大豆凝集素的分離純化及活性鑒定

車東升, 劉飛飛, 穆成龍, 張海全, 孫澤威, 秦貴信

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室, 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長春 130118)

大豆凝集素(soybean agglutinin, SBA)是指對N-乙?；鵇-半乳糖胺/D-半乳糖特異性結(jié)合、 由4個亞基構(gòu)成四聚體的糖蛋白, 分子量約為120 000, 是大豆中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一, 由Liener等[1]分離得到. 大豆凝集素的純化富集對其在生物技術(shù)上的應(yīng)用具有重要意義[2-5]. 由于傳統(tǒng)大豆凝集素純化方法的純化效率較低, 純品成本較高, 因此限制了其純品在生物學(xué)、 醫(yī)學(xué)和動物營養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用. 大豆凝集素傳統(tǒng)的純化方法包括離子交換、 磷酸鈣層析、 等電點沉淀和硫酸銨分級沉淀等. 張洪淵等[6]采用離子交換纖維素和羥基磷灰石(HA)柱層析等方法分離和純化了大豆凝集素. 根據(jù)不同的親和介質(zhì), 大豆凝集素親和純化體系主要分為半乳糖胺-CH-Sepherose 4B[7]、 N-乙酰基-D-半乳糖胺-Sepharose 6B[8-10]和瓜爾膠[5]親和層析體系. 但以上體系均存在不足: 半乳糖胺-CH-Sepharose 4B的凝膠顆粒和孔徑大小限制了流動相的速度; N-乙?；?D-半乳糖胺-Sepharose 6B的配基N-乙?；?D-半乳糖胺成本較高; 瓜爾膠純化體系的效率和純度較低. 針對上述問題, 本文以性能穩(wěn)定的配基----半乳糖胺及高流速的瓊脂糖固定相----FF-sepharose-4B為填料, 合成了一種廉價、 高效的大豆凝集素親和層析填料, 降低了大豆凝集素純化的成本.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大豆(豐交7607); FF-Sepharose 4B(美國GE公司); D-Galactosamine HCl(美國Sigma公司); 大豆凝集素標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司); 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker(美國GE公司). 其他化學(xué)試劑采用國產(chǎn)分析純.

自動液相色譜分離儀(上海滬西公司); 低溫高速離心機(德國Sigma公司, 3K30型); 層析柱(1.5 cm×15 cm); UV1750型紫外可見光分光光度計(日本島津公司); PHS-3C型酸度計(德國賽多利斯公司); DYY-2C型電泳儀(北京六一儀器廠); 凝膠成像分析儀(美國UVP公司); 透析袋(直徑36 mm).

1.2 半乳糖胺-FF-Sepharose 4B填料的制備

1.2.1 凝膠的溶脹與洗滌 先將FF-Sepharose 4B在0.5 mol/L的NaCl溶液中吸水溶脹, 再用200 mL蒸餾水淋洗后經(jīng)玻璃濾器過濾, 剩余液體由吸取器吸走, 并脫氣.

1.2.2 膠基的活化 將10 g脫氣后的凝膠懸浮于4 mol/L的NaOH溶液中, 加入18.75 mg NaBH4和5.5 mL C3H5ClO. 待凝膠懸浮液在室溫下混合反應(yīng)90 min后, 將凝膠倒入玻璃濾器中, 先用2 mol/L的NaOH淋洗, 再用蒸餾水稀釋至中性, 凝膠依次通過蒸餾水和0.5 mol/L的NaOH淋洗, 脫氣后備用.

1.2.3 半乳糖胺交聯(lián) 將脫氣后活化的凝膠懸浮于6 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%半乳糖胺的0.5 mol/L的NaOH溶液中, 攪拌后在室溫下靜置過夜. 凝膠再用0.5 mol/L的NaOH溶液淋洗玻璃濾器, 衍生物由蒸餾水沖洗至pH為中性, 由0.15 mol/L的NaCl溶液平衡, 并在4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 大豆凝集素粗提液的準(zhǔn)備

1.3.1 脫 脂 稱取生大豆粉(豐交7607)50 g, 加入500 g正己烷, 室溫下攪拌2 h, 靜止后更換正己烷, 重復(fù)上述步驟3次, 風(fēng)干后保存?zhèn)溆?

1.3.2 粗 提 取脫脂豆粉(豐交7607)10 g, 溶于500 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液中充分?jǐn)嚢? 以1 000 r/min離心15 min, 取上清液, 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進行親和層析.

1.4 親和層析分離大豆凝集素

取25 mL膠裝柱, 排氣, 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液平衡12 h, 將過濾后的大豆粗提液100 mL 上柱, 并用自動層析儀監(jiān)測流出層析柱溶液的吸光度, 上樣完畢后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液洗滌雜蛋白, 待洗脫液吸光度回歸基線時, 加入0.3 mol/L半乳糖洗脫液洗脫大豆凝集素蛋白, 收集目的蛋白洗脫峰至基線. 將收集目的蛋白溶液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液透析, 除去半乳糖. 透析后的大豆凝集素用聚乙二醇濃縮. 再將上述濃縮液分裝(1 mL/瓶), 凍干, 低溫保存.

1.5 GalN-FF-Sepharose-4B的再生

先用6 mol/L的鹽酸胍洗脫2～3個柱床體積, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液平衡3個柱床體積, 再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaOH溶液洗脫2～3個柱床體積, 最后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液平衡至洗脫液pH不再變化, 即可使GalN-FF-sepharose-4B再生.

1.6 大豆凝集素的分子量及純度鑒定

將純化獲得的大豆凝集素進行SDS-PAGE檢測[11], 檢測其分子量及其純度, 并與大豆凝集素標(biāo)準(zhǔn)品比較. SDS-PAGE步驟見文獻(xiàn)[6], 分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%, 濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%, 平行灌制2塊膠, 平行點樣, 電泳完畢后, 一塊凝膠用于考馬斯亮藍(lán)染色, 另一塊用于免疫原性鑒定.

1.7 大豆凝集素免疫原性鑒定

采用Western blot方法對純化的大豆凝集素進行免疫原性鑒定, 并與大豆凝集素標(biāo)準(zhǔn)品比較. 用1.6中制備的凝膠轉(zhuǎn)膜[11]后, 取下PVDF膜, 先用蒸餾水洗滌5 min, 再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的SBA于37 ℃孵育30 min, PBST洗滌3次, 每次3 min, 兔抗大豆凝集素多克隆抗體于37 ℃孵育30 min, PBST洗滌3次, 每次3 min, 羊抗兔IgG抗體于37 ℃孵育30 min, DAB顯色3 min后終止反應(yīng).

1.8 大豆凝集素凝集活性的測定

采用兔紅細(xì)胞凝集法鑒定大豆凝集素的凝集活性[12]. 制備兔醛化紅細(xì)胞懸液, 將純化的大豆凝集素按2倍梯度稀釋在V型血凝版的微孔內(nèi), 每孔25 μL, 再加入等體積的醛化兔血紅細(xì)胞, 于37 ℃孵育90 min. 觀察血凝活性, 與標(biāo)準(zhǔn)品比較, 確定純化后大豆凝集素的血凝活性.

圖1 大豆凝集素親和層析曲線Fig.1 Affinity chromatography curve of SBA

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆凝集素親和層析純化

大豆凝集素親和層析曲線如圖1所示, 其中第一個峰為非特異性洗脫峰, 即雜蛋白的洗脫峰, 第二個峰為特異性峰, 即目的蛋白----大豆凝集素洗脫峰. 用GalN-FF-Sepharose 4B的親和層析方法獲得了大豆凝集素蛋白. 所得大豆凝集素經(jīng)透析、 濃縮和凍干處理后, 經(jīng)計算合成的層析填料每毫升能結(jié)合10 mg大豆凝集素.

2.2 大豆凝集素的分子量及純度測定結(jié)果

將純化的大豆凝集素和大豆凝集素標(biāo)準(zhǔn)品比較, 經(jīng)SDS-PAGE檢測, 二者分子量均為30 000, 如圖2所示. 實驗純化所得大豆凝集素的分子量與理論值一致. 經(jīng)UV凝膠分析軟件測算的大豆凝集素純度大于98%.

2.3 大豆凝集素免疫原性鑒定結(jié)果

利用大豆凝集素多克隆抗體, 對純化后的大豆凝集素和標(biāo)準(zhǔn)品進行Western blot鑒定, 二者均在30 000處檢測到陽性條帶, 如圖3所示. 表明純化的大豆凝集素與標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的抗原性, 且成分相同.

1. 低分子量蛋白Marker； 2. Sigma的大豆凝集素； 3. 本實驗純化的大豆凝集素.圖2 SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 Results of SDS-PAGE

1. Sigma的大豆凝集素;2. 本文實驗純化的大豆凝集素.圖3 大豆凝集素Western blot結(jié)果Fig.3 Western blot results of SBA

2.4 大豆凝集素凝集活性測定結(jié)果

本文采用自制的新鮮兔紅細(xì)胞懸液, 檢測純化后大豆凝集素的凝集活性, 并與大豆凝集素標(biāo)準(zhǔn)品比較, 結(jié)果列于表1. 由表1可見, 純化后大豆凝集素的血凝效價為1/210, 與標(biāo)準(zhǔn)品相符.

通常大豆凝集素是指分子量為120 000的四聚體, 由兩種不同的亞基組成, 具有兩個半乳糖結(jié)合位點[7]. 目前, 對大豆凝集素的抗?fàn)I養(yǎng)作用研究較多, 但應(yīng)用其純品進行動物實驗的研究大多集中在大鼠方面[13], 以家畜和家禽為對象的研究較少. 本文采用了較N-乙?；肴樘前妨畠r的半乳糖胺為配基, 與FF-Sepharose 4B瓊脂糖膠基以環(huán)氧結(jié)構(gòu)交聯(lián)制備填料純化大豆凝集素, 降低了配基的成本. 采用FF-Sepharose 4B與Matsumoto等[14]合成的Ga1N-Sepharose CL-4B膠基相比, 其流速更快, 并通過超濾的方法將粗蛋白進行初步分離, 從而提高了純化效率, 有利于規(guī)模化制備大豆凝集素. 純化后的SBA經(jīng)SDS-PAGE染色后, 其分子量與標(biāo)準(zhǔn)品的分子量一致, 表明分離得到的大豆凝集素純度較高. Western blot鑒定結(jié)果表明, 純化的SBA與標(biāo)準(zhǔn)品免疫原性相同.

表1 兔紅細(xì)胞凝集效價的比較

研究表明, SBA可凝集兔、 鼠、 奶牛和人等多種動物的紅細(xì)胞、 T淋巴細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞等[15]. 本文利用大豆凝集素與兔紅細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生凝集的特性, 對樣品中的大豆凝集素凝集活性進行檢測[16], 結(jié)果表明, 純化后大豆凝集素的凝集效價為1/210, 與大豆凝集素標(biāo)準(zhǔn)品一致.

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