基于多糖、三萜、氨基酸含量的靈芝質量評價和品種分類模型的建立

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種多孔菌科真菌靈芝的子實體，主要分布于浙江、福建、廣東、吉林、黑龍江等地。靈芝富含多種活性成分，包括多糖、三萜、生物堿、氨基酸、核苷、呋喃、甾醇等，具有提高免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗衰老等功效。2021年，國家衛(wèi)生健康委員會、國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布公告，把靈芝列入既是食品又是中藥材的物質進行試點管理，這意味著靈芝的保健價值進一步被認可，市場需求進一步增大。

麗水是浙江省的靈芝核心區(qū)，擁有“中華靈芝第一鄉(xiāng)”的稱號，2010年、2011年，“龍泉靈芝”“龍泉靈芝孢子粉”分別被列為國家地理標志保護產品。因市場準入門檻低、摻假成本低、獲利高等原因，在生產銷售規(guī)模不斷擴大的同時，麗水市的靈芝產業(yè)面臨著產品質量參差不齊、以次充好、缺乏有效的質量評價技術等問題。因此，建立科學、有效的靈芝質量評價和品種分類方法，使評判可量化、易操作、更科學，對靈芝產業(yè)的健康、穩(wěn)步發(fā)展具有重要的意義。

近年來，對靈芝開展質量評價和品種分類研究漸成熱點，主成分分析、因子分析、聚類分析等統(tǒng)計手段已被廣泛應用于產品品質關鍵指標篩選和質量綜合評價研究。比如，姜濤等利用主成分分析比較了靈芝中5種重金屬元素的差異，從而進行質量評價；袁曉艷等基于HPLC圖譜共有峰，利用聚類分析進行了分類；范蕾等基于UPLC-MS/MS開展了靈芝三萜類多指標成分測定并進行質量評價；林冬梅等利用主成分分析，基于水溶性浸出物、靈芝多糖肽、靈芝酸、靈芝甾醇、單糖組成開展了質量評價；鞠瑞鑫等利用熵權逼近理想解排序法，對不同來源靈芝中的多糖、甾醇、三萜類等9種成分開展了綜合評價。目前來看，尚無基于多糖、三萜、氨基酸含量的靈芝質量評價和品種分類的相關報道。

本研究以多糖、三萜、氨基酸含量為指標，利用因子分析和聚類分析建立了一套靈芝的質量評價和品種分類模型，為靈芝的資源評價、品種選育提供了參考和思路。

1. 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器與試劑。U-3900紫外可見分光光度計，日本日立公司；AL104萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；Milli-Q Integral 5超純水機，美國密理博公司；FD-53烘箱，德國BINDER；HH-4恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；SD46-1智能電熱板，天津拓至明實驗儀器設備有限公司；3-30K高速低溫離心機，德國Sigma公司。

齊墩果酸標準品，C30H48O3，純度96.5%，壇墨質檢科技有限公司；葡萄糖標準品，C6H12O6，純度99.99%，上海麥克林生化科技股份有限公司；氨基酸混標，TPE5586，包括天冬氨酸Asp、蘇氨酸Thr、絲氨酸Ser、谷氨酸Glu、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、纈氨酸Val、甲硫氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、組氨酸His、賴氨酸Lys、精氨酸Arg、半胱氨酸Cys共17種，濃度均為2.50μmol/mL，日本日立公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醇、硫酸、蒽酮、鹽酸，均為分析純；MCI緩沖溶液；L-8500-pH試劑盒、茚三酮顯色液試劑盒，日本日立公司。

1.1.2 樣品。采集麗水地產靈芝8份共6個品種，其中“滬農1號”分別采集了3個不同產地的樣品，該6個品種基本涵蓋了麗水地區(qū)的所有靈芝品類。選取當季已成熟待采收的靈芝為樣品，每份樣品以梅花布點法在大棚中選取采集點，采集4-5個大棚，每份樣品采集5kg，具體信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理。將采集到的新鮮靈芝洗凈，于50℃烘箱中干燥48h。每份干燥后的樣品用研磨儀充分碾磨，混勻后制成混合樣，過40目尼龍篩，采用四分法縮分至500g左右備用。

1.2.2 多糖檢測。精密稱取約1.0g樣品粉末于圓底燒瓶中，加入50mL超純水，稱重，沸水浴加熱回流提取5h，放冷，用水補足減少的重量，搖勻、過濾。取5.0mL續(xù)濾液，加入無水乙醇45mL，搖勻，冷藏沉淀過夜。10000r/min離心20min，棄去上清液，加入80%乙醇5.0mL渦旋震散，10000r/min離心10min，棄去上清液，沉淀用熱水溶解定容至20.0mL。精密稱取葡萄糖標準品，用水配置成0.10mg/mL的標準溶液，備用。精密量取標準溶液和樣品溶液，加入1g/L蒽酮硫酸溶液6.0mL，搖勻，在沸水浴中加熱10min后取出，立即置于冰浴冷卻15min，取出，于625nm比色測量。

1.2.3 三萜檢測。精密稱取約2.0g樣品粉末于具塞錐形瓶中，加乙醇50.0mL，超聲處理45min。過濾后，將濾液置于100.0mL容量瓶中，用適量乙醇分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，混勻。精密稱取齊墩果酸標準品，用甲醇配置成0.20mg/mL標準溶液，備用。分別取標準溶液和樣品溶液，置于15mL具塞試管中，揮干、放冷。精密加入新配制的50g/L香草醛冰乙酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15min，立即置冰浴中冷卻5min，取出，精密加入乙酸乙酯4.0mL混勻，于546nm比色測量。

1.2.4 氨基酸檢測。精密稱取約0.20g樣品粉末于水解管中，加入6.0mol/L的HCl溶液5.0mL，氮吹維持8min，管口密封后于110℃水解22h，取出冷卻至室溫，用超純水定容至100.0mL，混勻。取1.0mL濾液于10mL比色管中，真空干燥，加入1.0mL超純水復溶，過0.22μmPTFE濾膜后，用氨基酸分析儀進行測定。

1.2.5 質量控制。每份樣品均進行平行雙樣檢測，每組實驗重復3次，并隨機挑選1份樣品進行加標實驗，以保證數(shù)據(jù)結果的準確性。

1.3 質量評價和品種分類模型的建立方法

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，采用Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理。

采用SPSS 22.0進行描述性分析、非參數(shù)檢驗、相關性分析、因子分析和聚類分析。利用因子分析，以多糖、三萜和16種氨基酸為變量指標，探索變量指標之間的相關性，提取出少數(shù)幾個關鍵、獨立又可反映變量之間內部關系的公因子，并按照各因子的權重計算出綜合得分，建立質量評價方法模型。利用聚類分析，以多糖、三萜和16種氨基酸為變量指標進行系統(tǒng)自動分類，建立品種分類模型。

2. 結果與分析

2.1 檢測結果

多糖在0.02-0.15mg時線性良好，相關系數(shù)為0.9994，低（0.02mg）、中（0.05mg）、高（0.10mg）3種加標水平下，樣品的加標回收率為94.2%-106.7%，相對標準偏差為1.6%-4.8%（n=6）。三萜在0.02-0.10mg時線性良好，相關系數(shù)為0.9990，低（0.01mg）、中（0.03mg）、高（0.06mg）3種加標水平下，樣品的加標回收率為89.1%-102.4%，相對標準偏差為3.6%-6.8%（n=6）。16種氨基酸（半胱氨酸除外）在0.02-0.25μmol/mL時線性良好，相關系數(shù)均大于0.999，低（0.02μmol/mL）、中（0.08μmol/mL）、高（0.15μmol/mL）3種加標水平下，樣品的加標回收率為80.5%-105.7%，相對標準偏差為1.1%-5.7%（n=6）。

8份樣品的多糖、三萜和氨基酸檢測結果見表2和表3。對8份麗水地產靈芝的多糖、三萜、氨基酸結果進行正態(tài)性檢驗，其中三萜、Glu、Met、Ile、Phe、Lys、His7個指標的數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布（P＜0.05）。采用Kruskal-Wallis H檢驗對8份樣品的18個指標開展非參數(shù)檢驗，采用Mann-Whitney U檢驗開展兩兩比較。Kruskal-Wallis結果顯示，除Asp（P=0.075）、Leu（P=0.100）、Phe（P=0.060）外，其余15個指標在樣本間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

多糖的含量范圍為0.234-2.60g/100g，變異系數(shù)為54.88%，樣品間差異明顯。8份樣品中，7號樣品“滬農1號”和2號樣品“龍芝2號”的多糖含量最高，5號樣品紫芝最低，與姜濤等得出的赤芝多糖含量高于紫芝這一結論一致。

三萜的含量范圍為0.538-0.917g/100g，變異系數(shù)為22.48%，樣品間存在較大差異。8份樣品中，3號樣品“113”和7號、8號、6號樣品“滬農1號”的三萜含量最高，4號樣品“佳寶2號”最低，與姜濤等得出的三萜含量范圍基本一致。

16種氨基酸的總量范圍為2.92-5.10g/100g，其中，Tyr的變異系數(shù)最大，為66.72%，是本次檢測的所有指標中的最大值，說明其在樣品間差異顯著。8份樣品中，5號樣品紫芝的氨基酸含量最高，8號樣品“滬農1號”含量最低。

2.2 質量評價模型

采用Spearman相關系數(shù)對18個指標進行相關性分析，結果見表4。由表4可知，各指標之間均存在一定的相關關系。18個指標中，Gly的相關性最廣，除多糖外，與其他16個指標均存在顯著相關性，其次為Pro、Glu、Asp、His。多糖的相關性最少，與其他17個指標均不存在相關性。相關性較高的指標包括Glu-Ala、Glu-Lys、Glu-His、Gly-Ala、Gly-Pro、Lys-His以及Lys-Arg（r＞0.8，P＜0.01）。

相關性結果表明，8份樣品的原始數(shù)據(jù)存在信息重疊，KMO=0.530（＞0.5），Bartlett球形度檢驗X2=499.790，P＜0.001，故可選擇因子分析對上述18個指標進行簡化降維，將各指標數(shù)據(jù)進行無量綱標準化處理后，篩選出具有代表性的綜合變量，得出質量評價模型。

為更準確地開展分析，以特征值大于1且方差貢獻率累計大于85%的標準，共提取出6個有效成分，具體結果見表5。其中，第1公因子F1主要反映Ser、Met、His、Lys、Glu、Gly、Leu、Ala等8項指標，方差貢獻率為36.643%，起主導作用，正向作用指標占多數(shù)；第2公因子F2主要反映三萜、Arg和Phe，方差貢獻率為16.916%，三萜呈較大的負向載荷權數(shù)，但整體正向作用指標多于負向作用指標；第3公因子F3主要反映Asp和Ile，正向作用指標占多數(shù)，方差貢獻率為9.241%；第4公因子F4主要反映多糖，方差貢獻率為9.214%，雖然多糖呈較大的負向載荷權數(shù)，但整體正向作用指標多于負向作用指標；第5公因子F5主要反映表Thr，方差貢獻率為8.811%；第6公因子F6主要反映Tyr，方差貢獻率為8.639%。

由成分得分系數(shù)矩陣表可得出6個公因子的成分得分方程：

F1=0.118X1+0.030X2-0.019X3-0.104X4+0.312X5+0.078X6+0.107X7+0.085X8+0.062X9+0.260X10-0.070X11+0.108X12+0.012X13-0.215X14+0.112X15+0.113X16+0.006X17+0.103X18

F2=-0.525X1+0.032X2-0.215X3-0.094X4-0.285X5+0.073X6-0.037X7+0.052X8+0.203X9-0.215X10+0.001X11+0.003X12-0.016X13+0.288X14+0.091X15+0.042X16+0.253X17-0.085X18

F3=0.246X1+0.060X2+0.609X3-0.097X4-0.274X5+0.170X6+0.165X7-0.187X8-0.325X9+0.150X10+0.486X11-0.170X12-0.253X13+0.226X14-0.127X15+0.133X16+0.126X17+0.099 X18

F4=0.045X1-0.571X2+0.123X3+0.050X4-0.084X5+0.083X6+0.090X7+0.060X8+0.103X9+0.057 X10-0.232X11-0.175X12+0.113X13+0.276X14-0.093X15+0.043X16-0.186X17-0.210X18

F5=0.127X1+0.000X2+0.098X3+0.822X4+0.046 X5-0.141X6-0.175X7+0.129X8+0.036X9-0.307X10-0.205X11+0.341X12-0.108X13+0.150X14+0.053X15-0.112X16-0.142X17+0.107X18

F6=-0.141X1-0.096X2-0.168X3-0.097X4+0.237X5-0.133X6+0.108X7+0.064X8+0.091X9+0.010X10+0.237 X11-0.169X12+0.776X13-0.216X14-0.019X15-0.191X16-0.063X17+0.101X18

根據(jù)6個公因子的方差貢獻率，確定靈芝的質量評價模型為：F=0.4096F1+0.1891F2+0.1033 F3+0.1033 F4+0.0985F5+0.0966F6

以8份樣品的多糖、三萜和16種氨基酸檢測數(shù)據(jù)進行無量綱標準化處理后，代入公因子綜合評價模型計算得分，結果見表6。綜合排名最高的為5號樣品紫芝，綜合排名最低的為8號樣品“滬農1號”。不以產孢子粉為主的靈芝綜合得分均大于0，排名高于產粉靈芝，說明該模型可區(qū)分出不同靈芝品種間的質量差異。同為“滬農1號”的6號、7號和8號樣品，得分也存在差異，說明該模型可區(qū)分同品種不同靈芝樣本間的質量差異。綜上所述，以多糖、三萜、氨基酸含量為指標進行靈芝的質量評價符合預期。

2.3 品種分類模型

圖1：8份麗水地產靈芝聚類分析結果

將多糖、三萜和16種氨基酸的檢測數(shù)據(jù)進行無量綱標準化處理后，使用系統(tǒng)聚類（Q型）對8份樣品進行分析，聚類方法采用組間聯(lián)接法，以平方歐式距離為區(qū)間判定樣品間的相似度，結果見圖1。以歐氏距離5為判定臨界點，8份樣品聚集為3類，其中5號樣品紫芝單獨為一類，1號樣品“龍芝1號”和4號樣品“佳寶2號”聚為一類，其余5份產粉靈芝樣品聚為一類；在歐式距離為10時，5號樣品紫芝為一類，其他赤芝樣品聚為一類，說明以多糖、三萜、氨基酸含量為指標進行靈芝的分類判別符合預期。

3. 結論

多糖、三萜和氨基酸都是靈芝的主要活性物質和功效成分，是靈芝營養(yǎng)價值的重要體現(xiàn)。多糖具有增強機體免疫、抑制腫瘤、保肝護肝等功效；三萜具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫、降血脂血糖等功效；氨基酸是構成蛋白質的基本物質，具有維持機體正常代謝、補充營養(yǎng)、提高免疫力等功效。因此，選擇以多糖、三萜和氨基酸作為靈芝的質量指標構建評價模型和分類模型，具有科學性和可靠性。

傳統(tǒng)方法中，對靈芝整芝和切片進行質量評價和品種分類時，皆以形、色、氣、味、質地等感官指標為判斷標準，主觀性較強，其準確度完全取決于檢驗者的經驗判斷。本研究以多糖、三萜和氨基酸為指標，建立了一套客觀的可量化的靈芝質量評價和品種分類的方法模型，可以準確區(qū)分出不同品種以及同品種不同產地樣本之間的質量差異，并得出正確的品種分類，結果符合預期，為綜合評價靈芝質量和品種鑒定提供了新途徑和新思路。

基金項目：麗水市科學技術局公益性技術應用研究項目（2022GYX37）；麗水市科學技術局自籌類公益性技術應用研究項目（2023SJZC047）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2023KY1379）；國家自然科學基金面上項目（22076072）。

作者簡介：紀律（1983-），女，漢族，浙江麗水人，副主任技師，大學本科，研究方向為理化檢驗。