randomly divided into normal （n=12） and modeling groups （n=48）. In the modeling group， the lung qi deficiency model was established by intratracheal lipopolysaccharide （LPS） instillation with fumigation， and then the spleen qi deficiency model was established by intragastric administration of Fanxieye （Sennae Folium） after two weeks of fumigation. After four weeks， the rats in the modeling group were randomly subdivided into model group （gavage with normal saline of equal volume）， positive control group （gavage with Xiangsha Liujunzi Pill Suspension 2.7 g/kg）， and low- and high- dose YQZKF groups （gavage with YQZKF solution 2.45 and 9.8 g/kg）， with 12 rats in each group. All rats were treated by gavage for four weeks. At the end of the treatment， the body mass of the rats was weighed; the muscle strength of rats was observed by detecting the grip force; HE staining was used to observe the histopathological changes in the lung and stomach tissues of rats; phosphomolybdic acid colorimetric assay was used to determine the content of adenosine triphosphate （ATP） in the lungs， stomach， and quadriceps tissue， and ELISA was used to test the levels of inflammatory factors tumour necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-8 （IL-8） in the lung and stomach tissues. Results Compared with the normal group， the body weight and grip strength of rats in model group were lower （P<0.01 or P<0.05）. In the lung tissue， the small bronchial walls exhibited congestion， inflammatory cell infiltration， and the ciliated epithelial cells showed adhesion， lodging， or even detachment of cilia， with inflammatory exudates present in the lumens. The gastric mucosa showed irregular arrangement of glands and inflammatory cell infiltration. Additionally， ATP content decreased in lung， stomach， and quadriceps tissues （P<0.01 or P<0.05）， while TNF-α and IL-8 levels increased in lung and gastric tissues （P<0.01 or P<0.05）. Compared with the model group， the body mass and grip strength of rats in the low- and high- dose YQZKF groups increased to different degrees （P<0.01 or P<0.05）; the inflammatory cell infiltration in the lung tissue was reduced， with reduced wall thickening， decreased inflammatory exudates and congestion; in the gastric tissue， the number of glandular layers increased， arranged more neatly， and inflammatory cell infiltration decreased. The ATP content increased in the lung， gastric， and quadriceps muscle tissues （P<0.01 or P<0.05）， while the levels of TNF-α and IL-8 decreased in the lung and stomach （P<0.01）. Conclusion Self-drafted YQZKF can effectively alleviate the clinical symptoms of rats with lung and spleen qi deficiency pattern， and its mechanism may be related to inhibition of inflammatory response and promotion of ATP synthesis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yiqi Zhike Formula; lung and spleen qi deficiency pattern; efficacy; inflammation; Tibetan medicine

肺脾氣虛證是指肺脾兩臟氣虛，以咳嗽、氣喘、腹脹、食少、便溏為主要表現(xiàn)的證候[1]，多由久病咳喘，耗傷肺氣，子病及母，運化失常；或飲食勞倦，脾胃受損，土不生金，累積于肺，宣降失司所致。多種呼吸道疾病，如慢性阻塞性肺氣腫穩(wěn)定期[2]、支氣管哮喘緩解期[3]、非小細胞肺癌晚期[4]、新型冠狀病毒感染恢復期[5]等均可出現(xiàn)以肺脾氣虛證為主的臨床表現(xiàn)。本團隊根據(jù)中醫(yī)學理論及杜慶紅教授在藏區(qū)工作的經(jīng)驗，針對肺脾氣虛證自擬益氣止咳方。此方由炙黃芪、訶子、榜嘎（藏藥）、沉香組成，在補益肺脾的同時，清熱斂肺、降氣平喘止咳。本實驗通過制備經(jīng)典的肺脾氣虛證大鼠模型，研究益氣止咳方對肺脾氣虛證大鼠的影響及其機制，旨在為藥物的臨床應用奠定基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量為（220±10） g，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，許可證號為SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級動物房，自由進食、飲水，喂養(yǎng)標準顆粒飼料，適應1周后進行實驗。本研究通過北京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會動物實驗倫理審查，編號：BUCM-2023041902-2023。嚴格按照北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)基礎理論動物中心管理規(guī)定進行實驗。

1.2 實驗主要儀器

大小鼠抓力儀（型號：KW-ZL，南京卡爾文生物科技有限公司）；iMark吸收光酶標儀（型號：1681130，美國Bio-Rad公司）；超分辨顯微成像系統(tǒng)（型號：Aperio Versa）、包埋機（型號：EG1150H）、輪轉(zhuǎn)式切片機（型號：HistoCore BIOCUT）、組織攤片機（型號：HI1210）、烘片機（型號：HI1220）均購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 實驗主要藥物及試劑

炙黃芪、訶子、沉香、榜嘎、番瀉葉均購自北京上醫(yī)仁家中醫(yī)診所有限公司；香砂六君子丸（國藥準字：Z11020657，規(guī)格：6 g×12袋，批號：22081293，北京同仁堂制藥有限公司）；戊巴比妥鈉（批號：20170318，美國Sigma公司）；白細胞介素-8 （interleu-kin-8，IL-8）ELISA試劑盒（批號：LotApr2023）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號：LotMar2023）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate， ATP）含量檢測試劑盒（批號：20230314，南京建成生物有限公司）；中華牌香煙（焦油量11 mg/支，批號：10609444594514604，上海煙草集團有限責任公司）；BCA蛋白定量試劑盒[批號：2023QOFP1511，普利萊（北京）基因有限公司]；伊紅染色液（批號：2307001）、蘇木素染色液（批號：2307100）、返藍液（批號：2307002）、中性樹膠（批號：221W021）均購自北京索萊寶科技有限公司；1%酸性乙醇分化液（批號：0714A23，北京雷根生物技術有限公司）。

1.4 益氣止咳方的煎藥方法

參考2015年版《中華人民共和國藥典》[6]及《中華本草·藏藥卷》[7]，并結合臨床經(jīng)驗，創(chuàng)制益氣止咳方。藥物組成：炙黃芪12 g，訶子4 g，榜嘎1.6 g，沉香2 g。根據(jù)人用量折合成大鼠用量[8]準備藥物。

益氣止咳方高劑量組：每10只大鼠1周需要炙黃芪168 g、訶子56 g、榜嘎22.4 g、沉香28 g。首煎加入4倍藥量的水，煮40 min。二煎加入3倍藥量的水，繼續(xù)煎煮30 min。兩次煎液合并，最后濃縮定容至280 mL，每1 mL含生藥0.98 g。

益氣止咳方低劑量組：每10只大鼠1周需要炙黃芪42 g、訶子14 g、榜嘎5.6 g、沉香7 g。煎煮法同益氣止咳方高劑量組，每1 mL含生藥0.245 g。

1.5 香砂六君子丸混懸液的配制

香砂六君子丸具有益氣化痰、行氣溫中的作用，作為本研究的陽性對照藥。根據(jù)說明書最大人用量折算成大鼠用量，即大鼠給藥量為2.7 g/kg。香砂六君子丸混合藥液濃縮至每1 mL含生藥0.27 g。

1.6 番瀉葉的煎煮方法

將番瀉葉投入沸水中浸泡1 h，番瀉葉∶水的比例為1（g）∶10（mL），濾出藥液后存放于4 ℃冰箱備用。

1.7 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的配制

將1 mg LPS重懸于1 mL無菌平衡鹽溶液中，輕輕旋渦振蕩直至粉末完全溶解，即得到1 g/L的儲存液。

1.8 實驗動物分組及造模、給藥方法

1.8.1 實驗動物分組 SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，按照隨機數(shù)字表法將其隨機分為正常組（12只）、造模組（48只）。造模結束后，造模組大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、益氣止咳方高劑量組、益氣止咳方低劑量組，每組12只，分組后進行耳標編號。

1.8.2 肺脾氣虛證模型建立及給藥 應用LPS氣管滴入加香煙煙熏法制作肺氣虛證模型[9]。在第1天和第14天，將200 μL的LPS（1 g/L）滴入造模組大鼠氣管內(nèi)，次日將大鼠連同鼠籠一起置于吸煙染毒箱中，每個箱子中放24只大鼠，1次/d，每次8支香煙，每次煙熏時間約40 min（第1天、第14天滴注LPS，不煙熏）。造模周期4周，自由進食飲水。應用番瀉葉灌胃法制作脾氣虛證模型[10]。從煙熏第15天開始按大鼠體質(zhì)量灌胃番瀉葉（1 mL/100 g），每天1次，周期2周。

肺脾氣虛證造模成功后，按照組別分別灌胃生理鹽水、香砂六君子丸混懸液（2.7 g/kg）、高劑量益氣止咳方藥液（9.8 g/kg）、低劑量益氣止咳方藥液（2.45 g/kg），灌胃體積為1 mL/100 g，治療時間為4周。治療結束后各組大鼠禁食不禁水12 h，稱重后用4%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g）麻醉，取材。

1.9 指標檢測方法

1.9.1 大鼠的死亡情況 每天記錄大鼠死亡情況，并計算死亡率。死亡率=大鼠死亡總數(shù)/大鼠總數(shù)量×100%（不包括人為因素死亡）。

1.9.2 體質(zhì)量 實驗第0、28、56天上午8：00稱量大鼠體質(zhì)量，記錄各組大鼠體質(zhì)量增長情況并進行比較分析。

1.9.3 抓力實驗 實驗選用北京中醫(yī)藥大學科研中心的抓力測定儀，于第4、8周進行抓力實驗，大鼠的前爪抓住抓力測定儀的前橫桿，抓握穩(wěn)定后再拉助大鼠尾根部拉回來。每只大鼠進行3次測試，以平均值為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，觀察大鼠肌肉力量。

1.9.4 HE染色 取大鼠肺、胃（胃底）組織，修剪成1 cm3大小組織塊，取材后立即將大鼠肺和胃組織放入4%多聚甲醛液中固定，進行石蠟包埋、切片，脫蠟。按蘇木素10 min、1%酸性乙醇分化液5 s、返藍液30 s、伊紅2 min的順序染色。最后脫水封片，顯微鏡下觀察。

1.9.5 磷鉬酸比色法 取肺、胃、股四頭肌組織各0.05 g，分別按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的冷雙蒸水450 μL，冰水浴勻漿，制成10%的勻漿液。再置于沸水浴中煮10 min，取出混勻1 min，3 500 r/min離心（離心半徑為38 mm）10 min，取上清液待測。按照ATP試劑盒說明書檢測肺、胃、股四頭肌組織中ATP含量。

1.9.6 ELISA法 取肺、胃組織于-80 ℃凍存，按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測IL-8、TNF-α含量。

1.10 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用“ｘ±s”描述計量資料。各組數(shù)值若符合正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，則進行單因素方差分析，組間比較用LSD法；若不符合正態(tài)性檢驗或方差齊性檢驗，則使用非參數(shù)檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠死亡率

造模期間，大鼠共死亡17只；取材時，正常組因麻醉不當致死2只。死亡率約為29.31%。

2.2 益氣止咳方對大鼠體質(zhì)量的影響

造模前，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。造模后，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.01）。治療后，與模型組比較，陽性對照組、益氣止咳方各劑量組大鼠體質(zhì)量均升高（P<0.05）；陽性對照組及益氣止咳方各劑量組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表1。

與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，陽性對照組、益氣止咳方各劑量組大鼠體質(zhì)量均升高（P<0.01）；陽性對照組及益氣止咳方各劑量組大鼠體質(zhì)量增長率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表1。

2.3 益氣止咳方對大鼠抓力的影響

造模后，與正常組比較，模型組大鼠抓力顯著降低（P<0.01）。治療后，與模型組比較，陽性對照組及益氣止咳方各劑量組抓力顯著升高（P<0.01）；陽性對照組及益氣止咳方各劑量組大鼠抓力差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表2。

2.4 HE染色結果

2.4.1 大鼠肺組織HE染色 正常組大鼠肺組織小支氣管黏膜上皮完整，纖毛未見粘連、脫落，管壁結構完整，未見炎癥細胞浸潤，管腔內(nèi)未見炎性滲出物，肺間質(zhì)未見充血等。模型組小支氣管管壁充血、增厚，管壁有淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，黏膜上皮細胞纖毛粘連、倒伏，甚或脫落，管腔內(nèi)有炎性滲出物。陽性對照組及益氣止咳方各劑量組炎癥細胞浸潤改善，管壁增厚減輕，炎性滲出物及充血減輕。詳見圖1。

2.4.2 大鼠胃組織HE染色 正常組大鼠胃黏膜上皮細胞完整，腺體密集，層數(shù)較多，排列整齊。模型組大鼠胃組織出現(xiàn)腺體排列不規(guī)則、炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象。與模型組相比，陽性對照組及益氣止咳方各劑量組腺體層數(shù)增加，排列較整齊，炎癥細胞浸潤減少。詳見圖2。

2.5 益氣止咳方對大鼠肺、胃、股四頭肌組織中ATP含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺、胃、股四頭肌組織中ATP含量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、益氣止咳方各劑量組大鼠肺、胃、股四頭肌組織中ATP含量升高（P<0.01或P<0.05）。與益氣止咳方低劑量組比較，益氣止咳方高劑量組大鼠肺組織中ATP含量升高（P<0.05）。陽性對照組與益氣止咳方各劑量組肺、胃、股四頭肌中ATP含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表3。

2.6 益氣止咳方對大鼠肺和胃組織中細胞因子IL-8、TNF-α的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺和胃組織中IL-8含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組、益氣止咳方各劑量組肺和胃組織中IL-8含量顯著降低（P<0.01）。陽性對照組及益氣止咳方各劑量組肺和胃組織中IL-8含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表4。

與正常組比較，模型組大鼠肺、胃組織中TNF-α含量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、益氣止咳方各劑量組肺、胃組織中TNF-α含量顯著降低（P<0.01）。陽性對照組及益氣止咳方各劑量組肺和胃組織中TNF-α含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表5。

3 討論

益氣止咳方包含炙黃芪、訶子、沉香、榜嘎4味藥物。其中，黃芪能健脾補中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表；訶子能澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽；榜嘎為藏醫(yī)常用藥物，能清熱解毒利濕，可清除余邪；沉香能行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘。四藥相合，補益肺脾、清熱斂肺、降氣平喘止咳。本方以補虛為主，清肺平喘為輔?？v觀全方，清補與收澀兼用，補虛不斂邪；升中有降，使氣機暢達。

目前，肺氣虛證常見的造模方法有單純煙熏[11]、煙熏加LPS[12]等；脾氣虛證常見的造模方法有灌胃大黃[13]、灌胃番瀉葉[14]等。在肺氣虛證模型制備上，本研究選用香煙霧熏聯(lián)合LPS氣道滴注的方法。相比于單純煙熏，聯(lián)合LPS氣道滴注可使肺功能急劇下降、氣道黏液高分泌，更能促進炎癥細胞浸潤，導致肺組織氣管壁增厚，通氣能力下降[15]，從而使肺氣虛證表現(xiàn)于外的癥狀非常明顯，更符合臨床常見呼吸道疾病肺損傷的病理過程。在脾氣虛證模型制備上，本研究選擇番瀉葉灌胃的方法。大黃因鞣質(zhì)含量較高，產(chǎn)生瀉下作用的同時又可導致便秘[16]，而番瀉葉純?yōu)a無補，瀉下作用較強于大黃[17]。本研究結果顯示，肺脾氣虛證大鼠體質(zhì)量減輕，抓力減小，與肺脾氣虛證患者倦怠乏力、納差等癥狀相吻合，說明造模成功。經(jīng)益氣止咳方治療后，大鼠體質(zhì)量增長加快，乏力癥狀明顯減輕。益氣止咳方各劑量組與陽性對照組的大鼠體質(zhì)量及抓力結果比較，二者差異無統(tǒng)計學意義，可見益氣止咳方與香砂六君子丸改善氣虛的療效相似。

HE染色結果顯示，大鼠造模后肺組織炎癥損傷明顯，胃黏膜腺體數(shù)量減少、排列紊亂，這與田津等[18]研究結果相吻合。經(jīng)益氣止咳方治療后，肺組織中小支氣管炎癥損傷減輕，胃組織中腺體層數(shù)增加、排列較整齊，表明益氣止咳方能有效緩解肺、胃組織結構的損傷。

ATP是生物體進行各項生命活動所需的直接能源物質(zhì)[19]。研究表明，肺脾氣虛狀態(tài)下，機體中的Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性均降低，使肺、胃和肌肉中ATP能量生成不足，導致臨床患者及大鼠模型出現(xiàn)氣短、倦怠乏力、嘔惡納差的癥狀[20-22]。本研究結果顯示，益氣止咳方各劑量組肺、胃、股四頭肌組織中的ATP含量顯著增高，表明益氣止咳方能促進ATP的能量釋放。在促進肺組織中ATP生成方面，益氣止咳方藥效隨劑量增加而增強。

本實驗所用肺脾氣虛證模型的機制與炎癥因子引發(fā)的炎癥反應有關，如IL-8、TNF-α[23]。IL-8是趨化細胞因子，能對白細胞如中性粒細胞產(chǎn)生一定的趨化、激活作用，從而促進炎癥反應[24]。TNF-α是一種促炎細胞因子，能增加粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和IL-8的分泌[25]。本研究結果顯示，益氣止咳方能有效降低肺和胃組織中TNF-α和IL-8的合成，與HE染色肺和胃組織中炎癥減輕結果一致，由此說明益氣止咳方能顯著緩解肺脾氣虛證大鼠肺和胃組織中的炎癥反應。在緩解炎癥方面，益氣止咳方與香砂六君子丸效果相似。

綜上所述，益氣止咳方可有效改善肺脾氣虛證大鼠的癥狀，減輕肺的炎性滲出和胃的組織學改變，其機制可能與抑制炎癥因子合成、促進ATP合成有關，上述研究結果可為益氣止咳方的臨床應用提供有力支撐。

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