果梨多酚氧化酶特性及抑制劑研究

摘要：梨汁褐變會(huì)導(dǎo)致其色澤、風(fēng)味與狀態(tài)等品質(zhì)受到影響。本文以延邊蘋果梨為原材料，采用丙酮粉法從蘋果梨中提取多酚氧化酶，研究了底物濃度、pH值與溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響，并測定了不同濃度Vc、檸檬酸和蕎麥提取物對(duì)多酚氧化酶的抑制效果，結(jié)果表明：酶與底物最適比例為0.01 mL酶+0.18 mL底物，最適pH值6.4，最適溫度為25 ℃。檸檬酸、Vc和蕎麥提取物濃度分別在0.005 g/l、0.2 g/l、0.05 g/l時(shí)，抑制效果最好。

關(guān)鍵詞：蘋果梨汁；褐變；多酚氧化酶

在果蔬的儲(chǔ)藏、加工過程中容易發(fā)生褐變，根據(jù)發(fā)生機(jī)理不同包括酶促褐變或非酶促褐變[1]。酶促褐變是指多酚氧化酶（PPO）與多酚類物質(zhì)和氧氣接觸，酚類物質(zhì)被氧化成羥基醌，羥基醌易聚合成黑色素物質(zhì)，使果汁顏色加深從而引起褐變[2]。行業(yè)內(nèi)主要根據(jù)酶促褐變的發(fā)生機(jī)制，應(yīng)用物理或化學(xué)手段尋找抑制方法，常用化學(xué)抑制劑有二氧化硫、亞硫酸鹽、L-半胱氨酸等，例如亞硫酸鹽通過阻止發(fā)生美拉德反應(yīng)從而抑制褐變，但是因?yàn)榛瘜W(xué)抑制劑的殘毒性，為避免環(huán)境污染從而限制用量，物理手段有降低溫度、改變pH值、降低果汁成品濃度等方法[3]。

隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，梨果消費(fèi)形式種類日益增加，對(duì)梨汁加工的研究方面逐漸深化[4]。褐變大大損害了果汁加工的商業(yè)價(jià)值[5]。本實(shí)驗(yàn)探討了幾種褐變抑制劑對(duì)蘋果梨中多酚氧化酶的影響，意在確定多酚氧化酶的最適宜生理反應(yīng)條件并篩選出對(duì)蘋果梨褐變效果作用最好的抑制劑，為蘋果梨汁的加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果梨采購于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場，產(chǎn)地為吉林省延邊自治州。蘋果梨大小均勻，色澤良好，外觀完整且無機(jī)械外傷。

1.2 方法

1.2.1 PPO提取

采用丙酮粉法。取蘋果梨果肉樣品40 g，加入預(yù)冷的丙酮液研磨，抽濾制成干燥酶粉。加入PBS緩沖液（pH值6.8）20 mL，在4 ℃下離心（4 000 r/min）30 min，取上清液為PPO粗酶液[6]。

1.2.2 PPO活性測定

采用比色法測定。將0.01 mL酶液、0.01 mL水，加入0.18 mL鄰苯二酚溶液（pH值6.8）中。測定吸光度的變化，波長420 nm。每隔30 s記錄一次，共記錄20 min。吸光度變化0.001mol/min為一個(gè)PPO酶活性單位[7]。

1.2.3 最適酶量與底物濃度比例的確定

在室溫（20 ℃）下，將pH值6.8的PBS緩沖液0.01 mL和粗酶液0.01、0.02、0.03、0.04 mL，再加入1 mL鄰苯二酚溶液（濃度分別為0.015、0.016、0.017、0.018M）中，方法同1.2.2，測定不同底物濃度下的PPO活性。

1.2.4 PPO最適pH值確定

配制不同pH值的PBS緩沖液，取粗酶液0.01 mL、0.02 M鄰苯二酚溶液0.18 mL分別加入不同pH值的磷酸緩沖液0.01 mL，測定吸光度值，波長420 nm下[8]。以不加粗酶液的不同pH值反應(yīng)液做對(duì)照，測定方法同1.2.3。

1.2.5 PPO最適反應(yīng)溫度確定

在pH值6.8下，將0.02 M鄰苯二酚溶液0.18 mL、酶液0.01 mL與水0.01 mL混合。在不同溫度（25～60 ℃，梯度為5 ℃）中分別水浴4 min后加入三氯乙酸，冷卻至室溫，測定420 nm吸光度值。

1.2.6 不同抑制劑對(duì)PPO活性影響

根據(jù)不同抑制劑的抑制原理，試驗(yàn)選用檸檬酸、抗壞血酸、蕎麥提取物這三種抑制劑。用pH值6.8磷酸緩沖液配制濃度為0.005 g/l、0.05 g/l、0.1 g/l、0.2 g/l、0.5g/l的抑制劑溶液。在20 ℃條件下，將0.01 mL酶液、0.01 mL抑制劑溶液加入0.02 M鄰苯二酚溶液0.18 mL中， 迅速混勻后，測定PPO的活性方法同2.2.2。

抑制率計(jì)算方法：抑制率（%）=［（對(duì)照酶活-加入抑制劑后酶活）/對(duì)照酶活］×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系的最適底物濃度

不同粗酶液添加量與底物濃度對(duì)蘋果梨PPO活性影響見圖1。圖示表明，吸光值隨酶反應(yīng)時(shí)間的變化均符合標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)變化規(guī)律，呈拋物線上升趨勢。酶的反應(yīng)速率與酶和底物接觸面積等因素有關(guān)，而如何選擇最適底物濃度是酶促反應(yīng)關(guān)鍵。通常酶隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，底物逐漸減少，酶促反應(yīng)速率逐漸減慢。而將整個(gè)酶促反應(yīng)時(shí)間作為計(jì)算酶活時(shí)會(huì)比實(shí)際值小。圖1曲線表明，PPO粗酶液在開始反應(yīng)的前四分鐘酶與底物存在一定的線性關(guān)系，斜率代表酶促反應(yīng)的酶活，R2可以作為衡量酶促反應(yīng)的好壞。在不同體積粗酶液和不同濃度的底物（0.01 mL酶液+0.018 M底物、0.02 mL酶液+0.017 M底物、0.03 mL酶液+0.016 M底物、0.04 mL酶液+0.015 M底物）體系中，在0～4 min的回歸方程率分別為：0.1958、0.0556、0.0647、0.0804。R2分別為：0.9985、0.9455、0.9462、0.9102。綜上所述，酶活最大、酶促反應(yīng)速率最大的是當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.015 M時(shí)，加入0.01 mL粗酶液的反應(yīng)體系。本試驗(yàn)選用該體系作為酶促反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)體系。

2.2 PPO的最適pH值

pH值對(duì) PPO酶活的影響見圖2。pH值2.8～5.8范圍內(nèi)時(shí)蘋果梨肉PPO活性隨著pH值的升高而上升， pH值6.1時(shí)，酶活稍有下降，而后又繼續(xù)上升，在pH值6.4時(shí)酶活性達(dá)到最高；pH值2.8的PPO相對(duì)活性僅為pH值6.4的28.94%；但pH值在6.4～6.6時(shí)，酶活性隨著pH值的升高或下降，pH值6.6時(shí)PPO相對(duì)活性僅為pH值6.4的55.26%；pH值進(jìn)一步上升，pH值6.6～7.0時(shí)，酶活隨著pH值的升高而上升，并在pH值7.0達(dá)到另一高峰，為pH值6.4的86.84%，隨后開始下降；pH值7.3～7.5酶活小幅度上升，而后直線下降，pH值8.0酶活下降至最低值（0%），PPO幾乎喪失活力。其原因可能是強(qiáng)酸性條件下，PPO的輔基Cu2+被解離，從而失去活性。在強(qiáng)堿條件下，Cu2+轉(zhuǎn)化為Cu（OH）2沉淀，脫離了酶蛋白，也會(huì)失去活性[9]；另外由于pH值對(duì)底物的解離使之不能被催化也是原因之一。由此可見pH值對(duì)PPO酶活性有一定影響。從整個(gè)圖表來看，在pH值6.4和7.0時(shí)分別出現(xiàn)較高的酶活值，使圖表呈現(xiàn)出“雙峰”現(xiàn)象，雙峰曲線可能是由于蘋果梨中的多酚氧化酶是復(fù)合酶，各個(gè)酶的最適pH值。根據(jù)圖表2判斷，PPO的最適pH值為6.4。

2.3 PPO的最適反應(yīng)溫度

溫度對(duì) PPO 酶活的影響結(jié)果如圖3。由于PPO酶活受pH值變化影響的圖表出現(xiàn)了“雙峰”的現(xiàn)象，在研究最適反應(yīng)溫度時(shí)，把pH值條件分別設(shè)定為6.4和7.0，觀察其影響。在兩個(gè)不同pH值條件下，溫度變化趨勢基本相同。溫度為25-45℃時(shí)，pH值6.4時(shí)PPO酶活隨溫度下降而緩慢減?。欢鴓H值7.0時(shí)，酶活隨溫度下降的幅度要更大一些。在超過40 ℃時(shí)，兩個(gè)不同pH值條件下，酶活均急劇下降至負(fù)值，完全抑制酶促化。由圖3可知，反應(yīng)PPO的最適溫度為25 ℃。溫度對(duì)PPO酶活的影響是雙重的。在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，隨著溫度升高加快PPO酶催化反應(yīng)速度，但超過一定閾值會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變性，所以溫度對(duì)PPO的影響是由以上兩個(gè)方面疊加的效果。高溫酶失活主要因?yàn)槊富钚圆课蝗S結(jié)構(gòu)的完整性與穩(wěn)定性遭到破壞。

2.4 不同濃度抑制劑對(duì)PPO活性影響

2.4.1 檸檬酸對(duì)褐變反應(yīng)的抑制作用

檸檬酸對(duì)PPO酶活性的抑制率見圖4。由圖4可知，隨著檸檬酸濃度的增加，PPO酶活性的抑制率呈現(xiàn)先下降后上升再下降趨勢。原因可能是PPO受pH值影響。PPO酶對(duì)pH值較為敏感，檸檬酸含量升高，pH值隨之下降，PPO酶中的銅被解離從而失去活性，pH降低到一定程度造成蛋白質(zhì)變性也是酶失去活性的一個(gè)原因，一定酸濃度后PPO酶活性抑制率呈線性下降趨勢。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，檸檬酸抑制 PPO酶活性的最適濃度為0.005 g/l。

2.4.2 Vc對(duì)褐變反應(yīng)的抑制作用

Vc對(duì)PPO酶活性的抑制率見圖5。由圖5可知，抗壞血酸對(duì)PPO酶活性具有較好的抑制作用，抑制率均在89%以上。Vc對(duì)PPO酶活性的抑制率隨濃度增加，先下降后上升。反應(yīng)伊始，抑制作用下降的原因可能是由于抗壞血酸極易氧化分解。當(dāng)濃度為 0.2 g/l時(shí)，抑制率為100%。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，Vc抑制 PPO 酶活性的最適濃度為0.2 g/l。

2.4.3 蕎麥提取物對(duì)褐變反應(yīng)的抑制作用

蕎麥提取物對(duì) PPO 酶活性的抑制率見圖5。由圖5可知，蕎麥提取物對(duì)PPO酶活性具有較好的抑制作用，抑制率均在85%以上。蕎麥提取物對(duì)PPO酶活性的抑制率隨濃度增加，先上升后下降。其原因可能是蕎麥提取物里含多酚類物質(zhì)，隨蕎麥提取物濃度增大，酶促反應(yīng)體系中多酚類底物濃度也增大，反應(yīng)力度增強(qiáng)，從而降低了抑制作用。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，蕎麥提取物抑制 PPO 酶活性的最適濃度為0.05 g/l。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先研究了蘋果梨多酚氧化酶的底物濃度、pH值和反應(yīng)溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響，在此基礎(chǔ)上研究了不同濃度抑制劑（Vc、檸檬酸和蕎麥提取物）對(duì)多酚氧化酶的抑制效果。結(jié)果表明：在0.01 mL酶液中加入0.018 M底物濃度的體系，酶活最高；酶促反應(yīng)的最適pH值6.4，反應(yīng)最適溫度為25 ℃。對(duì)蘋果梨PPO酶活性抑制作用由強(qiáng)到弱的抑制劑依次是蕎麥提取物、Vc、檸檬酸。這三種抑制劑抑制蘋果梨PPO酶活性的最佳濃度分別為0.05 g/l、0.2 g/l、0.005 g/l，在該濃度下PPO活性抑制率分別為85%、89%、76%。

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