黃瓜組織離體培養(yǎng)研究綜述

摘要：高效且可重復(fù)性良好的黃瓜組織離體培養(yǎng)再生體系，在生物技術(shù)輔助育種中占據(jù)關(guān)鍵基礎(chǔ)地位。本文針對黃瓜組織離體培養(yǎng)展開綜述，深入探討基因型、外植體類型、培養(yǎng)基以及外源激素等主要因素對植株再生頻率的作用。同時(shí)，剖析當(dāng)前黃瓜組織離體培養(yǎng)中亟待解決的核心問題，并指明未來的發(fā)展趨向，以期為黃瓜組織離體培養(yǎng)乃至葫蘆科其他作物的組織離體培養(yǎng)提供有益參考。

關(guān)鍵詞：黃瓜；離體培養(yǎng)；基因型；外植體；培養(yǎng)基；外源激素

A review on in vitro culture of cucumber

MyYan1，TengWei1，LiTingting1，LiMuyang1，ZhangGuomin，LeiHaitao1，GengWei1*

（1.Jilin Provincial Institute of Vegetable and Flower Science，Jilin，Changchun 130033 China；

2.Liuhe County Development and Reform Bureau， Tonghua， Jilin 135300 China）

Abstract： Establishing an efficient and reproducible cucumber tissue in vitro culture regeneration system is a key foundational work in biotechnology assisted breeding. This article summarizes the effects of major influencing factors such as genotype， explant type， culture medium， and exogenous hormones on plant regeneration frequency during cucumber tissue in vitro culture. This article analyzes the main problems that urgently need to be solved in cucumber tissue in vitro culture， and points out the future development direction， providing reference for cucumber tissue in vitro culture and even tissue in vitro culture of other crops in the Cucurbitaceae family.

Keywords： Cucumber; In vitro cultivation; Genotype; Explant; Culture medium; Exogenous hormones

黃瓜（Cucumis sativus L.）屬于葫蘆科甜瓜屬，是我國主要的蔬菜作物之一。我國黃瓜育種圍繞產(chǎn)量、抗病性、抗逆性和品質(zhì)等展開，但存在遺傳變異?。ǚN內(nèi)遺傳變異僅為 3%～8%）以及抗逆性和抗病能力弱等問題，生產(chǎn)常受病蟲害嚴(yán)重影響。隨著設(shè)施園藝發(fā)展，黃瓜在保護(hù)地栽培面積占比約42%且逐年增加，但保護(hù)地黃瓜抗病能力差，易滋生病菌，其抗病能力備受關(guān)注。同時(shí)，長期定向選擇和大量商業(yè) F1 代雜種應(yīng)用，使地方品種資源減少，出現(xiàn)遺傳基礎(chǔ)貧乏危機(jī)[1，2]，且多個(gè)新品種共享親本導(dǎo)致黃瓜新品種單一、育種進(jìn)展緩慢。因此，選育品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)不同栽培條件和抗病的黃瓜新品種是育種工作者亟待解決的問題。

生物技術(shù)的飛速發(fā)展為育種提供了新型、快速的平臺，可以利用基因工程、細(xì)胞工程以及分子標(biāo)記等手段輔助選育新品種，創(chuàng)造黃瓜種質(zhì)資源。建立黃瓜高效且重復(fù)性良好的離體再生體系，乃是基因工程及細(xì)胞工程研究的基礎(chǔ)與前提。1971年，西貞夫?qū)S瓜花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，首次獲得不定芽，由此開創(chuàng)了黃瓜組織培養(yǎng)之先河[3]。當(dāng)前，黃瓜已可通過多種器官發(fā)生途徑獲取再生植株，其中部分還構(gòu)建起了較為高效的再生體系并且已經(jīng)成功應(yīng)用于黃瓜育種工作中并選育出優(yōu)良的黃瓜新品種。本文對黃瓜離體培養(yǎng)期間，基因型、外植體類型、培養(yǎng)基以及外源激素等主要影響因素在植株再生方面的作用進(jìn)行了綜述。同時(shí)，剖析了當(dāng)前黃瓜離體培養(yǎng)中亟須解決的主要問題，并指明了未來的發(fā)展方向，為黃瓜離體培養(yǎng)乃至葫蘆科其他作物的離體培養(yǎng)提供借鑒。

1 基因型對黃瓜組織離體培養(yǎng)的影響

普遍認(rèn)為基因型在黃瓜組織離體培養(yǎng)中起著極為重要甚至具有決定性的作用。Todd等[4]對85個(gè)不同基因型的黃瓜子葉外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有25個(gè)基因型的子葉能夠產(chǎn)生不定芽，其中最高的發(fā)生率是53%。趙秀娟等[5]以10個(gè)不同基因型黃瓜品種開展離體培養(yǎng)試驗(yàn)，不定芽再生率在10%～80%之間，差異巨大。Lou等[6]對8個(gè)黃瓜品種的離體胚狀體發(fā)生能力展開研究，結(jié)果表明不同基因型黃瓜品種在分化能力方面差異顯著。杜勝利等[7]選取了12個(gè)不同基因型的黃瓜品種來開展離體培養(yǎng)方面的試驗(yàn)，出芽率在25%～73%之間，差異也較大。李建欣等[8]選取20個(gè)黃瓜自交系的子葉當(dāng)作外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)，得出不同基因型的胚狀體誘導(dǎo)率存在明顯差異，誘導(dǎo)率最高為94%，最低為15%。侯愛菊等[9]選用東北地區(qū)4個(gè)黃瓜主栽品種的子葉節(jié)為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)不同基因型叢生芽的發(fā)生率差異顯著。

但Caglar和Abak[11]以黃瓜未授粉子房為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)研究中得出了相反的結(jié)論，認(rèn)為基因型不會影響再生植株的誘導(dǎo)效果，F(xiàn)aris等[12]也報(bào)道了相同的結(jié)論。

基因型對黃瓜組織離體培養(yǎng)的影響因試驗(yàn)材料而異，所以要進(jìn)行有針對性的研究。在實(shí)際應(yīng)用中，合適的基因型是確保黃瓜離體培養(yǎng)得以順利開展的重要因素。

2 外植體及切割和接種方式對黃瓜組織離體培養(yǎng)的影響

日本學(xué)者佐藤正孝等[13]在培養(yǎng)黃瓜胚軸中段得到了完整植株，極大促進(jìn)了黃瓜組織離體培養(yǎng)的發(fā)展進(jìn)程，國內(nèi)外學(xué)者針對黃瓜組織離體培養(yǎng)開始了大量的研究工作。80年代以來，科學(xué)家們先后以黃瓜根、真葉、子葉、節(jié)間、子葉節(jié)、下胚軸、幼胚、受精胚、成熟胚、花藥、大孢子、小孢子等為外植體來進(jìn)行黃瓜組織離體培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，不同的外植體在誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽方面的頻率存在顯著差異。劉士莊等[14]1979至1981年對黃瓜葉片、葉柄、嫩莖、卷須、幼果、花藥、胚軸和子葉等八個(gè)部位的組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，除卷須外，其他都已獲得愈傷組織。其中胚軸和子葉的離體培養(yǎng)已獲得植株，且形成花器官。 李曉丹等[15]選取黃瓜的真葉、子葉、下胚軸等當(dāng)作外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)，得出帶有葉柄的完整子葉的不定芽誘導(dǎo)率最高這一結(jié)果。賈金生[16]等也發(fā)現(xiàn)葉柄是不定芽分化最旺盛的部分。李文璐等[17]選取 20個(gè)黃瓜栽培品種的子葉、子葉節(jié)和下胚軸當(dāng)作外植體進(jìn)行黃瓜離體培養(yǎng)試驗(yàn)，得出結(jié)論，20個(gè)黃瓜品種各類外植體的分化效率里子葉節(jié)表現(xiàn)最佳。

另外不同外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生植株倍性和同質(zhì)性不同，以花藥、大孢子及小孢子為外植體所誘導(dǎo)出來的再生植株可形成單倍體、雙單倍體及多倍體材料。刁衛(wèi)平等[18]研究發(fā)現(xiàn)，以黃瓜未授粉子房為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的40個(gè)再生植株中有2株為單倍體，5株為同源四倍體，3株為雙單倍體，其余為普通二倍體。其他外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生植株可形成二倍體、多倍體及嵌合體材料；因此要根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)選擇合適的外植體作為試驗(yàn)材料。

相同的外植體，采用不同的切割方式及接種方式都對胚狀體的再生有著明顯的影響，主要表現(xiàn)在胚狀體的數(shù)量和質(zhì)量上。趙雋等[19]在研究中得出，當(dāng)外植體切割方式為保留兩片子葉并各切除子葉的三分之二時(shí)，出芽數(shù)是最多的。張守杰等[20]在研究中得出，切除黃瓜子葉的三分之一以及切除葉緣后平鋪于培養(yǎng)基表面，這種方式是黃瓜離體組織培養(yǎng)的最優(yōu)切割和接種方式。

3 培養(yǎng)基類型對黃瓜組織離體培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基作為營養(yǎng)元素對黃瓜離體培養(yǎng)有重要的作用，不同的培養(yǎng)基對黃瓜外植體的生長和分化有不同的影響。MS培養(yǎng)基是使用最為頻繁的一種培養(yǎng)基，而僅有少部分學(xué)者會應(yīng)用 BS3、Miller 等培養(yǎng)基。

還有學(xué)者用N6固體培養(yǎng)基來誘導(dǎo)黃瓜大孢子形成再生植株[21]，用B5和NLN培養(yǎng)基來誘導(dǎo)黃瓜小孢子形成再生植株[22]。因此在黃瓜離體培養(yǎng)過程中，選擇適宜的培養(yǎng)基對黃瓜高效再生體系的構(gòu)建起著至關(guān)重要的作用。

4 外源激素對黃瓜組織離體培養(yǎng)的影響

外源激素的種類和比例屬于影響植物細(xì)胞脫分化的關(guān)鍵要素之一。在黃瓜離體培養(yǎng)過程中常用到的生長素有IAA、NAA等；細(xì)胞分裂素類中6-BA經(jīng)常被使用，同時(shí)也有一些研究應(yīng)用 ZT、KT等激素。另外有一種具有生長素和細(xì)胞分裂素雙重作用的TDZ用于黃瓜大孢子離體培養(yǎng)中。

王蕾等[23]選取黃瓜的子葉與下胚軸當(dāng)作外植體，用以誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明添加IAA（0.2～3 mg/L）和6BA（1.2～3.0 mg/L）有利于誘導(dǎo)愈傷組織。趙宇瑛等[24]以津春四號子葉為外植體培養(yǎng)再生植株，研究發(fā)現(xiàn)只需要極低濃度的NAA就可以形成大量的愈傷組織。候愛菊等[25]用‘長春密刺’黃瓜子葉節(jié)為外植體，在添加了濃度為0.5 mg/L的6-BA的培養(yǎng)基中即可獲得大量叢生芽。黃玉蘭等[26]以黃瓜‘津研4號’的子葉作為外植體，對誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳培養(yǎng)基是 MS+6-BA（1.01 mg/L）+ IAA（0.55 mg/L）+ AgNO3（1.1026 mg/L）。王萍等[27]選取黃瓜‘津研4號’的子葉節(jié)作為實(shí)驗(yàn)材料誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基中添加 1～2 mg/L6-BA+0.5 mg/L ABA+4 mg/L KT（0.05 mg/L IAA）有利于芽分化， 添加2 mg/L 6-BA+0.025 mg/L IAA+4 mg/LKT可促進(jìn)芽的伸長。趙雋等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TDZ可以提高芽的誘導(dǎo)率。李建欣等[28]在MS培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L的BA后，黃瓜子葉再生苗的誘導(dǎo)率有所提升?；诖耍趯Σ煌蛐忘S瓜開展離體培養(yǎng)時(shí)，需設(shè)置多種激素種類以及不同的濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，以便選出最佳的激素組合。

5 其他培養(yǎng)基成分對黃瓜組織離體培養(yǎng)的影響

有機(jī)碳源既能供應(yīng)能源，又可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對培養(yǎng)結(jié)果影響顯著。在黃瓜單倍體培養(yǎng)方面，蔗糖作為碳源時(shí)的誘導(dǎo)效果比較出色[29]。

黃瓜組織離體培養(yǎng)時(shí)，外植體能夠產(chǎn)生眾多的乙烯，過量的乙烯會抑制芽的誘導(dǎo)，加入適量AgNO3可以推動不定芽的形成。李文璐等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)在黃瓜不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L AgNO3后明顯對黃瓜子葉節(jié)芽的再生有促進(jìn)作用，不添加AgNO3只加6-BA時(shí)，外植體出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。曹利仙等[30]梅茜等[31]在黃瓜子葉離體培養(yǎng)研究中也都發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加適量的AgNO3能極顯著促進(jìn)芽的再生。通常認(rèn)為Ag＋是乙烯合成的抑制劑，在培養(yǎng)基中加入AgNO3 能夠降低乙烯的合成量。也有觀點(diǎn)認(rèn)為Ag＋會競爭性的作用于乙烯的受體蛋白，進(jìn)而阻止或減輕乙烯的有害影響。

6 其他因素對黃瓜組織離體培養(yǎng)的影響

黃瓜離體培養(yǎng)中，胚狀體的誘導(dǎo)還受多種環(huán)境及生理因素的影響。苗齡和苗態(tài)對黃瓜組織離體培養(yǎng)有非常重要的影響。黃瓜幼苗在不同生長發(fā)育時(shí)期，其生長狀態(tài)、生理形態(tài)以及內(nèi)源激素水平存在顯著差異，這會直接作用于外植體離體分化的能力。所以，挑選合適苗齡的外植體是實(shí)現(xiàn)高頻率再生率的重要基礎(chǔ)。蘇華等[33]研究發(fā)現(xiàn)，幼年植株的花藥對誘導(dǎo)的反應(yīng)能力較強(qiáng)。張衛(wèi)華等[33]通過研究發(fā)現(xiàn)，苗齡為2 d的黃瓜子葉節(jié)胚狀體再生能力突出，隨著苗齡增長，再生頻率大幅下降。別蓓蓓等[34]對不同黃瓜苗態(tài)在黃瓜子葉節(jié)離體再生培養(yǎng)上的影響展開研究，得出剛脫離種殼的子葉胚狀體誘導(dǎo)率高達(dá)100%的結(jié)論，且每個(gè)外植體再生芽可達(dá)4.13個(gè)。

7 討論與展望

7.1 討論

黃瓜組織離體培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的研究，已經(jīng)日漸成熟，在此基礎(chǔ)上開展轉(zhuǎn)基因研究、突變體篩選、單倍體育種等已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。但還存在一些問題，如黃瓜組織離體培養(yǎng)技術(shù)的基因型壁壘。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從分子和細(xì)胞水平探討基因型導(dǎo)致誘導(dǎo)率差異存在的本質(zhì)原因，從而克服基因型障礙，提高再生植株的誘導(dǎo)率是今后研究的方向。

7.2 展望

黃瓜組織離體培養(yǎng)結(jié)合生物技術(shù)創(chuàng)新黃瓜種質(zhì)資源，它使常規(guī)育種方法在黃瓜品種改良中無法解決的問題得以解決，這將加快黃瓜品種的選育進(jìn)程。對黃瓜品種改良上定會有前所未有的發(fā)展，為社會發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。

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