小葉楊PsWOX11基因?qū)?cè)根生長發(fā)育的影響

摘要：[目的]分析小葉楊PsWOX11基因?qū)?cè)根生長發(fā)育的影響，為研究木本植物WOX11基因調(diào)控側(cè)根生長發(fā)育的分子作用機制提供參考。[方法]利用生物信息學方法鑒定小葉楊PsWOX11基因，并對基因、蛋白結(jié)構(gòu)以及保守序列等進行分析。利用qRT-PCR技術(shù)分析PsWOX11基因組織特異性表達模式。創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因植株35S：：PsWOX11（OE）和35S：：PsWOX11-SRDX（DR），分析過表達和顯性抑制PsWOX11基因?qū)D(zhuǎn)基因楊樹側(cè)根生長發(fā)育的影響。[結(jié)果]PsWOX11基因編碼區(qū)核苷酸序列長度為768 bp，編碼255個氨基酸殘基，在楊樹主根和側(cè)根中表達豐度相對較高。創(chuàng)制了7個PsWOX11過表達轉(zhuǎn)基因楊樹株系和8個顯性抑制轉(zhuǎn)基因楊樹株系，對不同基因型楊樹進行表型及顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)基因84K楊相比，過表達PsWOX11轉(zhuǎn)基因楊樹的側(cè)根長度、直徑均顯著增加，而顯性抑制轉(zhuǎn)基因楊樹表型相反。[結(jié)論] PsWOX11基因參與調(diào)控楊樹的側(cè)根的生長發(fā)育，促使側(cè)根的長度和直徑增加，該研究為進～步揭示W(wǎng)OX11基因參與調(diào)控小葉楊根系生長提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小葉楊；PsWOX11；側(cè)根；根生長；根直徑

中圖分類號：S718.46 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）06-0054-08

wox（ WUSCHEL-related homeobox）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含由65～66個氨基酸殘基組成的同源異型結(jié)構(gòu)域（ Homeodomain，HD）。不同wox成員通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控下游靶基嗣的表達，參與植物的生長發(fā)育，包括植物胚胎建成、干細胞維持和器官發(fā)生等，還響應干旱、鹽和冷脅迫等非生物脅迫。

wox家族基因?qū)τ谥参锏厣喜糠稚L發(fā)育的調(diào)控研究，主要包括參與芽、莖、葉、花、果實、種子等器官、組織形成等，例如，楊樹（ PopulusalbaxP.glandulosa）PagWOX11轉(zhuǎn)錄因子通過激活促芽因子和分生組織調(diào)節(jié)因子，如PiCUC2、PiCUC3和PiWUS等基因的表達，促進芽的從頭再生。WOX4轉(zhuǎn)錄因子作為莖部形成層活性調(diào)控的樞紐，能夠響應多種激素、小肽等信號，進而維持形成層細胞的分裂和分化。煙草（NIcotiana sylvestris）NsWOX9轉(zhuǎn)錄因子通過對STF和LAM1的拮抗作用調(diào)控葉片發(fā)育，維持正確的葉片結(jié)構(gòu)和模式。擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sat/vaL japonica）WOX13轉(zhuǎn)錄因子在花序組織形成過程中被誘導表達，影響花的發(fā)育。黃瓜（Cucumis sativus L.） CsWOX9轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育的果實中表達，且過表達Cs WOX9導致轉(zhuǎn)基因擬南芥的角果變短。WOX2轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育早期的原表皮形成中發(fā)揮著重要作用，且功能相對保守。然而，對于植物地下部分，毛白楊（Populus tomentosa Carri6re） PtoWOX5a轉(zhuǎn)錄因子參與楊樹不定根的發(fā)育，過表達PtoWOX5a基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因楊樹不定根數(shù)量增加，但長度相對減少。機械損傷誘導的生長素可以激活擬南芥AtWOX11/12基因的表達，進而調(diào)控AtLBD16和AtLBD29基因的轉(zhuǎn)錄，介導了離體葉片再生潛能細胞向根創(chuàng)始細胞轉(zhuǎn)變。AtWOX11/12蛋白還可以直接激活AtWOX5/7基因的表達，促進根創(chuàng)始細胞到根原基的轉(zhuǎn)變。水稻OsWOX11/12基因促進過表達轉(zhuǎn)基因水稻冠根分生組織的細胞增殖、伸長等，導致不定根的數(shù)量和生長增加，提高了根系生物量。

近年來，研究人員對wox轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在草本植物中，而對于林木研究較少。由于樹木生理、形態(tài)結(jié)構(gòu)及生長發(fā)育等方面有著明顯的區(qū)別，所以木本植物wox家族成員的功能可能更加多元化，尤其是在影響莖段形成層活動、莖段不定根的發(fā)生和生長發(fā)育以及側(cè)根的形成等方面。楊樹是重要的速生造林樹種，也是木本植物分子生物學研究的模式樹種。小葉楊（Populus simonn Carriere）屬青揚派，是我國北方地區(qū)的主要鄉(xiāng)土樹種，具有抗逆性強、適應性廣、易繁殖和壽命長等特點，因其根系發(fā)達、抗性優(yōu)良被廣泛用于防風固沙，改善生態(tài)環(huán)境。因此，wox家族成員可能在側(cè)根形成方面發(fā)揮著重要功能。本研究以小葉楊為研究材料，克隆和分析了小葉楊PsWOX11的基因序列和組織表達特異性，并以銀腺楊（Populus albaxP.glandulosa，‘84K’）為遺傳轉(zhuǎn)化材料，創(chuàng)制PsWOX11過表達和顯性抑制的轉(zhuǎn)基因楊樹，探討PsWOX11基因?qū)?cè)根生長發(fā)育的影響，為進一步闡明wox基因在木本植物側(cè)根發(fā)生和生長發(fā)育中的作用機制提供幫助，也為后續(xù)林木分子設計育種提供理論指導。

1材料與方法

1.1研究材料

小葉楊用于基因克隆和基因表達分析，銀腺楊用于穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化和功能分析。小葉楊組培苗培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中，其成分包括MS基礎培養(yǎng)基，0.4 mg·L-1 IBA，5g·L-1瓊脂粉和20 g·L-1蔗糖，pH5.8-6.0；84K楊組培苗培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中，其成分包括1/2MS基礎培養(yǎng)基，0.05 mg·L-1 IBA，0.02 mg·L-1 NAA，5 g·L-1瓊脂粉和30 g·L-1蔗糖，pH5.8～6.0。所有植物材料均由中國林業(yè)科學研究院林木遺傳育種全國重點實驗室保存，人工氣候室條件為25℃，16 h/8h光照，黑暗，50 umol·m-2 s-1光照強度。組培苗在培養(yǎng)基中生長3周后，將組培苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土（土壤：珍珠巖=3：1）中，并置于溫室繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2研究方法

1.2.1基因序列分析 使用在線網(wǎng)站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析Ps-WOX11蛋白的理化性質(zhì)。利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析，所有物種的WOX11蛋白氨基酸序列都來源于GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2.2基因組織表達特異性分析 利用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，中國）提取3周齡小葉楊組培苗不同組織的總RNA，包括主根、側(cè)根、莖和幼葉，提取方法參照說明書。將總RNA去除基因組DNA污染后，利用PrimeScriptRT reagent Kit（TaKaRa，日本）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應體系及條件參照說明書。利用Primer5軟件設計PsWOX11的定量引物PsWOX11-RT-F和PsWOX11-RT-R（表1）。利用SYBR PremixEx Taq Kit（TaKaRa，日本）定量試劑及實時熒光PCR儀器Light Cycler 480（Roche Applied Science，Penzberg，德國）進行qRT-PCR分析。選用PsActin作為內(nèi)參基因，且進行3次生物學重復和3次技術(shù)重復，根據(jù)2-△△方法進行計算基因相對表達量。

1.2.3植物表達栽體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化 以小葉楊根部總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa，日本）對PsWOX11基因編碼區(qū)全長序列進行擴增，將其與克隆載體pMD 19-T（TaKaRa，日本）相連接，并進行測序、比對和鑒定。以含有PsWOX11基因的pMD 19-T質(zhì)粒為模板，利用GATEWAY技術(shù)，設計正向和反向引物序列（表1），擴增PsWOX11基因編碼區(qū)全長核苷酸序列，通過BP反應將其與中間載體pDNOR207相連接，再通過LR反應與強啟動子CaMV35S（Cauliflower mosaic virus 35S）融合，構(gòu)建到植物過表達載體pMDC32中；同時，設計帶有EAR（ERF-associated amphiphilic repression）抑制結(jié)構(gòu)域的反向引物序列（SRDX序列）（表1），與構(gòu)建過表達載體同樣的方式構(gòu)建顯性抑制植物表達載體。

利用農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化法，將獲得的PsWOX11基因植物過量表達載體和顯性抑制植物表達載體分別轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中（上海唯地生物技術(shù)有限公司，中國）。采用農(nóng)桿菌侵染楊樹愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化84K楊，簡言之，愈傷組織經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染后，置于含有200 mg·L-3特美汀和3 mg·L-1潮霉素的芽分化誘導培養(yǎng)基上誘導、篩選抗性芽，再將不定芽移至含有同樣濃度潮霉素和特美汀的生根培養(yǎng)基中誘導生根，形成完整植株。摘取幼苗葉片，提取基因組總DNA和總RNA作為模板，利用表1中引物通過PCR擴增和qRT-PCR技術(shù)對其進行分子鑒定，包括基因組DNA水平和RNA水平。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根表型鑒定 選取大小一致（高度約3 cm，帶有2～3片幼葉）的非轉(zhuǎn)基因84K楊、PsWOX11基因過表達和顯性抑制的轉(zhuǎn)基因楊樹頂端，分別扦插于1/2 MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，觀察PsWOX11對側(cè)根長度的影響，并截取距離根尖頂端相同距離（1 cm）的側(cè)根進行橫切解剖，統(tǒng)計側(cè)根直徑。每次試驗至少設置3個生物學重復，每個基因型楊樹至少包含10株個體。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計 使用軟件IBM SPSS Statistics23對統(tǒng)計的數(shù)據(jù)進行分析，使用f檢驗法分析差異顯著水平。

2結(jié)果與分析

2.1PsWOX11基因克隆和序列分析

根據(jù)小葉楊基因組信息（http：//www.populus-superpangenome.com/species/Populus__ simonii），從小葉楊中克隆了一個wox基因，其全長編碼區(qū)核苷酸序列長度為768 bp，可編碼255個氨基酸殘基，該蛋白的分子量約為28.12 kDa，等電點為5.69。多序列比對顯示，不同物種的核苷酸和氨基酸序列相似性較高，編碼的WOX11蛋白質(zhì)序列在N端都有一個高度保守的61個氨基酸殘基組成的同源盒結(jié)構(gòu)域，其中該基因與毛果楊PtWOX11基因的核苷酸序列相似度為99.61％，蛋白質(zhì)序列相似度為99.22％，與84K楊PagWOX11基因的核苷酸序列相似度為98.31％，蛋白質(zhì)序列相似度為97.25％（圖1），因此命名為PsWOX11。

2.2PsWOX11基因組織表達特異性分析

為探究PsWOX11基因在小葉楊不同組織中的表達情況，分別提取生長3周齡小葉楊組培苗的主根、側(cè)根、莖和幼葉的總RNA，采用qRT-PCR技術(shù)進行檢測。結(jié)果表明，PsWOX11基因在各個部位巾均有不同程度的表達，尤其在主根和側(cè)根中表達量較高，在葉片及莖段中也有一定的表達量，相對較低（圖2）。

2.3PsWOX11轉(zhuǎn)基因楊樹的獲得

為了進一步研究PsWOX11基因在楊樹側(cè)根生長發(fā)育中的作用，構(gòu)建了植物過表達載體35S：：PsWOX11和顯性抑制表達載體35S：：PsWOX11-SRDX（圖3A、B），采用農(nóng)桿菌侵染楊樹愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化84K楊，經(jīng)過誘導、再生培養(yǎng)，再通過抗生素篩選和基因組DNA分子檢測鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株，共鑒定了過表達轉(zhuǎn)基因株系7個（OE1-OE7）和顯性抑制轉(zhuǎn)基因株系8個（SRDX1-SRDX8）（圖3C、D）。利用qRT-PCR檢測PsWOX11基因在各轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K楊中的相對表達水平，結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因84K楊相比，PsWOX11在各轉(zhuǎn)基因株系中的相對表達量水平均有不同程度的提高，表明PsWOX11基因已成功轉(zhuǎn)入84K楊中，并能夠過量表達。其中，PsWOX11基因在過表達轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE3中的表達量分別是非轉(zhuǎn)基因84K楊的14.4和12.1倍，在顯性抑制轉(zhuǎn)基因株系SRDX2和SRDX6中的表達量分別是非轉(zhuǎn)基因84K楊的10.2和13.1倍（圖3E），選擇該4個轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)的表型比較和功能分析。

2.4轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根表型分析

選取大小一致（高度約3 cm，帶有2～3片幼葉）的非轉(zhuǎn)基因84K楊、過量表達（OE1和OE3）和顯性抑制PsWOX11基因（SRDX2和SRDX6）的轉(zhuǎn)基因楊樹頂端，將其分別扦插在1/2 MS固體培養(yǎng)基中，置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)3周后，觀察PsWOX11基因?qū)?cè)根生長發(fā)育的影響，包括側(cè)根長度以及直徑等。與非轉(zhuǎn)基因84K楊相比，過表達轉(zhuǎn)基因楊樹的每條主根上所有側(cè)根的總長度（LLR）明顯增加，均顯著高于非轉(zhuǎn)基因84K楊46.4％和41.2％，而顯性抑制轉(zhuǎn)基因楊樹相對較小，均顯著低于非轉(zhuǎn)基因84K楊48.1％和41.9％（圖4）。以上結(jié)果表明，PsWOX11基因促進了轉(zhuǎn)基因楊樹側(cè)根的生長，增加了側(cè)根長度。

為進一步揭示PsWOX11基因在楊樹側(cè)根生長發(fā)育中的作用，選擇培養(yǎng)3周的非轉(zhuǎn)基因84K楊、過量表達和顯性抑制PsWOX11基因的轉(zhuǎn)基因楊樹的側(cè)根，截取距離根尖頂端相同距離（1 cm）的側(cè)根進行橫切解剖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者側(cè)根的內(nèi)部結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異，但是過表達PsWOX11轉(zhuǎn)基因楊樹的側(cè)根直徑明顯大于非轉(zhuǎn)基因84K楊，高達37.7％和30.4％，而顯性抑制PsWOX11轉(zhuǎn)基因楊樹相反，顯著低于非轉(zhuǎn)基因84K楊27.1％和25.1％，（圖5）。以上結(jié)果表明，PsWOX11基因影響了轉(zhuǎn)基因楊樹的側(cè)根直徑，促進了側(cè)根徑向生長。

3討論

根系是高等植物的重要營養(yǎng)器官，水分、養(yǎng)分的吸收利用以及干旱、鹽等非生物脅迫的耐受性等諸多生命活動在不同程度上都依賴根系的生長發(fā)育。側(cè)根是植物根系的重要組成部分，它們從主根或不定根上側(cè)向生長出來，對于形成龐大的植物支根系統(tǒng)具有重要意義。

側(cè)根的發(fā)生是一個復雜的生物學過程，受多種植物內(nèi)源激素和環(huán)境因素所調(diào)控，并有多種轉(zhuǎn)錄因子參與整個過程中，其中不同wox轉(zhuǎn)錄因子家族成員在調(diào)控側(cè)根的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。例如，擬南芥AtWOX14基因在側(cè)根形成的早期特異性地表達，woxf4突變株系表現(xiàn)出初生根生長遲緩。AtWOX7以糖依賴的方式影響側(cè)根的發(fā)育，過表達AtWOX7基因能夠直接抑制AtCYCD6;1基因的表達，進而調(diào)節(jié)側(cè)根的發(fā)育，導致側(cè)根原基數(shù)量減少，恰恰相反，wox7突變體側(cè)根原基的數(shù)量顯著增加。在楊樹中，過表達和顯性抑制WOX11轉(zhuǎn)基因楊樹的側(cè)根數(shù)量明顯減少剛，但是過表達該基因后，轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根總長度明顯高于非轉(zhuǎn)基因84K楊。與以上wox基因家族成員相比，小葉楊PsWOX11基因與毛果楊、84K楊WOX11基因的核苷酸、蛋白質(zhì)序列相似度極高，但部分氨基酸殘基的不同可能導致基因在影響側(cè)根發(fā)生和生長發(fā)育方面功能上的差異。小葉楊PsWOX11基因與84K楊PagWOX11基因在根和葉中表達高于莖中，尤其在主根和側(cè)根中組織特異性表達豐度相對較高，而毛白楊PtoWOX11基因僅限于根中表達，且在不定根根冠后的小區(qū)域有表達。當這些基因在轉(zhuǎn)基因84K楊中表達時都能促進不定根的發(fā)生和生長，表明這些WOX11基因在調(diào)控不定根發(fā)育過程中有保守的功能。本研究中小葉楊PsWOX11基因也直接影響著轉(zhuǎn)基因植株根系的生長發(fā)育，過表達PsWOX11轉(zhuǎn)基因楊樹中每條主根上側(cè)根的長度明顯高于非轉(zhuǎn)基因84K楊，而顯性抑制轉(zhuǎn)基因楊樹的表型恰恰相反，研究結(jié)果與PagWOX11基因基本一致刪，表明PsWOX11基因調(diào)控了側(cè)根的生長發(fā)育。

另外有研究發(fā)現(xiàn)，PtoWOX5a和PtoWUSa參與了毛白楊不定根和側(cè)根的發(fā)育，過表達兩基因均會導致轉(zhuǎn)基因植株不定根數(shù)量增加，長度減少，且不定根和側(cè)根根尖腫脹變大。水稻QHB/OsWOX5基因的qhb突變體植株無法形成S型側(cè)根，僵切除根尖后產(chǎn)生的L型側(cè)根數(shù)量增加，且在輕度干旱脅迫條件下，OsWOX10基因在qhb突變體的側(cè)根原基中表達量增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)QHB通過負調(diào)控OsWOX10來抑制側(cè)根直徑的增加。在本研究中，過表達PsWOX11轉(zhuǎn)基因楊樹的側(cè)根直徑明顯大于非轉(zhuǎn)基因84K楊，而顯性抑制PsWOX11轉(zhuǎn)基因楊樹相反，表明PsWOX11基因影響了轉(zhuǎn)基因楊樹的側(cè)根直徑發(fā)育。然而，PsWOX11基因受哪些上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、PsWOX11蛋白與哪些蛋白相互作用，PsWOX11蛋白又調(diào)控哪些下游相關(guān)基因的表達，進而調(diào)控側(cè)根的生長發(fā)育，包括側(cè)根根尖細胞分裂和分化，細胞的大小以及管胞直徑與胞壁厚度等，其具體上、下游分子調(diào)控機制尚不清楚，有待進一步探究，這些研究結(jié)果也將有助于深入了解楊樹側(cè)根生長發(fā)育機理，為后續(xù)林術(shù)分子設計育種提供理論指導。

4結(jié)論

本研究從小葉楊中克隆了一個wox基因家族成員PsWOX11，與毛果楊和黑楊WOX11具有較高的氨基酸序列相似性，在楊樹主根和側(cè)根中表達量相對較高，能夠參與調(diào)控楊樹的側(cè)根的生長和發(fā)育，促使側(cè)根長度和直徑增加。以上研究結(jié)果表明，PsWOX11基因參與小葉楊根系生長發(fā)育，對木本植物根系生長具有重要的影響，但其分子作用調(diào)控機制有待進行深入解析。