梵凈山同域分布黔金絲猴和藏酋猴腸道寄生蟲比較研究

摘 要 腸道寄生蟲可作為反映宿主生存狀態(tài)的指標(biāo)，為了解梵凈山同域分布黔金絲猴（Rhinopithecus brelichi）和藏酋猴（Macaca thibetana）的腸道寄生蟲組成，基于18SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采集的42份冬季糞便樣本進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：共獲得44個(gè)屬于寄生蟲類群的ASVs，歸屬于10門26屬；二者的腸道寄生蟲主要由線蟲動(dòng)物門（Nematoda）組成，其中，鞭蟲屬（Trichuris）線蟲為黔金絲猴的主要寄生類群，鞭蟲屬和宮脂線蟲屬（Hysterothylacium）線蟲為藏酋猴的主要寄生類群；藏酋猴腸道寄生蟲α多樣性（Shannon、Simpson和Richness指數(shù)）均高于黔金絲猴，但未達(dá)到顯著水平，β 多樣性分析發(fā)現(xiàn)二者腸道寄生蟲組成差異顯著（R = 0. 406， P lt; 0. 05）；PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析表明二者腸道寄生蟲功能基因在Level 1水平上主要與生物合成、前體代謝物和能量的產(chǎn)生有關(guān)，且二者差異顯著（P lt; 0. 05），在Level 2水平上與28類代謝通路相關(guān)，其中6類具有顯著性差異；代謝通路物種組成差異分析表明，在屬級(jí)分層上有14屬與28類Level 2代謝通路相關(guān)聯(lián)，每條代謝通路可由多種物種共同協(xié)作完成，并發(fā)揮不同程度的作用。本研究初步了解了梵凈山同域分布黔金絲猴和藏酋猴的腸道寄生蟲組成和功能，可為后續(xù)研究腸道寄生蟲對(duì)宿主的影響及野生和圈養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的保護(hù)提供思路。

關(guān)鍵詞：黔金絲猴；藏酋猴；腸道寄生蟲；高通量測(cè)序；功能預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào)：Q958. 9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 04 - 0744 - 13

DOI：10.12375/ysdwxb.20240407

腸道寄生蟲是動(dòng)物賴以生存的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫疾病起著重要作用，可以作為宿主健康狀況的重要指標(biāo)［1］。腸道寄生蟲能夠在不殺死宿主的情況下有效地存活和繁殖，并保持它們?cè)谒拗髦欣^續(xù)繁殖的能力［2］。然而，大多數(shù)寄生蟲感染后可能導(dǎo)致宿主生理變化、營(yíng)養(yǎng)紊亂［3］，有些寄生蟲甚至可以感染動(dòng)物的內(nèi)臟和血液，導(dǎo)致動(dòng)物消瘦、腹瀉［4］，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致宿主自然流產(chǎn)、先天畸形甚至死亡［5］。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物是人類進(jìn)化史上親緣關(guān)系最近的類群，在認(rèn)知能力、繁殖和生育等方面與人類具有高度同源性［6?7］，同時(shí)也是人類病原體（包括致病性病毒、細(xì)菌和寄生蟲）的潛在宿主，因此比其他動(dòng)物具有更高的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)［8］?，F(xiàn)有研究對(duì)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腸道寄生蟲的情況了解較少，且與腸道寄生蟲有關(guān)的研究主要限于圈養(yǎng)動(dòng)物［9?10］，而由腸道寄生蟲引起的傳染性疾病可能對(duì)瀕危野生非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的保護(hù)構(gòu)成重大威脅，甚至影響其生存和繁殖，同時(shí)攜帶的某些寄生蟲類群可能具有潛在的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，可傳播給共享同一棲息地的人，威脅人體健康［11?12］。傳統(tǒng)的腸道寄生蟲鑒定主要采用沉淀法、漂浮法和染色法等方法處理糞便樣本，通過顯微鏡直接觀察直徑較大的寄生蟲蟲卵或卵囊，進(jìn)而確定寄生蟲的形態(tài)和感染率［13?15］，這些方法具有簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，但在很大程度上依賴寄生蟲的形態(tài)大小，只有囊、卵和成蟲才能被識(shí)別［16］。高通量測(cè)序技術(shù)又被稱為“下一代”測(cè)序技術(shù)，一次可以同時(shí)對(duì)幾十萬到幾百萬的DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，使得對(duì)特定物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全面地分析成為可能［17］。本研究主要對(duì)18S rRNA基因的V9高度可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增來對(duì)黔金絲猴（Rhinopithecus brelichi）和藏酋猴（Macacathibetana）的腸道寄生蟲進(jìn)行鑒定。該技術(shù)已被用于川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）、赤褐倭狐猴（Microcebus rufus）和西部大猩猩（Gorilla gorilla）等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物糞便腸道寄生蟲的檢測(cè)中［18?20］。

黔金絲猴是中國(guó)最瀕危的靈長(zhǎng)類動(dòng)物之一，被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物［21］，僅分布于梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（以下簡(jiǎn)稱“梵凈山保護(hù)區(qū)”）內(nèi)［22?23］，而藏酋猴是中國(guó)分布最廣的靈長(zhǎng)類動(dòng)物之一，在梵凈山保護(hù)區(qū)內(nèi)廣域分布，藏酋猴環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，生活在多種棲息地類型中［24?25］。在梵凈山保護(hù)區(qū)內(nèi)二者棲息地空間重疊度極高，且冬季棲息地重疊更加明顯，這與食物資源的可獲得性有關(guān)，冬季食物資源比較匱乏，二者的食物競(jìng)爭(zhēng)可能加?。?6］。Yue et al.［27］的研究表明同域分布的這兩種靈長(zhǎng)類，藏酋猴具有更寬的食物生態(tài)位，且在冬季二者的食物生態(tài)位幾乎完全重疊。由于飲食結(jié)構(gòu)相似，二者會(huì)通過競(jìng)爭(zhēng)來獲得資源和空間，相比于黔金絲猴，藏酋猴種群數(shù)量更多、活動(dòng)范圍更廣，這使得藏酋猴能獲得更多的資源和空間。有研究發(fā)現(xiàn)，野生藏酋猴理毛行為時(shí)間的長(zhǎng)短影響不同腸道寄生蟲的感染率［28］。在峨眉山景區(qū)采集的藏酋猴糞便腸道寄生蟲以筒線蟲屬（Gongylonema）和內(nèi)阿米巴屬（Ent?amoeba）為主［29］，在黃山生態(tài)旅游區(qū)采集的藏酋猴糞便中，美麗筒線蟲（Gongylonema pulchrum）感染率最高［30］，表明不同棲息地分布的藏酋猴腸道寄生蟲種類可能存在一定相似性。目前，關(guān)于黔金絲猴腸道寄生蟲的研究主要集中在圈養(yǎng)種群，研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)分布的3種金絲猴在圈養(yǎng)條件下對(duì)胃腸道寄生蟲敏感，尤其以毛首屬線蟲（Trichuris sp.）的感染率最高［31］。Wenz-Mücke et al.［2］將接觸人類環(huán)境的食蟹獼猴（Macaca fascicularis）種群與自然環(huán)境中的森林種群的腸道寄生蟲進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與人類接觸頻率更高的食蟹獼猴種群中糞類圓線蟲（Strongyloidesstercoralis）和單睪吸蟲屬（Haplorchis sp.）的感染率更高。動(dòng)物腸道寄生蟲種類可能與動(dòng)物飲食結(jié)構(gòu)、物種種類、棲息地和動(dòng)物行為等息息相關(guān)。目前關(guān)于同域物種腸道寄生蟲的研究較少，本研究旨在通過高通量測(cè)序技術(shù)確定共享?xiàng)⒌厍鸾z猴和藏酋猴的腸道寄生蟲組成情況，有助于對(duì)兩種動(dòng)物健康狀況和疾病風(fēng)險(xiǎn)的理解，對(duì)圈養(yǎng)和野生非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1. 1 研究區(qū)域和糞便收集

梵凈山保護(hù)區(qū)（27°49′50″—28°1′30″ N，108°45′55″—108°48′30″ E）位于貴州省東北部，武陵山脈主峰。保護(hù)區(qū)內(nèi)動(dòng)植物資源極其豐富，為多種珍稀瀕危動(dòng)植物提供了優(yōu)良的棲息環(huán)境，是黔金絲猴野外種群的唯一棲息地［23］。2022年10月，采集位于梵凈山東北部的黔金絲猴和藏酋猴種群的新鮮糞便，采集時(shí)佩戴一次性醫(yī)用手套，用一次性無菌鑷和解剖刀剔除糞便樣本表面的泥土、植物枝葉等附著物，選取無污染樣本的中間部分裝入50 mL凍存管中，標(biāo)記后放入密封袋內(nèi)，并記錄現(xiàn)場(chǎng)地理信息（圖1）。樣本采集完后置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

在梵凈山保護(hù)區(qū)共收集45份糞便樣本，采用基于線粒體COI基因的DNA 條形碼技術(shù)對(duì)糞便樣本進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)有31份屬于黔金絲猴，11份屬于藏酋猴，3 份為無效樣本。使用OMEGA Soil DNA Kit（D5625-01）（Omega Bio-Tek，Norcross，USA）試劑盒提取樣本總DNA，并用0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分子大小，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。采用以下引物對(duì)18S rRNA 基因的V9 高度可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)長(zhǎng)度200 ～ 300 bp，PE250測(cè)序，引物序列為Euk1391F（5′-GTACACACCGCCCGTC-3′），EukBR（5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′）。PCR 擴(kuò)增體系為Q5 high-fidelity DNA polymerase0. 25 μL，5 × Reaction Buffer 5. 00 μL，5 × High GCBuffer 5. 00 μL，dNTP（10 mmol/L）2. 00 μL，模板DNA 2. 00 μL（以ddH2O為空白對(duì)照），引物各1. 00 μL，ddH2O 8. 75 μL。擴(kuò)增（PCR 儀：ABI GeneAmp?2720）程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳后送至上海派森諾生物科技有限公司（Illu?mina NovaSeq平臺(tái)）完成測(cè)序。

1. 3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與注釋

采用Illumina 平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行雙端（paired-end）測(cè)序，得到數(shù)據(jù)使用QIIME2 2019. 4版本（https：//docs. qiime2. org/2019. 4/tutorials/）進(jìn)行分析。具體分析流程：（1）原始序列數(shù)據(jù)使用demux插件進(jìn)行解碼處理，qiime cutadapt trim-paired 切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；（2）用qiimedada2 denoise-paired調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接和去嵌合體，按照100%的序列相似度對(duì)獲得的序列進(jìn)行聚類，生成擴(kuò)增子序列變體特征序列（ampli?con sequence variants，ASVs）以及豐度數(shù)據(jù)表格；（3）采用nt 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BROCC 算法［32］，首先使用blastn，將序列與nt數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，再調(diào)用brocc. py腳本，依據(jù)推薦的參數(shù)獲取注釋信息，獲取每個(gè)ASVs 所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。PICRUSt2能在多個(gè)功能數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)18S rRNA基因序列，本研究選擇MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果，獲得腸道寄生蟲基因代謝通路豐度表。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

使用獲得的ASVs物種注釋豐度表，統(tǒng)計(jì)各ASVs注釋結(jié)果在每個(gè)樣本中對(duì)應(yīng)的豐度信息，并且按照最小樣本序列數(shù)對(duì)樣本序列抽平，然后使用派森諾基因云平臺(tái)（https：//www. genescloud. cn/home）繪制所有樣本的Goods_coverage指數(shù)和Shannon index稀疏曲線，以確定糞便樣本測(cè)序相對(duì)充分；使用美吉生物云平臺(tái)（https：//cloud. majorbio. com/page/tools.html）繪制二者門水平上的餅圖，屬水平和種水平上的豐度Circos 圖。使用QIIME2 軟件計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson和Pielou指數(shù)，以分析腸道寄生蟲組成多樣性，Origin 軟件繪制箱線圖，通過Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)和Dunn-test作為事后檢驗(yàn)，驗(yàn)證差異的顯著性。采用主坐標(biāo)分析（principal coordinatesanalysis，PCoA）和非度量多維尺度分析（non-metricmultidimensional scaling，NMDS）開展不同組間的β多樣性分析，以比較二者腸道寄生蟲組成的差異性?；贐ray-Curtis相似性距離算法，采用相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）進(jìn)行組間差異性檢驗(yàn)?；贛etaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得MetaCyc腸道寄生蟲基因功能豐度信息，進(jìn)行二者代謝功能相關(guān)的組間分析；根據(jù)adj P value 和log2（fold change）篩選組間差異代謝通路，并對(duì)代謝通路上的物種組成進(jìn)行分析。PCoA、NMDS和KEGG差異柱狀圖均使用聯(lián)川生物云平臺(tái)（https：//www. omicstudio. cn/home）繪制。

2 結(jié)果與分析

2. 1 樣本序列統(tǒng)計(jì)分析

42份糞便樣本原始序列經(jīng)質(zhì)控后得到有效序列3 991 238 條，其中黔金絲猴2 914 959 條，藏酋猴1 076 279條。所有樣本的Goods_coverage稀疏曲線均變?yōu)橐粷u近線（圖2A），Shannon指數(shù)的稀疏曲線逐漸趨于平緩（圖2B），表明所有樣本的菌群多樣性已達(dá)到平臺(tái)期，黔金絲猴（RB）和藏酋猴（MT）糞便樣本菌群測(cè)序相對(duì)充分。將獲得的序列按100%的相似度進(jìn)行歸并，共獲得1 579個(gè)ASVs，黔金絲猴與藏酋猴樣本中分別鑒定出1 321個(gè)和516個(gè)ASVs（圖3A）。將獲得的1 579個(gè)ASVs去除不是寄生蟲的類群后，共有44 個(gè)ASVs 屬于寄生蟲類群，其中約70. 45%的ASVs由黔金絲猴特有，二者共有的ASVs為5個(gè)，占比約為11. 36%（圖3B）。

2. 2 腸道寄生蟲組成

對(duì)獲得的44個(gè)屬于寄生蟲類群的ASVs進(jìn)行不同分類水平鑒定，可劃分為10門26屬。在門水平上，藏酋猴共鑒定出4門，分別為線蟲動(dòng)物門（Nema?toda）、變形蟲門（Amoebozoa）、節(jié)肢動(dòng)物門（Ar?thropoda）和Colpodellidae，相對(duì)豐度分別為71. 07%、16. 90%、0. 83%和0. 08%（圖4A）；黔金絲猴共鑒定出10門，豐度較高的類群為線蟲動(dòng)物門（85. 45%）和變形蟲門（6. 05%），其他類群相對(duì)豐度均在5. 00%以下（圖4B）。在屬水平上（豐度小于0. 10%的類群被合并為others），藏酋猴共鑒定到9屬，其中鞭蟲屬（Trichuris）、宮脂線蟲屬（Hysterothylacium）、內(nèi)阿米巴屬、Hexatylus 和墊刃線蟲屬（Tylenchus）相對(duì)豐度較高；黔金絲猴共鑒定到23屬，其中鞭蟲屬、內(nèi)阿米巴屬、繞線屬（Plectus）、索線蟲屬（Mermis）和小桿屬（Oscheius）相對(duì)豐度較高（圖4C）。二者腸道寄生蟲存在共有屬，分別為宮脂線蟲屬、內(nèi)阿米巴屬、書虱屬（Liposcelis）、繞線屬、鞭蟲屬和墊刃線蟲屬。從種水平上看（豐度小于0. 1%的類群被合并為others），共有18種寄生蟲可鑒定到種水平，藏酋猴腸道寄生蟲以內(nèi)彎宮脂線蟲（Hysterothylacium aduncum）的豐度最高，其次為弓形墊刃線蟲（Tylenchus arcuatus）；黔金絲猴以Entamoeba cf. bovis 和小桿線蟲（Oscheiustipulae）豐度較高，其他類群豐度較低（圖4D）。

2. 3 腸道寄生蟲多樣性分析

根據(jù)黔金絲猴和藏酋猴腸道寄生蟲ASVs數(shù)量，對(duì)其進(jìn)行α 多樣性分析。如圖5A-D所示，藏酋猴腸道寄生蟲類群Shannon、Simpson和Richness指數(shù)均高于黔金絲猴腸道寄生蟲類群，但3種指數(shù)在二者間均無顯著差異性；而黔金絲猴的Chao1指數(shù)高于藏酋猴，但無顯著差異?；贐ray-Curtis距離矩陣的β 多樣性分析表明，PCoA分析解釋了二者腸道寄生蟲類群總變異的50. 67%，藏酋猴有6個(gè)樣本點(diǎn)與黔金絲猴樣本點(diǎn)明顯分開，二者腸道寄生蟲組成差異顯著（P lt; 0. 05，圖5E）；此外NMDS分析表明，Stress值為0. 195，小于0. 200，可較好地反映數(shù)據(jù)真實(shí)排列信息并準(zhǔn)確反映藏酋猴與黔金絲猴腸道寄生蟲類群組成的差異程度，其結(jié)果與PCoA分析結(jié)果一致（圖5F）。

2. 4 腸道寄生蟲功能富集差異分析

基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行腸道寄生蟲基因功能注釋分析可知，在Level 1水平上，二者腸道寄生蟲基因與5類代謝通路相關(guān)，其中有3類代謝通路具有顯著性差異。藏酋猴生物合成（biosynthesis）和降解/利用/同化（degradation/utilization/assimilation）的功能基因豐度顯著高于黔金絲猴，而前體代謝物和能量的產(chǎn)生（generation of precursor metabolite and energy）的功能基因豐度顯著低于黔金絲猴（圖6A）。在Level 2水平上，二者腸道寄生蟲基因與28類代謝通路相關(guān)，其中有6類代謝通路具有顯著性差異。藏酋猴次生代謝產(chǎn)物的生物合成（secondary metabolitebiosynthesis）、氨基酸降解（amino acid degradation）和無機(jī)養(yǎng)分代謝（inorganic nutrient metabolism）3 類功能基因的豐度顯著高于黔金絲猴，而核苷與核苷酸降解（nucleoside and nucleotide degradation）、電子轉(zhuǎn)移（electron transfer）和呼吸（respiration）3 類功能基因的豐度顯著低于黔金絲猴（圖6B）。生物合成是二者腸道寄生蟲基因最主要的功能（RB 豐度46. 83%，MT豐度51. 08%），主要集中在核苷和核苷酸生物合成（nucleoside and nucleotide biosynthesis）、氨基酸生物合成（amino acid biosynthesis）、輔因子、輔基、電子載體與維生素生物合成（cofactor， pros?thetic group， electron carrier， and vitamin biosynthe?sis）及碳水化合物生物合成（carbohydrate biosynthe?sis）等。

2. 5 代謝通路物種組成差異分析

為了解哪些物種編碼了這些具有功能潛能的基因，使用分層的樣本代謝通路豐度表進(jìn)行通路的物種組成分析。在屬級(jí)分層上，有14屬與二者的28類Level 2代謝通路相關(guān)聯(lián)，每條代謝通路可由多種物種共同協(xié)作完成。由圖7可知，在藏酋猴與黔金絲猴腸道中，豐度最高的鞭蟲屬線蟲與核苷和核苷酸生物合成、氨基酸生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 負(fù)載（tRNAcharging）、脂肪酸和脂質(zhì)降解（fatty acid and lipiddegradation）以及次生代謝產(chǎn)物的生物合成等代謝通路呈顯著負(fù)相關(guān)，而與豐度第二的宮脂線蟲屬線蟲呈顯著正相關(guān)。潛在致病性內(nèi)阿米巴屬線蟲與從CTP 生物合成嘧啶脫氧核糖核苷酸（pyrimidine de?oxyribonucleotides biosynthesis from CTP）、降解/利用/同化-其他、幾丁質(zhì)降解為乙醇（chitin degradation toethanol）和甲基酮生物合成（methyl ketone biosynthe?sis）4類代謝通路呈顯著正相關(guān)。豐度較低的類群書虱屬與多數(shù)代謝通路呈顯著負(fù)相關(guān)；雙核內(nèi)變形蟲屬（Dientamoeba）豐度與氨基酸降解代謝通路呈顯著負(fù)相關(guān)，與核苷和核苷酸降解代謝通路呈顯著正相關(guān)；Protacanthamoeba 豐度與乙醛酸循環(huán)（glyoxyl?ate cycle）代謝通路呈顯著負(fù)相關(guān)，與降解/利用/同化-其他代謝通路呈顯著正相關(guān)；Colpodella、鐵線蟲屬（Gordius）、桿咽屬（Rhabdolaimus）和Telorchis 等類群與不同代謝通路呈不同程度的相關(guān)性，但無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

3. 1 腸道寄生蟲組成與多樣性

腸道寄生蟲感染往往導(dǎo)致宿主免疫力下降、體質(zhì)量減輕，嚴(yán)重時(shí)甚至影響宿主生存和繁殖，使種群數(shù)量受到嚴(yán)重威脅［33］。黔金絲猴種群僅在梵凈山保護(hù)區(qū)內(nèi)分布，數(shù)量稀少，棲息地活動(dòng)范圍又與藏酋猴高度重疊，因此交叉感染寄生蟲的風(fēng)險(xiǎn)更高。本研究表明，在所有檢測(cè)樣本中，二者腸道寄生蟲主要由線蟲動(dòng)物門組成，其中鞭蟲屬線蟲為主要寄生類群，且在黔金絲猴腸道內(nèi)的豐度高于藏酋猴。二者腸道內(nèi)均存在的毛首鞭形線蟲（Trichuris trichiura），簡(jiǎn)稱鞭蟲，是金絲猴體內(nèi)常見且危害嚴(yán)重的一種寄生蟲［34］。鞭蟲主要通過口服食物、水和土壤中存在的具有傳染性的蟲卵進(jìn)行傳播，在各種哺乳動(dòng)物宿主中引起鞭蟲病［35］，研究者已在川金絲猴、食蟹獼猴和獼猴（Macaca mulatta）等猴類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種鞭蟲屬寄生線蟲［35?37］。此外，宮脂線蟲屬線蟲也是藏酋猴腸道內(nèi)的主要寄生類群，有研究發(fā)現(xiàn)該屬寄生線蟲可造成獼猴黏膜出血損壞，也是人畜共患寄生線蟲，是一種危害公共健康的潛在病原［38］。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)彎宮脂線蟲在藏酋猴腸道內(nèi)豐度最高，其主要是大多數(shù)魚類感染較嚴(yán)重的寄生蟲［39］，即使該物種廣泛分布于魚類中，但其與人類感染和病理的關(guān)系仍然值得探索［40］。先前的研究表明，內(nèi)彎宮脂線蟲只生活在冷血生物中，因此它不適應(yīng)哺乳動(dòng)物消化道中普遍存在的條件，通常被認(rèn)為是非人畜共患［41］。目前關(guān)于該寄生蟲對(duì)藏酋猴的危害原理尚不清楚，而它在藏酋猴腸道內(nèi)廣泛分布的原因可能是在冬季食物缺乏時(shí)，藏酋猴易接觸到人類，通過人類投喂的某些食物或飲水感染。墊刃線蟲屬主要是寄生在植物和土壤中的線蟲［42?43］，而弓形墊刃線蟲在藏酋猴體內(nèi)豐度較高可能是與其傾向于在地上取食有關(guān)，目前關(guān)于該線蟲對(duì)藏酋猴的危害尚不清楚。小桿線蟲屬于小桿目（Rhabditia），通常存在于土壤環(huán)境、脊椎動(dòng)物和人類體內(nèi)，其主要食物來源是細(xì)菌，因此該類群很容易在各種環(huán)境中生長(zhǎng)和維持，目前關(guān)于該線蟲的研究主要集中在對(duì)土壤和昆蟲的危害上，關(guān)于脊椎動(dòng)物還尚未有研究［44?46］，在黔金絲猴體內(nèi)豐度較高可能是在地面取食時(shí)進(jìn)行的傳播。本研究發(fā)現(xiàn)，潛在致病性內(nèi)阿米巴屬寄生蟲在二者腸道內(nèi)也廣泛分布，先前的研究表明該屬寄生蟲在滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）、川金絲猴和獼猴等猴類中也廣泛分布，也是一種常見的人獸共患寄生蟲［47?48］。

本研究發(fā)現(xiàn)的44 個(gè)屬于寄生蟲類群的ASVs中，僅有11. 36%的ASVs屬于二者共有，黔金絲猴和藏酋猴分別發(fā)現(xiàn)了31個(gè)（70. 45%）和8個(gè)（18. 18%）不同的ASVs，說明二者腸道寄生蟲組成及豐度存在差異，β 多樣性分析也表明二者腸道寄生蟲群落結(jié)構(gòu)組間差異顯著。腸道寄生蟲群落具有一定的可塑性，有研究表明同一棲息地生存的兩種獼猴屬（Ma?caca）動(dòng)物腸道寄生蟲組成差異顯著［49］，表明遺傳因素可影響腸道寄生蟲的組成。藏酋猴腸道寄生蟲豐富度高于黔金絲猴，可能是在梵凈山保護(hù)區(qū)內(nèi)藏酋猴具有更大的種群規(guī)模、更多的種間接觸以及更喜歡在靠近人類的生境活動(dòng)，這些條件更有利于促進(jìn)寄生蟲的傳播。高種群密度被認(rèn)為能夠增加寄生蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)，有研究報(bào)道稱，生活在墨西哥東南部的墨西哥吼猴（Alouatta palliata mexicana）和懶吼猴（A. pigra）由于前者種群規(guī)模更大，個(gè)體中感染Try?panoxyuris minutus 的概率更高，表明種群密度在寄生蟲的傳播中起著重要作用［50］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物地面覓食的時(shí)間與寄生蟲感染呈正相關(guān)［2］，而黔金絲猴在冬季表現(xiàn)出對(duì)樹芽的“專食性”，更多在樹冠層活動(dòng)，而藏酋猴更多在地面活動(dòng)［24］。另有研究發(fā)現(xiàn)共享?xiàng)⒌氐那嚅L(zhǎng)尾猴（Cercopithecus mitis）和灰頰冠白瞼猴（Lophocebus albigena）腸道寄生蟲的多樣性、均勻度和豐富度均無顯著性差異［51］，這可能與二者之間共享食物和水等基本資源有關(guān)。高通量測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定方法相比，雖然能更全面地鑒定動(dòng)物腸道寄生蟲種類，但仍存在一定局限，如只能以相對(duì)豐度表征物種數(shù)量，大多數(shù)寄生蟲也僅能鑒定到屬水平，僅有少部分寄生蟲能鑒定到種水平。

3. 2 腸道寄生蟲功能預(yù)測(cè)

通過MetaCyc 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，黔金絲猴和藏酋猴腸道寄生蟲編碼的大多數(shù)基因與生物合成有關(guān)，且在二者間差異顯著，在Level 2水平上核苷和核苷酸生物合成代謝通路豐度最高。核苷酸參與哺乳動(dòng)物腸道的生長(zhǎng)發(fā)育及肝臟的生長(zhǎng)，還參與上皮細(xì)胞的增殖、成熟和凋亡過程［52］。在二者腸道內(nèi)豐度最高的鞭蟲屬線蟲與核苷和核苷酸生物合成代謝通路呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明鞭蟲屬對(duì)該代謝通路起到抑制作用。有研究表明核苷和核苷酸可增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，能增加宿主對(duì)病原菌感染的抵抗力，缺乏核苷和核苷酸可能會(huì)對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和腸道發(fā)育產(chǎn)生不利影響［53］。二者Level 2水平上有6類代謝通路具有顯著性差異，推測(cè)可能與宿主本身、寄生蟲種類組成及代謝活動(dòng)有關(guān)。研究證明，代謝潛力是控制病原體毒力及其在感染宿主體中生存的關(guān)鍵因素，通過調(diào)節(jié)代謝能力，寄生蟲能夠根據(jù)宿主環(huán)境的變化調(diào)整生長(zhǎng)，為廣泛的宿主范圍提供潛在途徑［54］。由于寄生蟲與宿主共同經(jīng)歷了長(zhǎng)期的進(jìn)化選擇過程，一些寄生蟲已經(jīng)適應(yīng)了宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除作用，而且宿主對(duì)寄生蟲長(zhǎng)期的慢性感染也產(chǎn)生了一定程度的耐受［55］。腸道寄生蟲經(jīng)常引起腸道炎癥，病原體會(huì)引起宿主生理變化，如果這些變化對(duì)寄生蟲有益，就會(huì)被基因選擇［56］。本研究結(jié)果表明，在屬級(jí)分層上有14屬寄生蟲參與二者的28類Level 2代謝通路途徑，每條代謝通路是由多種物種協(xié)作完成，不同物種可參與不同的代謝通路途徑。已有研究證明腸道寄生蟲的代謝活動(dòng)、寄生部位與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用影響腸道菌群的多樣性［57］，由于在脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)的腸道菌群與腸道寄生蟲共享相同的環(huán)境，它們相互作用對(duì)維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，各種腸道和腸外疾病都與生態(tài)失調(diào)有關(guān)，當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，個(gè)體更容易感染機(jī)會(huì)性病原體［58-59］。盡管絕大多數(shù)宿主同時(shí)感染多種寄生蟲，但大多數(shù)研究寄生蟲對(duì)個(gè)體宿主或者宿主種群的影響都集中在對(duì)單一寄生蟲物種上［60］，因此本研究結(jié)果可為后續(xù)研究腸道寄生蟲對(duì)宿主的影響以及野生和圈養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的保護(hù)提供思路。

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