罌粟STORR基因表達(dá)分析及載體構(gòu)建

摘要：為創(chuàng)新罌粟種質(zhì)資源，加快單一生物堿種質(zhì)資源的創(chuàng)制。本文通過對罌粟生物堿合成途徑的STORR基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，并利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因編輯載體，為創(chuàng)制單一生物堿種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：罌粟；STORR基因；表達(dá)分析；載體構(gòu)建

罌粟是一年生或多年生草本植物，其所含生物堿約100種，目前分離鑒定的有20余種，其中嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁、罌粟堿五種生物堿為罌粟主要的生物堿，而不同罌粟資源的生物堿含量存在顯著差異。2018年葉凱團(tuán)隊通過全基因組測序，明確了罌粟中嗎啡、可待因等生物堿合成途徑，為深入研究罌粟生物堿合成機制奠定了基礎(chǔ)。

嗎啡是異喹啉類生物堿，是罌粟中含量最多的生物堿。研究發(fā)現(xiàn)，罌粟中各類生物堿合成代謝較為復(fù)雜，特別是BIAs生物堿合成過程[1]。嗎啡的生物合成需經(jīng)多步反應(yīng)，蒂巴因、可待因是嗎啡合成途徑中的中間產(chǎn)物，且罌粟生物堿合成分支路徑（圖1）表明，細(xì)胞色素P450單加氧酶和醛-酮還原酶的融合蛋白（STORR）是罌粟中嗎啡、可待因等生物堿代謝途徑的關(guān)鍵蛋白，調(diào)控STORR基因在代謝途徑上的表達(dá)，可引起嗎啡、可待因和蒂巴因含量發(fā)生改變。Guo等[2]、Yang等[3]通過研究罌粟全基因組重復(fù)，BIAs代謝途徑及嗎啡合成通路中的可待因酮還原酶（COR）、可待因3-O-去甲基化酶（CODM）和6-O-去甲基化酶（T6ODM）三個關(guān)鍵酶在罌粟基因組中的重復(fù)、位置和序列一致性，以及BIA基因簇的全基因組重復(fù)事件，進(jìn)一步證實了STORR基因融合在罌粟生物堿合成中的關(guān)鍵作用。

CRISP/Cas9基因編輯技術(shù)是目前基因功能研究和遺傳疾病治療等生命科學(xué)領(lǐng)域最前沿的基因編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于植物現(xiàn)代生物技術(shù)中，相比于傳統(tǒng)育種，其耗時短，工作量小的特點，極大地縮短了新品種選育的時間與進(jìn)程，為植物基因功能研究及定向育種提供了方法，是植物遺傳改良中的有效技術(shù)手段。2016年，Alagoz Y等[4]利用CRISPR-SpCas9技術(shù)敲除了罌粟中的4’OMT2基因，使嗎啡、蒂巴因等芐基異喹啉生物堿含量顯著降低，表明CRISPR-SpCas9基因組編輯方法可有效地影響罌粟中代謝物積累水平，為罌粟生物堿代謝調(diào)控研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

目前，罌粟中含有嗎啡、可待因等多種生物堿，提取成本較高，單一生物堿種質(zhì)資源缺乏，為加快單一生物堿種質(zhì)資源創(chuàng)制，本研究擬通過CRISP/Cas9基因編輯技術(shù)，定向編輯罌粟STORR基因，為研究單一生物堿種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用兩種罌粟資源種子，代號分別為Z1和G1。挑選顆粒飽滿的Z1和G1種子若干，進(jìn)行田間試驗，生長至膨大期進(jìn)行取樣。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取

選取生長良好的Z1和G1罌粟，按照TRIZOL法提取葉片組織的總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA。以提取的總RNA為模板，按照Hiscript?ⅡQ RT

Super Mix for qPCR（+gDNA Wiper）（Vazyme # R223-01）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，測定其濃度后稀釋，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 罌粟STORR基因表達(dá)分析

利用AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix（Vazyme # Q111-02/AA）對罌粟不同品種、不同組織部位進(jìn)行定量分析。分別提取罌粟Z1和G1的根、莖、葉和蒴果的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量，STORR基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計算，不同罌粟資源中各組織部位的STORR基因的相對表達(dá)量差異利用獨立樣本t檢驗分析。

1.2.3 罌粟STORR基因引物設(shè)計與實時熒光定量

依據(jù)實時熒光定量PCR引物設(shè)計原則，設(shè)計罌粟STORR基因qPCR引物，STORR-F：5’-ATCAAGTGGAGATGAGCCCG-3’；STORR-R，5’-CCTCAGAACCCAAAACTGCA-3’，進(jìn)行q-PCR。以Actin為作為內(nèi)參：Actin-F，5’-TCTCAACCCAAAGGCTAATCG-3’；Actin-R，5’-CCCCAGAATCCAAGACAATACC-3’。實時熒光定量PCR的擴(kuò)增體系為：AceQ? qPCR SYBR? Green

Master Mix 5μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.6μL，共10μL。擴(kuò)增程序為：95℃5 min；95℃10s，58℃30s，共 40個循環(huán)；95℃15s，60℃1 min，95℃15s；40℃5 min。

1.3 CRISP-CAS9載體構(gòu)建

1.3.1 gRNA靶點序列設(shè)計

參照STORR基因片段，根據(jù)靶基因ORF序列及對應(yīng)DNA序列，以植物組織為模板，分別擴(kuò)增測序靶基因的mRNA和對應(yīng)DNA部分序列，確定第一外顯子所在區(qū)間，利用CRISPR/Cas9靶點設(shè)計工具設(shè)計靶點序列。按照tRNA策略合成雙gRNA靶點表達(dá)框。

1.3.2 基因擴(kuò)增

以合成基因的亞克隆載體為模板，以引物STORR-BsaI-F：5’-GTCGAAGTAGTGATTGAACAAAGCACCAGTGGTCTAG-3’，STORR-BsaI-R：5’-TTCTAGCTCTAAAACACTGCTCACAACGAGAGTTC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：ddH2O 17μL，2×Phanta Ma ×Buffer 25μL，dNTP Mix（10 mM each）1μL，模板DNA 2μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease（1U/μL）1μL，共50μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃30s；（95℃15s，退火溫度45～55℃15s，延伸72℃1 min）×39循環(huán)；最后延伸72℃，5 min。

1.3.3 載體構(gòu)建

用BsaI單酶切pKSE401載體質(zhì)粒構(gòu)建載體。酶切反應(yīng)體系為：3.1 Buffer 5μL，載體質(zhì)粒3μL，BsaI 1μL，加ddH2O至50μL。將酶切產(chǎn)物純化后與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照Vazyme公司ClonExpress-Ⅱ

One Step Cloning Kit試劑盒進(jìn)行重組連接反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行培養(yǎng)，挑取PCR陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，同時隨機挑選1個陽性菌落的擴(kuò)增產(chǎn)物送測序。擴(kuò)增和測序引物為插入目的基因兩側(cè)的載體序列，分別為：U626p-F：5’-AAGCTTCGACTTGCCTTCCG-3’，U626P-R：5’-AAGCTTATTGGTTTATCTCA-3’。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用WPS Excel 2016和SPSS20統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 STORR基因組織特異性表達(dá)

以膨大期的罌粟根、莖、葉、果為實驗材料，利用q-PCR對根、莖、葉、果生物堿合成關(guān)鍵基因牛心果堿差向異構(gòu)酶（STORR）進(jìn)行組織特異性分析，結(jié)果如圖2所示：STORR基因在罌粟不同資源的根、莖、葉、果中均有表達(dá)，且莖中STORR基因的表達(dá)量最高，葉片中表達(dá)量最低。

2.2 不同資源STORR基因的表達(dá)分析

由圖3可知，不同罌粟資源各組織部位的STORR基因的相對表達(dá)量存在顯著差異，相對表達(dá)量依次為莖〉根〉蒴果〉葉，其中G1莖中的STORR基因較Z1相對表達(dá)量平均上調(diào)53.07%，根平均上調(diào)77.04%。

2.3 罌粟CRISP/Cas9載體構(gòu)建結(jié)果

由圖4可知，STORR基因雙gRNA合成序列與CRISPR/Cas9載體序列比對結(jié)果正確，表明STORR基因CRISPR/Cas9載體構(gòu)建成功，可用于進(jìn)行后續(xù)基因編輯試驗。

3 結(jié)論

STORR基因罌粟嗎啡、可待因、蒂巴因等生物堿合成的關(guān)鍵基因，調(diào)控嗎啡等生物堿的生物合成。本試驗通過對STORR基因在罌粟不同資源中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明，膨大期時，罌粟STORR基因在莖中的含量顯著高于根、葉和蒴果，其次是根，說明罌粟生物堿合成的主要部位是根和莖，通過運輸轉(zhuǎn)移至蒴果果殼積累。并且STORR基因作為嗎啡、可待因等生物堿合成的上游基因，可調(diào)控代謝通路下游COR、CODM和T6ODM等生物堿合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而影響嗎啡、可待因、蒂巴因等生物堿的合成及含量。同時，通過構(gòu)建罌粟STORR基因CRISPR/Cas9基因編輯載體，可以預(yù)測能更好地定向敲除罌粟中STORR基因獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而創(chuàng)制出罌粟單一生物堿新品種，為研究罌粟專一生物堿種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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