圈養(yǎng)東北虎貓冠狀病毒的巢氏PCR 檢測(cè)

摘 要 東北虎（Panthera tigris altaica）是全球生物多樣性保護(hù)的旗艦物種，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能中占據(jù)不可替代的重要地位。東北虎對(duì)于可感染家貓的病毒均易感，但目前關(guān)于東北虎病毒病的流行病學(xué)資料仍然十分有限。貓冠狀病毒（Feline coronavi?rus，F(xiàn)CoV）感染，輕可導(dǎo)致貓科（Felidae）動(dòng)物腹瀉，重則呈現(xiàn)高致病性、致死性的貓傳染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis，F(xiàn)IP）。因此，采用巢氏PCR方法對(duì)來(lái)自黑龍江省東北虎林園的6份東北虎全血樣本進(jìn)行FCoV檢測(cè)，結(jié)果顯示2份樣本為陽(yáng)性（H-11-1241、H-11-1310），陽(yáng)性率為33. 3%。所得PCR片段與其他參考株同源性為99. 3% ～ 100. 0%。研究結(jié)果豐富了圈養(yǎng)東北虎中貓冠狀病毒流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為其他圈養(yǎng)貓科動(dòng)物的FCoV 監(jiān)測(cè)提供了參考，對(duì)野生貓科動(dòng)物的保護(hù)與繁育具有重要意義。

關(guān)鍵詞：東北虎；貓冠狀病毒；巢氏PCR

中圖分類號(hào)：S852. 65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 04 - 0896 - 05

DOI：10.12375/ysdwxb.20240424

近年隨著國(guó)家對(duì)野生動(dòng)物保護(hù)力度的加大，圈養(yǎng)和野生貓科（Felidae）動(dòng)物數(shù)量也在增加，人為以及各種生態(tài)因素導(dǎo)致了病原體在不同種間的傳播。病毒性傳染病嚴(yán)重威脅著貓科動(dòng)物的健康及種群數(shù)量，感染家貓的多數(shù)病原體都可感染野生貓科動(dòng)物，并引起相似的臨床癥狀。貓冠狀病毒（Feline coro?navirus，F(xiàn)CoV）主要感染半歲至兩歲的貓，在全球范圍內(nèi)廣泛存在，幼貓更易感染［1］。Kennedy et al.［2］對(duì)美國(guó)多種圈養(yǎng)貓科動(dòng)物如獵豹（Acinonyx jubatus）、東北虎（Panthera tigris altaica）進(jìn)行了FCoV檢測(cè)，結(jié)果顯示超過(guò)一半的樣本呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。東北虎不僅是我國(guó)一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，還是全球生物多樣性保護(hù)的旗艦物種，但目前關(guān)于東北虎的冠狀病毒感染流行病學(xué)數(shù)據(jù)幾乎是空白，因此，對(duì)東北虎等大型貓科動(dòng)物進(jìn)行冠狀病毒感染的監(jiān)測(cè)對(duì)于本病的防控具有重要意義。

FCoV 于20 世紀(jì)60 年代被Holzworth［3］首次發(fā)現(xiàn)，屬于尼多病毒目（Nidovirales），冠狀病毒科（Coronaviridae），冠狀病毒屬（Coronavirus），它是一種不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，擁有一個(gè)較為龐大的基因組（約30 kb）［4］。FCoV基因組含有11個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frames，ORFs），主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白分別是刺突蛋白S、膜蛋白E、包膜蛋白M和核衣殼蛋白N；非結(jié)構(gòu)蛋白主要是復(fù)制酶蛋白（1a和1b）、輔助蛋白（3a、3b、3c、7a和7b）［5］。FCoV 具有兩種生物型，一種為可導(dǎo)致貓傳染性腹膜炎（Feline infectious perito?nitis，F(xiàn)IP）的貓傳染性腹膜炎病毒（Feline infectiousperitonitis virus，F(xiàn)IPV），呈現(xiàn)高致病性、致死性特征，臨床上根據(jù)腹腔和胸腔是否有滲出液，可將FIP分為干性、濕性和混合型3種；另一種為低致病性的貓腸道冠狀病毒（Feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECV）［6］，只存在于貓的消化道，通常引發(fā)貓輕微的腸胃腹瀉，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致貓脫水。盡管在FCoV感染的貓中FIP的發(fā)病率比較低，但FIP是導(dǎo)致患貓死亡的主要原因［7］。根據(jù)S 基因序列及抗原性的不同，可以將FCoV分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型FCoV是貓科動(dòng)物獨(dú)有；Ⅱ型FCoV 是Ⅰ型FCoV 與犬冠狀病毒（Canine co?rona virus，CCoV）之間發(fā)生重組產(chǎn)生的，具有較強(qiáng)的遺傳變異性，在亞洲地區(qū)Ⅱ型約占FCoV感染的25%甚至更多［8］。

本研究采用巢氏PCR方法對(duì)來(lái)自黑龍江東北虎林園的6份東北虎全血樣本進(jìn)行FCoV檢測(cè)，以期了解和掌握虎源FCoV的分子流行病學(xué)資料，為我國(guó)后續(xù)圈養(yǎng)貓科動(dòng)物FCoV監(jiān)測(cè)和預(yù)防提供數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品處理

2021年11月—2022年11月在黑龍江東北虎林園，由專業(yè)獸醫(yī)采集6 份（只）東北虎（0 ～ 6 歲）的全血樣本。所有東北虎在采血前禁食1 d，用含有10 mg/kg氯胺酮飛鏢麻醉（江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司，中國(guó)），每只虎由前肢靜脈采血2 mL。采樣后將所有樣品血液放置于含有適量抗凝劑的采集管內(nèi)并于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2. 1 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Herrewegh et al.［9］研究基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，以FCoV的3′-UTR（untranslated region，UTR）部分基因作為目標(biāo)片段，采用巢氏PCR方法對(duì)6份東北虎全血樣本進(jìn)行逐一篩查，引物序列以及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

2. 2 病毒核酸的提取與反轉(zhuǎn)錄

核酸提取采用Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取試劑盒（廣州灣區(qū)生物科技有限公司，中國(guó)），并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)全血樣本核酸進(jìn)行提取，置于-80 ℃儲(chǔ)存。將4 μL隨機(jī)引物加入帶有核酸且無(wú)RNA酶的EP管內(nèi)，置于干式恒溫器中70 ℃培養(yǎng)5 min，再于-20 ℃冰浴5 min；之后向EP管中加入dNTP 8 μL，DEPC水6 μL，M-MLV 5 × Buffer 10 μL，RNase 抑制劑1 μL 和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega 公司，美國(guó)）1 μL，于37 ℃反應(yīng)1 h；繼續(xù)置于-20 ℃冰浴5 min，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 3 樣品的PCR 檢測(cè)

以病毒核酸的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行第1 輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系25. 0 μL，包含2 × Mix 12. 5 μL，上、下游引物各1. 0 μL，DNA/第1輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1. 0 μL；ddH2O 9. 5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。將該輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，擴(kuò)增程序與第1輪完全一致，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為177 bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將PCR檢測(cè)陽(yáng)性產(chǎn)物送至吉林庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2. 4 3′-UTR 基因片段的同源性分析

將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的參考毒株進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，使用DNAStar 5. 0軟件的MegA?lign程序?qū)y(cè)序所得序列和參考毒株序列（表2）進(jìn)行同源性比對(duì)，再采用R 4. 3進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P lt; 0. 05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3. 1 PCR 鑒定結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，6份來(lái)自黑龍江東北虎林園的樣本中僅有2 份樣本擴(kuò)增到約177 bp 的陽(yáng)性目的條帶，陽(yáng)性率為33. 3%，陽(yáng)性產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

3. 2 同源性比較分析

貓冠狀病毒3′-UTR 保守基因片段經(jīng)巢氏PCR驗(yàn)證，所獲得的2 株陽(yáng)性樣本序列之間的同源性達(dá)100. 0%，對(duì)該樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行BLAST分析，確定2 株陽(yáng)性樣本（H-11-1241、H-11-1310）為FCoV。使用DNAStar 軟件的MegAlign 程序?qū)? 株測(cè)序毒株和參考毒株的FCoV 部分基因進(jìn)行同源性比對(duì)，兩陽(yáng)性株與參考株同源性比對(duì)相似性為99. 3% ～100. 0%（圖2）。其中，陽(yáng)性株與來(lái)自黑龍江家貓的KY566210、KY566209 和KY292377 的同源性為99. 3%，結(jié)合陽(yáng)性目的條帶長(zhǎng)約177 bp，即存在大約一個(gè)堿基的差異，與黑龍江家貓?jiān)炊局昃哂休^高的同源性。

4 討論

近年來(lái)，我國(guó)對(duì)圈養(yǎng)東北虎的飼養(yǎng)管理措施逐漸完善，東北虎數(shù)量逐漸上升，但一些病毒（包括FCoV）性傳染疾病給東北虎的繁育帶來(lái)巨大壓力。FCoV是一種常見(jiàn)的高傳染性冠狀病毒，可在家貓和野生貓科動(dòng)物中傳播，其傳播方式主要為糞口傳播。不同品種貓跨地區(qū)培育、流浪貓的增多和養(yǎng)殖市場(chǎng)衛(wèi)生環(huán)境惡劣等諸多因素導(dǎo)致貓冠狀病毒的變異和進(jìn)化，F(xiàn)CoV不僅在貓群中廣泛流行，還可能對(duì)東北虎造成潛在威脅。本研究采用巢氏PCR對(duì)6份東北虎全血樣本進(jìn)行FCoV檢測(cè)，結(jié)果有2份全血樣品顯示陽(yáng)性，陽(yáng)性率為33. 3%。同源性比對(duì)分析顯示，本研究所獲得的基因與黑龍江本地流行毒株具有較高同源性（99. 3%），即存在流浪貓與圈養(yǎng)東北虎交互的可能性。

劉秋瑾等［10］在2015—2016年對(duì)黑龍江省3個(gè)地區(qū)的貓冠狀病毒進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，選取黑龍江省哈爾濱市、大慶市和齊齊哈爾市不同寵物醫(yī)院中初步診斷患FIP貓的腹水樣品，結(jié)果顯示我國(guó)FCoV-Ⅰ型、FCoV-Ⅱ型均在國(guó)內(nèi)流行，但以FCoV-Ⅰ型流行為主。李少柏［11］通過(guò)對(duì)東北部分地區(qū)貓冠狀病毒的病原學(xué)調(diào)查，不僅確定了我國(guó)東北地區(qū)的貓冠狀病毒主要以FCoV-Ⅰ型流行為主，還驗(yàn)證了FCoV感染與年齡及居住方式顯著相關(guān)。這與Klein-Richers et al.［12］在多變量試驗(yàn)所得到的結(jié)論基本相符，即在多貓科動(dòng)物聚集環(huán)境中和在幼齡時(shí)更易感染FCoV。在區(qū)分貓冠狀病毒的血清型上，一般選取FCoV的S基因序列進(jìn)行分析。本研究選取高度保守的3′-UTR基因序列不足以分辨東北虎源FCoV的血清型，但采樣時(shí)圈養(yǎng)東北虎并未表現(xiàn)出明顯的FIP癥狀（如黃疸、腹部膨大和腹圍增大等），可以確定該陽(yáng)性樣本的生物型為FECV。

Olarte-Castillo et al.［13］在糞便中長(zhǎng)期檢測(cè)FCoV的研究結(jié)果表明，個(gè)體持續(xù)的病毒脫落是FCoV持續(xù)感染的結(jié)果，而不是不同變體的再感染，即在探討FIP的發(fā)病機(jī)制時(shí)，觀察到患病個(gè)體具有一種逐漸增強(qiáng)的自身感染和排毒能力。這種增強(qiáng)的能力主要源于FCoV毒株在機(jī)體內(nèi)引發(fā)的二次感染，而機(jī)體的抗依賴性增強(qiáng)作用（ADE）則進(jìn)一步加劇了FIP的嚴(yán)重程度。目前，針對(duì)FCoV感染無(wú)疫苗和特效治療的藥物，一般的治療方法是：及時(shí)補(bǔ)液以糾正酸中毒，使用抗炎抗病毒藥物和適宜適量的抗生素藥物防止繼發(fā)感染。虎林園圈養(yǎng)東北虎有暴露風(fēng)險(xiǎn)，即可能存在流浪貓與東北虎之間交互傳染的情況，故對(duì)于抑制FCoV傳播的有效措施是加強(qiáng)圈養(yǎng)東北虎的飼養(yǎng)管理，在無(wú)癥狀或出現(xiàn)類似癥狀時(shí)，定期或及時(shí)地對(duì)其進(jìn)行檢查和藥物預(yù)防，并做好患病虎的隔離措施避免交叉?zhèn)鞑ィ煌瑫r(shí)對(duì)籠舍嚴(yán)格消毒，規(guī)范處理排泄物；提高飼糧質(zhì)量，提高免疫力；避免接觸外界流浪貓，對(duì)進(jìn)出籠舍人員或車(chē)輛消毒。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 李少晗， 張廣智， 崔尚金， 等. 犬貓冠狀病毒研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2020， 47（12）： 4059-4068.

LI S H， ZHANG G Z， CUI S J， et al. Research progress of Ca?nine coronavirus and Feline coronavirus［J］. China Animal Hus?bandry amp; Veterinary Medicine， 2020， 47（12）： 4059-4068.

［2］ KENNEDY M， CITINO S， MCNABB A H， et al. Detection of fe?line coronavirus in captive Felidae in the USA［J］. Journal of Vet?erinary Diagnostic Investigation， 2002， 14（6）： 520-522.

［3］ HOLZWORTH J. Some important disorders of cats［J］. The Cor?nell Veterinarian， 1963， 53： 157-160.

［4］ GONZáLEZ J M， GOMEZ-PUERTAS P， CAVANAGH D， et al.A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy ofthe family Coronaviridae［J］. Archives of Virology， 2003， 148（11）： 2207-2235.

［5］ DYE C， SIDDELL S G. Genomic RNA sequence of Feline corona?virus strain FIPV WSU-79/1146［J］. The Journal of General Virol?ogy， 2005， 86（Pt 8）： 2249-2253.

［6］ TEKES G， THIEL H J. Feline coronaviruses： pathogenesis of fe?line infectious peritonitis［J］. Advances in Virus Research，2016， 96： 193-218.

［7］ DRECHSLER Y， ALCARAZ A， BOSSONG F J， et al. Felinecoronavirus in multicat environments［J］. Veterinary Clinics ofNorth America： Small Animal Practice， 2011， 41（6）： 1133-1169.

［8］ 夏紅月. 貓冠狀病毒的檢測(cè)和基因的分子進(jìn)化研究［D］. 沈陽(yáng)： 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2020.

XIA H Y. Molecular evolutionary analyses and detection on genesof Feline coronavirus［D］. Shenyang： Shenyang Agricultural Uni?versity， 2020.

［9］ HERREWEGH A A P M， DE GROOT R J， CEPICA A， et al.Detection of feline coronavirus RNA in feces， tissues， and bodyfluids of naturally infected cats by reverse transcriptase PCR［J］.Journal of Clinical Microbiology， 1995， 33（3）： 684-689.

［10］ 劉秋瑾， 孫東波， 王欣宇， 等. 2015—2016年黑龍江三個(gè)地區(qū)貓冠狀病毒N 基因分子流行病學(xué)調(diào)查［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2018（15）： 130-134.

LIU Q J， SUN D B， WANG X Y， et al. Molecular epidemiologi?cal investigation of N gene of Feline coronavirus in three regionsof Heilongjiang Province from 2015 to 2016［J］. HeilongjiangAnimal Science and Veterinary Medicine， 2018（15）： 130-134.

［11］ 李少柏. 東北部分地區(qū)貓冠狀病毒病原學(xué)調(diào)查［D］. 長(zhǎng)春： 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2021.

LI S B. Investigation on the etiology of Feline coronavirus in par?tial regions of northeast China［D］. Changchun： Jilin Agricul?tural University，2021.

［12］ KLEIN-RICHERS U， HARTMANN K， HOFMANN-LEHMANNR， et al. Prevalence of Feline coronavirus shedding in Germancatteries and associated risk factors［J］. Viruses， 2020， 12（9）：1000.

［13］ OLARTE-CASTILLO X A， LICITRA B N， ANDRé N M， et al.Intra-host variation in the spike S1/S2 region of a feline coronavi?rus type-1 in a cat with persistent infection［EB/OL］. bioRxiv［Preprint］， 2023［2023-07-25］. https：//www. biorxiv. org/content/10. 1101/2023. 07. 31. 551356.

基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210225035）；國(guó)家科技部“十四五”重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2023YFF1305401）