gga-miR-130b-3p在雞脂肪相關(guān)組織中的表達(dá)規(guī)律及其靶基因的生物信息學(xué)分析

摘要：為探究gga-miR-130b-3p對雞脂肪沉積的作用，以江蘇省家禽科學(xué)研究所自主培育的矮小品系S3系和引進(jìn)的國外肉雞品種隱性白羽雞為試驗(yàn)素材，檢測gga-miR-130b-3p在2個(gè)品種0日齡、2周齡、8周齡、14周齡、16周齡肝臟、腹脂、腿肌和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的表達(dá)變化，并對靶基因進(jìn)行預(yù)測、分析。結(jié)果顯示，0 W與 16 W 肝臟組織中g(shù)ga-miR-130b-3p的表達(dá)水平存在明顯品種差異，且在S3系雞中g(shù)ga-miR-130b-3p的表達(dá)水平顯著高于隱性白羽雞（Plt;0.05）；與其他周齡相比，0 W時(shí)腹部脂肪組織中g(shù)ga-miR-130b-3p的表達(dá)量較高（Plt;0.01）；在腿肌組織中，2個(gè)品種間8 W與14W時(shí)gga-miR-130b-3p的表達(dá)有顯著性差異（Plt;0.05），隱性白羽雞8 W的表達(dá)顯著高于S3系雞，14 W時(shí)S3系雞的表達(dá)顯著高于隱性白羽雞（Plt;0.05）；在腹脂細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，gga-miR-130b-3p分化4 d后的表達(dá)均顯著高于增殖期（Plt;0.01）。靶基因預(yù)測分析表明，gga-miR-130b-3p共預(yù)測到70個(gè)交集靶基因。GO和KEGG分析結(jié)果表明，ULK2和GRB10是gga-miR-130b-3p的預(yù)測靶基因。綜合所述，gga-miR-130b-3p在雞不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)存在顯著的品種和組織差異性，gga-miR-130b-3p很可能是通過ULK2和GRB10調(diào)控脂肪沉積。

關(guān)鍵詞：雞；gga-miR-130b-3p；組織；細(xì)胞；表達(dá)分析；脂肪沉積

中圖分類號：S831.2" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0181-06

李瑞瑞，宗" 毅，趙振華，等. gga-miR-130b-3p在雞脂肪相關(guān)組織中的表達(dá)規(guī)律及其靶基因的生物信息學(xué)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：181-186.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.025

收稿日期：2023-11-09

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-41-Z05）；江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目［編號：JBGS（2021）109、JBGS（2021）029］；國家家養(yǎng)動物種質(zhì)庫建設(shè)項(xiàng)目（2023）；國家自然科學(xué)基金（編號：32102538）；廣東省自然科學(xué)基金（編號：2022A1515012014）。

作者簡介：李瑞瑞（1998—），女，山東泰安人，碩士，主要從事家禽遺傳育種研究。E-mail：liruirui117@163.com。

通信作者：向" 海，博士，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：xh@fosu.edu.cn。

雞肉是一種高蛋白、低脂、低膽固醇的食品，在人們的日常餐桌上占有重要地位。近年來，優(yōu)質(zhì)肉雞生長性能不斷改良，但同時(shí)也伴隨著腹部脂肪的過度沉積。腹部脂肪的過度沉積會降低飼料轉(zhuǎn)化效率，而脂肪沉積在肌肉中則會提高嫩度和風(fēng)味［1］。因此，有效控制家禽脂肪沉積，對于優(yōu)質(zhì)肉雞培育和肉質(zhì)改善是非常有意義的。

microRNAs（miRNAs）長度為21～30個(gè)堿基，它是一種小的、非編碼的RNA分子，附著在mRNA的3′-非翻譯區(qū)域（3′-UTR）上，作用主要是負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因［2］。gga-miR-130b-3p是屬于miR-130/301家族的一種多功能因子，在不同疾病與生物學(xué)過程中均發(fā)揮了作用。miR-130b-3p在不同的癌癥類型中具有組織特異性，如gga-miR-130b-3p過表達(dá)，可以在甲狀腺腺瘤［3］和上皮性卵巢癌［4］中作為癌基因，也可以在乳腺癌［5-6］和卵巢癌［7］中發(fā)揮抑癌作用。miR-130b通過靶向Sp1轉(zhuǎn)錄因子抑制肌母細(xì)胞增殖并促進(jìn)肌源分化［8］，miR-130b-3p通過靶向CHD9在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生中起致癌作用［9］，miR-130b通過靶向PTEN可顯著促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖［10］。

近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-130b-3p不但參與了疾病調(diào)控，同時(shí)也參與了哺乳動物脂肪代謝的調(diào)控過程。miR-130b可降低人類肌肉細(xì)胞的靶基因PPARGC1A的表達(dá)，在人類肥胖相關(guān)代謝疾病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［11］；miR-130b可以調(diào)控參與膽固醇脂蛋白運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)［12］；gga-miR-130b-3p在雞上研究還有很大的空間可以完善。有研究報(bào)道gga-miR-130b-3p通過靶向IBDV基因組和抑制SOCS5來抑制傳染性法氏囊病病毒的復(fù)制［13］。目前，對于gga-miR-130b-3p與優(yōu)質(zhì)肉雞脂肪沉積（腹脂和肌內(nèi)脂肪沉積）的直接關(guān)系尚未見詳細(xì)報(bào)道。矮小型S3系雞是通過導(dǎo)入矮小基因（dw）并經(jīng)多個(gè)世代的選育所形成的遺傳性能穩(wěn)定的品系種，體質(zhì)量低于正常雞40%左右，但脂肪沉積也更嚴(yán)重［14-15］，是研究脂肪沉積的理想模型。研究表明，性連鎖矮小雞的GHR基因突變能引起脛骨變短、肌肉量變少、基礎(chǔ)代謝率降低、血液胰島素樣生長因子1（IGF-1）含量降低、血液生長激素含量升高、耐熱性升高、飼料利用率升高［16］等一系列生理和表型性狀的改變。本研究以江蘇省家禽科學(xué)研究所自主選育的矮小品系S3和隱性白羽雞（RR）為試驗(yàn)材料，分析gga-miR-130b-3p在肝臟、腹脂、腿肌組織、腹脂和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖期和分化期的表達(dá)差異，將為明確miR-130b-3p對脂肪沉積的作用提供重要的前期研究基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動物：0日齡（0 W）、2周齡（2 W）、8周齡（8 W）、14周齡（14 W）、16周齡（16 W）江蘇省家禽科學(xué)研究所矮小品系S3系雞（DW）和隱性白羽肉雞（RR）各6羽。S3系雞是利用矮小基因DW培育而成的優(yōu)質(zhì)肉雞，體型較小，生長速度較慢；隱性白羽肉雞屬于快大型肉雞，體型較大、生長周期短、肉質(zhì)好。試驗(yàn)雞由江蘇省家禽科學(xué)研究所邵伯試驗(yàn)基地提供，雞飼養(yǎng)期為2022年5—10月；試驗(yàn)在江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所完成。

主要儀器：高壓滅菌鍋（TOMY/SX-500，日本TOMY公司），分光光度計(jì)（NanoDrop 2 000）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（3111），均購自美國Thermo公司；PCR擴(kuò)增儀（CFX96）、熒光定量PCR擴(kuò)增儀（9902），均購自美國applied biosystems公司。

主要試劑和耗材：胎牛血清（FBS，以色列BI公司），青鏈霉素混合液（美國Gibco公司），DME/F12培養(yǎng)基（SH30023.01，美國HyClone公司），D-HANKS（北京Solarbio公司），Ⅰ型膠原酶（北京英坊科技有限公司），油酸（美國Sigma公司），總RNA提取試劑盒（DP419）、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211-02）、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒（FP411-02）均購自天根生化科技（北京）有限公司，75%乙醇（德州名德消毒科技有限公司），15 mL離心管、10 cm培養(yǎng)皿、12孔板，均購自美國Corning公司。

1.2" 樣品采集

對不同周齡試驗(yàn)雞的肝臟、腹脂和腿肌進(jìn)行取樣，將收集到的樣品快速的放到液氮中進(jìn)行冷凍，在-80 ℃的環(huán)境下進(jìn)行保存待用。

1.3" 細(xì)胞培養(yǎng)

將S3系7日齡母雞置于盛有75%乙醇的燒杯中直至死亡，取腹部脂肪和腿部肌肉，放入裝有 D-HANKS 的6 cm進(jìn)口培養(yǎng)皿內(nèi)，清洗2～3次。

將腹脂組織剪成小碎塊，然后轉(zhuǎn)移至15 mL的進(jìn)口離心管中，再加入1.0～1.5倍的0.1% Ⅰ型膠原酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行1 h消化，直至變成肉糜，再加入等體積的全培養(yǎng)基，使其停止消化，使用尼龍膜過濾后收集濾液并離心，去除上清液后使用10%的全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀，將培養(yǎng)皿放入 37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合至70%時(shí)進(jìn)行傳代鋪板。

將腿部肌肉組織剪碎后，轉(zhuǎn)移至15 mL的進(jìn)口離心管中，再加入1.0～1.5倍的0.1% Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行1.5 h消化，直至變成肉糜，再加入等體積的全培養(yǎng)基，使其停止消化，然后進(jìn)行離心。吸取上清液至T25瓶中，添加完全培養(yǎng)基裝滿T25，放入37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。細(xì)胞融合至70%時(shí)進(jìn)行傳代鋪板。

細(xì)胞傳代后繼續(xù)培養(yǎng)融合至70%，未添加油酸組的為增殖期細(xì)胞，另一組用0.1%油酸誘導(dǎo)分化并將此時(shí)定義為分化0 h，收集增殖期分化后1、4、6 d 的細(xì)胞。

1.4" 引物設(shè)計(jì)與合成

本項(xiàng)目擬在前期工作的基礎(chǔ)上，以miRbase中的雞gga-miR-130b-3p序列（登錄號：MIMAT0026503）為切入點(diǎn)，采用 miRNAs Design v1.01軟件，以U6為內(nèi)參，設(shè)計(jì)1條引物并由生工生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。引物信息見表1。

1.5" 反轉(zhuǎn)錄合成與QPCR試驗(yàn)

利用miRNA提取分離試劑盒對不同組織和細(xì)胞樣本中的總RNA進(jìn)行提取，RNA濃度和純度采用紫外分光光度計(jì)檢測（1.8≤D260 nm/D280 nm≤2.0）。使用加A法，每個(gè)樣本取3 μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后放置于-20 ℃冰箱保存。

miRNA的熒光定量檢測使用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法，以U6為內(nèi)參考基因在Aplied Biosystems 7500熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。每個(gè)樣本重復(fù)2次，參照日齡為矮小品系S3雞0 W的表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)閁6。miRNA相對表達(dá)采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算。

1.6" 靶基因預(yù)測及功能分析

本研究采用3種在線軟件TargetScan、miRDB、miRmap等，篩選出gga-miR-130b-3p調(diào)控的下游靶基因。為了避免單一軟件預(yù)測到的靶基因過少，并降低預(yù)測結(jié)果的假陽性，所以對3個(gè)軟件預(yù)測中至少出現(xiàn)2次的基因進(jìn)行選取。采用DAVID、KOBAS 3.0等在線工具，對得到的目標(biāo)基因進(jìn)行了GO功能分析和KEGG pathway富集分析。

1.7" 數(shù)據(jù)處理

利用2-ΔΔCT方法，對gga-miR-130b-3p在雞各組織中的表達(dá)水平進(jìn)行比較研究。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”為標(biāo)準(zhǔn)。使用SPSS 26.0軟件對其進(jìn)行了單因素方差分析，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2" 結(jié)果與分析

2.1" gga-miR-130b-3p在肝臟組織中的表達(dá)

由圖1可知，gga-miR-130b-3p在0 W和 16 W 肝臟組織中的表達(dá)存在明顯的品種特異性（Plt;0.05）。DW的表達(dá)量在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均高于RR。RR在0 W的表達(dá)顯著高于其他周齡（Plt;0.05）。RR在8 W時(shí)，gga-miR-130b-3p的表達(dá)量較0、14周齡顯著降低（Plt;0.05）。

2.2" gga-miR-130b-3p在腹脂組織中的表達(dá)

由圖2可知，gga-miR-130b-3p在2個(gè)品種腹脂組織中的表達(dá)模式有一定的差異。gga-miR-130b-3p在RR與DW中0 W時(shí)表達(dá)量最高且極顯著高于其他周齡（Plt;0.01），而在2 W后gga-miR-130b-3p的表達(dá)相對穩(wěn)定，至16 W仍保持在這種低表達(dá)水平。

2.3" gga-miR-130b-3p在腿肌中的表達(dá)

由圖3可知，在8 W與14 W的腿肌肉組織中，gga-miR-130b-3p的表達(dá)有明顯的品種差異（Plt;

0.05），在8 W時(shí)，在DW中，gga-miR-130b-3p的表達(dá)明顯高于RR，但在14 W時(shí)，gga-miR-130b-3p的表達(dá)明顯低于RR（Plt;0.05）。DW各周齡間gga-miR-130b-3p的表達(dá)量無顯著差異（Pgt;0.05）；在RR，gga-miR-130b-3p的表達(dá)在8 W時(shí)最低，至14 W時(shí)則顯著升高。

2.4" gga-miR-130b-3p在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)

在雞腹脂脂肪細(xì)胞中，由圖4-A可知，分化 4 d 和6 d，gga-miR-130b-3p的表達(dá)顯著高于增殖期（Plt;0.05）；在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，圖4-B可知，gga-miR-130b-3p在分化期的表達(dá)極顯著高于增殖期（Plt;0.01），在分化4 d達(dá)到高峰，且至6 d時(shí)維持高表達(dá)量。

2.5" gga-miR-130b-3p靶基因預(yù)測及功能分析

由圖5可知，通過不同在線軟件預(yù)測到的gga-miR-130b-3p靶基因個(gè)數(shù)，TargetScan為557個(gè)，miRDB為994個(gè)，miRmap為1 625個(gè)，3個(gè)軟件預(yù)測結(jié)果的交集靶基因?yàn)?0個(gè)。

由70個(gè)靶基因的GO功能富集分析結(jié)果（圖6）可知，靶基因主要富集于生物學(xué)過程分類中的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、河馬信號的負(fù)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、早期內(nèi)體等過程；細(xì)胞組分分類中的早期內(nèi)吞體膜、粘連結(jié)點(diǎn)、溶質(zhì)：質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、電壓門控氯通道活動；分子功能分類中的Tau蛋白激酶活性、肝

素結(jié)合、胰島素受體結(jié)合、無序的結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、金屬氨基肽酶活性等。KEGG pathway富集分析結(jié)果（圖7）表明，靶基因主要富集到代謝途徑（HPRT1、UXS1、MAT2B）、mTOR信號通路（ULK2、RRAGD、GRB10）、自噬-動物（ULK2、RRAGD、ATG16L1、PRKACB）、內(nèi)吞作用（SNX2、STAM、CLTC）等途徑中。

3" 討論

本研究結(jié)果表明，在肝臟組織中，gga-miR-130b-3p在S3系雞和隱性白羽雞中表達(dá)規(guī)律有所差異，S3系雞gga-miR-130b-3p在肝臟中的表達(dá)量始終高于隱性白羽雞，在腹脂組織中，0～2 W隱性白羽雞gga-miR-130b-3p的表達(dá)量高于S3系雞。在腿肌組織中g(shù)ga-miR-130b-3p的表達(dá)量8 W以前S3系雞高于隱性白羽雞，這可能是早期發(fā)育中隱性白羽雞腿肌的脂肪沉積早于S3雞。綜上所述，gga-miR-130b-3p參與了脂肪沉積的過程，且在不同品種中參與脂肪調(diào)控的時(shí)間及充當(dāng)?shù)慕巧遣煌?。gga-miR-130b-3p在體外腹脂和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖期均顯著低于分化后期，推測gga-miR-130b-3p主要在脂肪細(xì)胞分化期起調(diào)控作用。有文獻(xiàn)研究報(bào)道，miR-130b通過靶向PPAR-γ抑制人原代前脂肪細(xì)胞和3T3-L1小鼠脂肪細(xì)胞中脂肪生成［17］，miR-130b-3p能夠以胞外囊泡的形式進(jìn)入到脂肪細(xì)胞中，并且能夠抑制豬前體脂細(xì)胞的脂肪分化［18］；miR-130b-3p通過靶向KLF3抑制山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化［19］；miR-130b 通過靶向肉牛PPARG和CYP3U2的 1′UTR 直接影響脂肪細(xì)胞分化［20］；在家兔中miR-130b抑制前體脂肪細(xì)胞分化；在雞肝癌細(xì)胞中，INSIG1基因下調(diào)導(dǎo)致ACSL1、MTTP-L、ApoB、ApoVLDLII基因表達(dá)及甘油三酯及甘油含量顯著降低，miR-130b-3p直接靶向INSIG1基因［21］。因此推測，miR-130b-3p可能參與了家禽和哺乳動物的脂肪代謝過程，此外，miR-130b-3p對脂肪細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞增殖也具有重要作用。

gga-miR-130b-3p通過不同的靶基因在不同物種的相關(guān)性狀中發(fā)揮作用，如何準(zhǔn)確預(yù)測靶基因是研究miRNA功能的難點(diǎn)和重點(diǎn)問題。本研究采用3種預(yù)測軟件共篩選到70個(gè)預(yù)測靶基因，顯著富集在代謝途徑、mTOR等信號通路，其中富集在mTOR信號通路里的ULK2和Grb10與脂肪代謝密切相關(guān)。ULK2調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和葡萄糖攝?。?2］；Grb10通過抑制mTORC1磷酸化依賴反饋促進(jìn)脂肪分解和產(chǎn)熱［23］，通過對小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)Grb10蛋白可以促進(jìn)大腦中瘦素（Leptin）的活性，Grb10直接與神經(jīng)元上的瘦素受體結(jié)合，形成復(fù)合物，增強(qiáng)瘦素信號，有助于減少食物攝入，增加能量消耗［24］。gga-miR-130b-3p對優(yōu)質(zhì)肉雞腹脂和肌內(nèi)脂肪沉積的具體作用及其靶向基因的鑒定，在后期的研究中將會進(jìn)一步通過體外功能試驗(yàn)來證實(shí)。

4" 結(jié)論

gga-miR-130b-3p在不同發(fā)育階段的肝臟、腹脂和腿肌組織中存在差異表達(dá)模式。推測gga-miR-130b-3p對雞脂肪代謝的調(diào)控主要是通過mTOR通路來實(shí)現(xiàn)，ULK2和Grb10將是重點(diǎn)關(guān)注的靶基因。

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