生防內(nèi)生細(xì)菌Jaas ed1揮發(fā)性有機(jī)物的抑菌促生長(zhǎng)作用

摘要：用二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定生防內(nèi)生細(xì)菌Jaas ed1的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)土傳病原真菌和擬南芥生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，菌株Jaas ed1的揮發(fā)性有機(jī)物能抑制茄子黃萎菌微菌核的萌發(fā)，抑制率為85.5%。掃描電鏡觀察到揮發(fā)性有機(jī)物處理7 d 后，西瓜枯萎菌菌絲形態(tài)遭到破壞，菌絲表面粗糙，有明顯塌陷區(qū)，部分菌絲干癟，有的菌絲甚至消融斷裂；而空白對(duì)照菌絲干凈、飽滿，其表面光滑、形態(tài)完整。揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)茄子黃萎菌、西瓜枯萎菌、辣椒菌核菌等7種土傳病原真菌的菌絲生長(zhǎng)都有抑制作用，抑制率在23.1%～ 89.8%之間。揮發(fā)性有機(jī)物能促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)，擬南芥單株鮮重是空白對(duì)照的2.7倍。通過頂空固相微萃取法收集菌株Jaas ed1產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物，再經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用儀分析其組分，發(fā)現(xiàn)該菌株揮發(fā)性有機(jī)物包含苯甲醛、壬醛、2，6-二甲基-十一烷、反式-2-十一烯酸、十八烯酸-3-（十八烷基氧基）丙酯、2-甲基二十六烷、三十四烷、15-二十九烷酮等19 種有機(jī)化合物。綜上所述，菌株Jaas ed1能產(chǎn)生抑制土傳病原真菌生長(zhǎng)發(fā)育和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的揮發(fā)性有機(jī)物，該菌株及其產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物具有開發(fā)為生防產(chǎn)品的潛力。

關(guān)鍵詞：生防內(nèi)生細(xì)菌；揮發(fā)性有機(jī)物；抑菌活性；促生長(zhǎng)活性；頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用

中圖分類號(hào)：S182；S482.2⁺92

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）21-0143-06

收稿日期：2023-11-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號(hào)：CARS-18-16）。

作者簡(jiǎn)介：林 玲（1973—），女，江蘇南京人，博士，研究員，主要從事土傳病害發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)研究。E-mail：linling@jaas.ac.cn。

作物土傳病害制約著農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成連作障礙。常見的土傳病害有枯萎病、黃萎病、菌核病、炭疽病、蔓枯病等^［1］。目前生產(chǎn)上土傳病害防控采用綜合管理策略，包括應(yīng)用輪作、抗病品種、無病苗、嫁接、提高土壤有機(jī)質(zhì)含量等措施進(jìn)行農(nóng)業(yè)防治，應(yīng)用藥劑處理種子和休茬期土壤消毒進(jìn)行化學(xué)防治，應(yīng)用生防制劑優(yōu)化土壤微生態(tài)環(huán)境進(jìn)行生物防治等多種防治技術(shù) ^［1-2］。而利用微生物防治土傳病害具有綠色可持續(xù)的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在多種作物上取得成功^{［1，3-4］}。

微生物產(chǎn)生的代謝物是其發(fā)揮生物防治功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)^［5］。這些代謝活性物質(zhì)可分為揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs）和非揮發(fā)性有機(jī)物2類；其中VOCs是一類在常溫常壓下易揮發(fā)的有機(jī)化合物，能夠在空氣、土壤空隙中高效擴(kuò)散，并且可生物降解，在植物表面無殘留^［6-8］。微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物（microbial VOCs，mVOCs）是包含多種化合物組分的復(fù)雜混合物，是防控土傳病害的新型武器。已發(fā)現(xiàn)多種能釋放生防VOCs的微生物和一些活性VOCs組分^{［6，9］}。2010年mVOCs 組分二甲基二硫成功商品化為土壤熏蒸劑產(chǎn)品，在溫室和大田中廣泛用于控制土傳病害，該產(chǎn)品臭氧消耗值為0，被推薦為溴甲烷的替代品，極大地激發(fā)了人們篩選應(yīng)用具有活性VOCs的微生物以及從中尋找具有活性VOCs組分的熱情^［10］。

不同微生物產(chǎn)生不一樣的VOCs ^［9］。隨著研究的深入，越來越多能釋放生防VOCs的微生物種類和mVOCs 成分被發(fā)現(xiàn)。菌株Jaas ed1（原名29-12）是一株內(nèi)生枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），對(duì)茄子黃萎病、西瓜枯萎病具有良好的防效，其活菌和培養(yǎng)濾液對(duì)2種病原菌具有拮抗活性^［4，11］。初步研究發(fā)現(xiàn)，菌株Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs對(duì)茄子黃萎菌具有抑制作用^［12］。為了進(jìn)一步明確該菌VOCs的生物活性，本研究測(cè)定其對(duì)茄子黃萎菌微菌核萌發(fā)和對(duì)西瓜枯萎菌菌絲形態(tài)的影響，以及對(duì)土傳病原真菌和擬南芥生長(zhǎng)的影響，并檢測(cè)其組成成分，以期為利用該菌株生物防治作物土傳病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2022年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試菌株和植物材料

生防細(xì)菌為枯草芽孢桿菌Jaas ed1，其分離和鑒定參見文獻(xiàn)［4］。參照羅曉宇等的方法^［13］制備細(xì)菌Jaas ed1的LB發(fā)酵液（1×10⁸ CFU/mL）備用。

土傳病原真菌為茄子黃萎菌（Verticillium dahliae）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）、辣椒菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）、西瓜蔓枯菌（Didymella bryoniae）、棉花枯萎菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）、番茄早疫菌（Alternaria solani），均來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。用PDA 培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)3～7 d 備用。

擬南芥（Columbia 生態(tài)型）種子按照Ryu等的方法表面消毒處理后，4 ℃春化 2 d備用^［14］。

1.2 菌株Jaas ed1 VOCs對(duì)土傳病原真菌的抑制作用測(cè)定

1.2.1 VOCs對(duì)茄子黃萎菌微菌核萌發(fā)的影響 參照商文靜等的方法^［15］制備茄子黃萎菌的微菌核，觀察微菌核的萌發(fā)。在二分格培養(yǎng)皿的一側(cè)加入8 mL 水瓊脂培養(yǎng)基（WA），另一側(cè)加入8 mL LB固體培養(yǎng)基。在LB固體培養(yǎng)基的一側(cè)涂布100 μL細(xì)菌Jaas ed1的LB發(fā)酵液（1×10⁸ CFU/mL），28 ℃培養(yǎng) 24 h后，在WA培養(yǎng)基一側(cè)鋪上1層滅菌玻璃紙，再涂布400 μL茄子黃萎菌微菌核（1×10⁴ 個(gè)/mL）。用封口膜封口后，28 ℃培養(yǎng)24 h。以不涂布細(xì)菌的平板為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。在光學(xué)顯微鏡E200（日本Nikon公司）下觀察茄子黃萎菌微菌核的萌發(fā)情況，計(jì)算VOCs對(duì)萌發(fā)的抑制率。

抑制率=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%。

1.2.2 VOCs對(duì)西瓜枯萎菌菌絲形態(tài)的影響 在二分格培養(yǎng)皿兩側(cè)分別加入LB固體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，在LB固體培養(yǎng)基的一側(cè)涂布100 μL細(xì)菌Jaas ed1的LB發(fā)酵液（1×10⁸ CFU/mL），28 ℃培養(yǎng) 24 h后，在PDA 培養(yǎng)基一側(cè)接種西瓜枯萎菌菌餅（直徑為5 mm），在距西瓜枯萎菌菌餅 1 cm 處 30°傾斜插入滅菌的蓋玻片^［16］。封口膜封口后，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 7 d 后，將生長(zhǎng)西瓜枯萎菌菌絲的蓋玻片取出，用 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH值為7.2）沖洗2次，經(jīng)2%的戊二醛固定液固定，乙醇系列梯度脫水處理，最后用臨界點(diǎn)干燥儀K850（英國(guó)Quorum公司）干燥，全自動(dòng)離子濺射儀108 Auto（英國(guó)Cressington公司）鍍膜，在掃描電子顯微鏡EVO-LS10（德國(guó)Zeiss公司）下觀察西瓜枯萎菌菌絲的形態(tài)，加速電壓20 kV。以不涂布細(xì)菌的平板為對(duì)照。每處理重復(fù)3次。

1.2.3 VOCs對(duì)7種土傳病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌作用 按照“1.2.2”節(jié)中的方法，先在二分格培養(yǎng)皿中LB固體培養(yǎng)基一側(cè)涂布100 μL細(xì)菌Jaas ed1的LB發(fā)酵液（1×10⁸ CFU/mL），28 ℃培養(yǎng)24 h后，在PDA的一側(cè)中央分別接種供試的7種土傳病原真菌菌餅（直徑為5 mm），封口膜封口后，繼續(xù)培養(yǎng) 3～7 d。以不涂布細(xì)菌的平板為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。待對(duì)照病原真菌長(zhǎng)滿PDA一側(cè)時(shí)，測(cè)量對(duì)照組和處理組病原真菌的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%

1.3 菌株Jaas ed1 VOCs對(duì)擬南芥的促生長(zhǎng)作用測(cè)定

參照羅曉宇等的方法^［13］測(cè)定細(xì)菌Jaas ed1的VOCs對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響。光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)溫度為28 ℃。以不加細(xì)菌的平板為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 菌株Jaas ed1 VOCs收集及組分鑒定

按照羅曉宇等的方法^［13］，通過頂空固相微萃取法，用65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭（美國(guó)Supelco 公司）收集菌株Jaas ed1 VOCs，再經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用儀QP2010（日本 Shimadzu公司）分析其組分。GC-MS分析以及數(shù)據(jù)處理分析條件按照王靜等的方法^［16］進(jìn)行。以不涂布細(xì)菌的處理為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Jaas ed1 VOCs對(duì)茄子黃萎菌微菌核萌發(fā)的抑制作用

在10倍光鏡下，觀察細(xì)菌Jaas ed1釋放的VOCs在二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)24 h后對(duì)茄子黃萎菌微菌核萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，對(duì)照微菌核萌發(fā)正常，幾乎都萌發(fā)出菌絲，萌發(fā)率為96.3%；而經(jīng)細(xì)菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs處理的微菌核則極少萌發(fā)出菌絲，萌發(fā)率僅為14.0%（圖1）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，細(xì)菌Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs顯著抑制茄子黃萎菌微菌核的萌發(fā)，抑制率為85.5%。

2.2 菌株Jaas ed1 VOCs對(duì)西瓜枯萎菌菌絲形態(tài)的影響

掃描電鏡觀察細(xì)菌Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs在二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)7 d后對(duì)西瓜枯萎菌菌絲形態(tài)的影響。結(jié)果表明，對(duì)照菌絲干凈、飽滿，表面光滑，形態(tài)完整；而經(jīng)細(xì)菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs處理的菌絲表面粗糙，有明顯的塌陷區(qū)，部分菌絲干癟，有的菌絲甚至消融斷裂（圖2）。細(xì)菌Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs對(duì)西瓜枯萎菌的菌絲造成嚴(yán)重的破壞。

2.3 菌株Jaas ed1 VOCs對(duì)7種土傳病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

用二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定枯草芽孢桿菌Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs對(duì)西瓜枯萎菌、茄子黃萎菌、辣椒菌核菌、辣椒炭疽菌、西瓜蔓枯菌、棉花枯萎菌、番茄早疫菌7種土傳病原真菌生長(zhǎng)的影響。與沒有涂布細(xì)菌的對(duì)照相比，經(jīng)細(xì)菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs處理的7種土傳病原真菌的菌絲生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，抑制率在23.1%～89.8%之間（圖3）。其中，辣椒菌核菌的菌絲生長(zhǎng)受到的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為89.8%；其次為西瓜蔓枯菌，抑制率為69.5%；番茄早疫菌受到的抑制作用最弱，抑制率為23.1%（表1）。

2.4 菌株Jaas ed1 VOCs對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

采用二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定細(xì)菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響。對(duì)峙培養(yǎng)10 d 后，不加細(xì)菌的空白對(duì)照中，擬南芥平均單株鮮重為9.3 mg；而經(jīng)細(xì)菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs處理的擬南芥平均單株鮮重達(dá)到25.0 mg，是空白對(duì)照的2.7倍。細(xì)菌Jaas ed1的VOCs對(duì)擬南芥生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用（圖4）。

2.5 菌株Jaas ed1 VOCs的組分分析

通過頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，收集細(xì)菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs，并分析其組成。鑒定結(jié)果為，菌株Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs包含苯甲醛、壬醛、2，6-二甲基-十一烷、反式-2-十一烯酸、十八烯酸-3-（十八烷基氧基）丙酯、2-甲基二十六烷、三十四烷、15-二十九烷酮等19 種單體化合物（表2）。

3 討論

內(nèi)生細(xì)菌對(duì)防治維管束病害具有優(yōu)勢(shì)，內(nèi)生的枯草芽孢桿菌Jaas ed1能夠在茄子、西瓜植株體內(nèi)定植，對(duì)茄子黃萎病、西瓜枯萎病具有良好的防治效果^{［4，11，17］}。黃萎菌微菌核的存活數(shù)量對(duì)黃萎病發(fā)生危害程度有直接影響，理想的黃萎病生防因子應(yīng)具備抑制微菌核存活或萌發(fā)的能力^［18］。本研究中，枯草芽孢桿菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs能夠強(qiáng)烈抑制茄子黃萎菌微菌核的萌發(fā)，抑制率為85.5%，具備理想黃萎病生防因子的特性。而且，菌株Jaas ed1 的VOCs能夠抑制茄子黃萎菌、西瓜枯萎菌的菌絲生長(zhǎng)。掃描電鏡觀察到，該菌的 VOCs嚴(yán)重破壞了西瓜枯萎菌的菌絲形態(tài)，使其菌絲表面粗糙，產(chǎn)生明顯塌陷區(qū)，造成部分菌絲干癟，部分菌絲甚至出現(xiàn)消融斷裂。已有研究發(fā)現(xiàn)，抑菌mVOCs能夠破壞真菌的菌絲形態(tài)。水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）JZ-GX1釋放的VOCs使鵝掌楸黑斑病菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌絲表面粗糙，有明顯的褶皺和塌陷區(qū)^［19］。枯草芽孢桿菌ZD01所產(chǎn)VOCs的主要抑菌組分6-甲基-2-庚酮使馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani）菌絲有的表面出現(xiàn)褶皺，有的表面出現(xiàn)腫脹組織，有的菌絲變形增大^［20］。而本研究中，枯草芽孢桿菌Jaas ed1 VOCs 對(duì)西瓜枯萎菌菌絲形態(tài)所造成的損傷程度比前人發(fā)現(xiàn)的更為嚴(yán)重。內(nèi)生細(xì)菌Jaas ed1 VOCs對(duì)茄子黃萎病菌、西瓜枯萎病菌所展現(xiàn)出的強(qiáng)拮抗作用，進(jìn)一步表明該菌在防治黃萎病、枯萎病方面具有應(yīng)用前景。此外，本研究檢測(cè)了菌株Jaas ed1 VOCs的抑菌譜，發(fā)現(xiàn)其VOCs除了能夠抑制茄子黃萎菌、西瓜枯萎菌的菌絲生長(zhǎng)之外，還能夠抑制辣椒菌核菌、辣椒炭疽菌、西瓜蔓枯菌、棉花枯萎菌、番茄早疫菌這5種土傳病原真菌的菌絲生長(zhǎng)，抑制率在23.1%～89.8%之間，這與Li等發(fā)現(xiàn)的Bacillus velezensis CT32 VOCs對(duì)不同病原真菌生長(zhǎng)的抑制程度不同的結(jié)果^［21］一致。病原真菌對(duì)細(xì)菌VOCs敏感性存在差異，可能與病原真菌對(duì)VOCs的解毒能力或者作用部位存在差異有關(guān)^［22］。菌株Jaas ed1 VOCs具有廣譜抑菌作用，表明該菌株對(duì)土傳病害具有一定的生防潛力。

在生防微生物產(chǎn)生的代謝物中，可溶性非VOCs 已被廣泛研究；但對(duì)VOCs 的認(rèn)知還很有限，還需開發(fā)更多能夠產(chǎn)生抑菌促生長(zhǎng)VOCs的生防菌劑和以mVOCs組分為核心的農(nóng)業(yè)投入品^［6］。mVOCs對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用大多數(shù)是以擬南芥為模式植物進(jìn)行研究的^［23］。最近幾年研究擴(kuò)展到其他具有商業(yè)價(jià)值的作物上，如番茄、玉米、生菜等^［24］。本研究以擬南芥為模式植物，測(cè)定菌株Jaas ed1 VOCs對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Jaas ed1所產(chǎn)VOCs能顯著促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，mVOCs具有抑制病原物生長(zhǎng)發(fā)育、激活植物防御系統(tǒng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的功能，是植物生產(chǎn)系統(tǒng)中的重要生物技術(shù)資源；即使在露天條件下，也可以作為生物興奮劑、生物保護(hù)劑使用，有助于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展^［25-26］。能夠產(chǎn)生功能VOCs的微生物，對(duì)于植物病害的生物防治具有更高的應(yīng)用前景。本研究中，枯草芽孢桿菌Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs也具有抑制土傳病原真菌生長(zhǎng)和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，表明該菌株在農(nóng)業(yè)上具有應(yīng)用潛力。

某一特定種類的微生物所釋放的抗菌物質(zhì)會(huì)因菌株的不同而有所差異，每個(gè)菌株產(chǎn)生的VOCs 組合也是獨(dú)特的；即使某些化合物可由許多菌株產(chǎn)生，但大多數(shù)是具備菌株特異性的^{［9，27］}。細(xì)菌的VOCs 主要是烯烴、醇、酮、萜烯、苯類、吡嗪、酸、酯^［9］。已鑒定出多種具有抑菌活性的組分，如二甲基二硫醚、2-十一烷酮、2-壬酮、3-甲基丁醇、十四烷基酯、十八烷等^{［9，19，25，28-29］}。另外，少量具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的mVOCs組分被鑒定出，如2，3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮等^{［14，24］}。本研究中，菌株Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs包含苯甲醛、壬醛、2，6-二甲基-十一烷、反式-2-十一烯酸、十八烯酸-3-（十八烷基氧基）丙酯、2-甲基二十六烷、三十四烷、15-二十九烷酮等19 種單體化合物。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的局限，本研究中菌株Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs除了已鑒定出的19 種單體化合物外，還存在一些無法通過質(zhì)譜信息檢索鑒定出的組分。在已鑒定出的19種組分中，苯甲醛、壬醛、十八烯酸-3-（十八烷基氧基）丙酯、2-甲基二十六烷、三十四烷被發(fā)現(xiàn)具有抑菌作用^［30-35］，苯甲醛、壬醛被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用^［36-37］。菌株Jaas ed1產(chǎn)生的VOCs是否還存在其他抑菌促生長(zhǎng)組分，還有待于進(jìn)一步研究測(cè)定。

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