豬苓菌核形成條件優(yōu)化研究

摘 要：豬苓作為一種藥用真菌，在醫(yī)藥界備受青睞，但由于野生資源逐漸匱乏，開展豬苓人工栽培已成為一種趨勢。本試驗從濕度、黑曲霉ZM-8液、生物素的使用等幾方面探究豬苓菌核快速形成的最佳配方。研究結果表明：黑曲霉ZM-8的加入，有助于豬苓菌核和蜜環(huán)菌菌索的形成與生長。適宜濃度的生物素對豬苓菌核的形成也有極大的促進作用。在四種主要影響因素中，濕度水平對豬苓菌核形成影響最大?？刂婆囵B(yǎng)基濕度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的條件最適宜豬苓菌核的形成。該條件下培養(yǎng)30 d豬苓菌核直徑可達32.8 mm。

關鍵詞：豬苓；蜜環(huán)菌；菌核；條件優(yōu)化

中圖分類號：R282.2" 文獻標識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）10-0052-05

收稿日期：2024-02-05 修回日期：2024-03-13

基金項目：渭南職業(yè)技術學院2023年度院級科研計劃項目（WZYYZ202309）。

第一作者簡介：郭楠（1988-），女，碩士，研究方向為藥用真菌基礎研究。

Study on Condition Optimization for Sclerotial Formation "of %Polyporus Umbellatus%

GUO Nan1， ZHANG Zongzhou2

（1.Weinan Vocational and Technical College， Weinan， Shaanxi 714026， China; 2.School of Bioengineering and Biotechnology， Tianshui Normal University， Tianshui， Gansu" 741001， China）

Abstract： %Polyporus umbellatus %is a medicinal fungus that is highly valued in the pharmaceutical industry. Due to the gradual depletion of wild resources， artificial cultivation of Polyporus umbellatus has become a trend. This study investigated the optimal formula for the rapid formation of sclerotia in %Polyporus umbellatus% from several aspects， including humidity， Aspergillus niger ZM-8 liquid concentration， and biotin supplementation. The results indicate that the introduction of %Aspergillus niger% ZM-8 significantly enhances the formation and growth of both sclerotia and %Armillaria mellea %rhizomorphs. Additionally， an appropriate concentration of biotin plays a crucial role in promoting sclerotial formation. Among the four main factors tested， the optimal conditions for sclerotial formation of %Polyporus umbellatus %were identified as： medium humidity at 50%， 25 mL of %Aspergillus niger %ZM-8 liquid， 12 ppm of 30 alkanol （specify if possible）， and 15 ppm of NAA. Under these conditions， the diameter of %Polyporus umbellatus% sclerotia could reach up to 32.8 mm after 30 days.

Key words：%Polyporus umbellatus; Armillaria mellea; %Sclerotium; Condition optimization

豬苓是一種珍貴的真菌類中藥材［1］，屬擔子菌門、多孔菌科、多孔菌屬[5，12]。豬苓味甘、性平，有利水、消腫的功效［2］，中醫(yī)臨床上常用于治療急性腎炎、全身浮腫、小便不暢、尿急尿頻、急性肝炎等疾病。隨著醫(yī)藥事業(yè)的快速發(fā)展，以豬苓為原料的成品藥不斷開發(fā)，保護豬苓野生資源，開展豬苓人工栽培勢在必行［3］。

豬苓的生長發(fā)育需經過擔孢子、菌絲體、菌核和子實體四個階段。擔孢子在適宜的條件下萌發(fā)成菌絲和次生菌絲，構成菌絲體，無數菌絲纏繞構成菌核。菌核多年生，能貯存營養(yǎng)，環(huán)境不適時可長期休眠，遇蜜環(huán)菌和適宜的環(huán)境能萌生菌絲，串破菌核表層[4，10]，形成白苓，進而開始下一輪無性繁殖過程。豬苓菌核具有利水、滲濕、消腫等功能，其多糖對動物移植性腫瘤有抑制作用[5]。豬苓菌核國內及出口用量大，野生資源日益減少，雖然利用蜜環(huán)菌伴栽豬苓菌核人工栽培[8，9]和菌絲發(fā)酵[6]已獲得成功，但由于豬苓菌核生長緩慢、繁殖率低、種苓缺乏，為此很難提供大量豬苓菌核用于人工栽培，限制了豬苓栽培的規(guī)模。

人工室內促生豬苓種，即人工培養(yǎng)豬苓菌核，可以為半人工栽培豬苓提供無限的種源，又能打破豬苓栽培的時空限制，推動豬苓栽培業(yè)的發(fā)展。同時，豬苓栽培的第一步也是研究豬苓菌核的形成問題，也就是如何讓豬苓孢子在最適的培養(yǎng)條件下形成大量的菌絲，又讓這大量的菌絲交織在一起快速的形成豐滿的菌核，這是目前亟待解決的問題，也是豬苓人工栽培中最難解決的問題。本研究的目的是找到豬苓菌核形成的最佳外界條件，掌握豬苓菌核形成的基本規(guī)律，以推動豬苓菌核的產業(yè)化生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 豬苓原種、蜜環(huán)菌原種由天水師范學院微生物研究室提供的雜木屑原種。

1.1.2 原料 鋸末、麩皮、馬鈴薯、玉米面、大豆面、蛋白胨、白糖、石膏粉等。

1.1.3 培養(yǎng)基配方 鋸末75%、麥麩14%、玉米面5%、大豆面2%、蛋白胨1%、白糖1%、多維磷酸二氫鉀1%、石膏粉1%、加豬苓寶2#0.3%，加水至含水55%左右。

1.1.4 器材 高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療機械廠）電子天平、恒溫培養(yǎng)箱（上海恒科技有限公司）、酒精燈、培養(yǎng)皿、電爐、量筒、500 mL三角瓶、250 mL菌種瓶、500 mL菌種瓶、濾紙、多個1 mL移液管。

1.2 方法

1.2.1 蜜環(huán)菌、豬苓栽培種培養(yǎng)將配料拌勻，裝瓶，松緊適度，中間插一孔，用棉花做塞子，滅菌。分別接種豬苓、蜜環(huán)菌菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。后置于黑暗條件下培養(yǎng)30 d，注意觀察。

1.2.2 豬苓菌核形成條件優(yōu)化

（1）黑曲霉ZM-8對蜜環(huán)菌菌索和豬苓菌核形成的影響。

黑曲霉對豬苓菌核和蜜環(huán)菌菌索的形成有促進作用，是偶然發(fā)現的。之后我們著意用幾種黑曲霉感染，取得了較好的效果。培養(yǎng)基配方同上。分別接種野生黑曲霉、黑曲霉UV-11、黑曲霉ZM-8各1 mL，對照不接，重復6次。其中3次接種豬苓菌種，另外3次接種蜜環(huán)菌菌種。培養(yǎng)30 d，取3個樣的平均數。

（2）生物素對豬苓菌核的促進作用[11]?？紤]到豬苓生長速度比較緩慢，一般自然界一年才能形成豬苓種，三年以上才能長成商品豬苓，為促生豬苓種，我們引入了生物素試驗。

1#處理：馬鈴薯100 g；白糖10 g；牛肉膏5 g；KH-2PO-4 2 g；瓊脂8 g；自來水500 mL（馬鈴薯煮化）。制成500 mL特殊的PDA培養(yǎng)基。滅菌，并倒成20個培養(yǎng)皿，每皿加滅過菌的中性濾紙一張。加生物素液0.5 mL。生物素液配方：萘乙酸5 mg/kg；10 mg/kg；15 mg/kg；20 mg/kg的濃度，分別形成1#A、1#B、1#C、1#D四個處理，每處理4個重復。對照1#CK，不加生物素，重復4個。只接種豬苓菌種，25℃培養(yǎng)30 d。

2#處理：培養(yǎng)基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：萘乙酸5 mg/kg；10 mg/kg；15 mg/kg；20 mg/kg的濃度，分別形成2#A、2#B、2#C、2#D四個處理，每處理4個重復。對照2#CK，不加生物素，重復4個。同時接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。

3#處理：培養(yǎng)基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：三十烷醇4 mg/kg；8 mg/kg；12 mg/kg；16 mg/kg的濃度，分別形成3#A、3#B、3#C、3#D四個處理，每處理4個重復。對照3#CK，不加生物素，重復4個。只接種豬苓菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。

4#處理：培養(yǎng)基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：三十烷醇4 mg/kg；8 mg/kg；12 mg/kg；16 mg/kg的濃度，分別形成4#A、4#B、4#C、4#D四個處理，每處理4個重復。對照4#CK， 不加生物素，重復4個。同時接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。

1.2.3 條件優(yōu)化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度）[7] 黑曲霉ZM-8液的制作方法：稱取5 g黑曲霉ZM-8，加500 mL水浸泡在三角瓶中10 h，置高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌后使用。

在前面實驗的基礎上，這次重點討論萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度等四因素對豬苓菌核形成的影響。我們設置四因素三水平正交試驗。萘乙酸5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg；三十烷醇4 mg/kg、8 mg/kg、

12 mg/kg；黑曲霉ZM-8液15 mL、20 mL、25 mL；培養(yǎng)基濕度50%、60%、70%。設置9個處理，每處理5個重復，共1個對照。將配料拌勻，裝入培養(yǎng)皿，每皿約10 g左右，保持皿內培養(yǎng)基疏松。滅菌，接種豬苓菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計生長結果。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉ZM-8對蜜環(huán)菌菌索和豬苓菌核形成的影響

菌核的形成是豬苓產生的第一步，由表1可以看出：野生黑曲霉對豬苓菌核的產生有益，30d菌核平均可達13.2 mm；接種黑曲霉UV-11，菌核平均可達14.4 mm；接種黑曲霉ZM-8，菌核平均可達16.8 mm，而不接黑曲霉的對照樣品在30 d根本無法產生菌核。試驗結果可知接種黑曲霉ZM-8，菌核大而飽滿，不接黑曲霉的對照組菌絲較白，但無菌核產生。蜜環(huán)菌菌索的生長也受黑曲霉的影響，接種野生黑曲霉，蜜環(huán)菌菌索30 d平均可達17 mm；接種黑曲霉UV-11，蜜環(huán)菌菌索30 d平均可達34 mm；蜜環(huán)菌菌索接種黑曲霉ZM-8，30 d平均可達51 mm，而不接黑曲霉的對照樣品在30 d菌索長度只有8 mm。由此說明，黑曲霉不影響蜜環(huán)菌菌索的產生，但影響蜜環(huán)菌菌索的生長速度，特別是接種黑曲霉ZM-8，蜜環(huán)菌菌索的長度是對照組的6.38倍，影響相當之大。這一發(fā)現將成為豬苓生產中的一個重要措施。

2.2 生物素對豬苓菌核形成的影響

從表2可以看出，生物素—萘乙酸、三十烷醇的加入，都能在一定程度上促進豬苓菌核的形成。1#處理只接種豬苓菌種，在萘乙酸濃度10 mg/kg時達到高峰，豬苓菌核直徑18.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大

14.2 mm。2#處理接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，在萘乙酸濃度10" mg/kg時達到高峰，豬苓菌核直徑20.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大12.5 mm。3#、4#處理加的三十烷醇，在8" mg/kg時達到高峰，菌核分別比不加三十烷醇大10.2 mm和8.5 mm。且相同加量下，生物素濃度越高，豬苓菌核生長速度越慢。同時認為加萘乙酸比加三十烷醇的效果更好。另一方面，在萘乙酸濃度10" mg/kg和三十烷醇濃度8" mg/kg時，同時接種蜜環(huán)菌和豬苓菌種的2#和4#比只接種豬苓菌種的1#和3#菌核直徑大2 mm，由此說明：蜜環(huán)菌能為豬苓提供營養(yǎng)，也說明豬苓可以脫離蜜環(huán)菌自己吸收營養(yǎng)。在營養(yǎng)充足的情況下，豬苓是可以單獨生長的，打破了豬苓必須依靠蜜環(huán)菌提供營養(yǎng)才能生長的定勢思維。

2.3 條件優(yōu)化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度、）的正交試驗結果

在條件優(yōu)化中，豬苓菌核形成條件的正交實驗因素水平如表3，不同因素的正交試驗結果（L-9（34））如表4。設計的因素與因素水平，是在原來單因素試驗的基礎上確定的。

從表4可以看出，培養(yǎng)基濕度水平的極差、ZM-8液水平的極差、三十烷醇水平的極差和萘乙酸水平的極差分別是12.4、10.83、8.03和1.7。說明在環(huán)境條件的確定中，濕度對豬苓菌核生長的影響最大，濕度的改變明顯影響豬苓的生長及大?。惠烈宜崴綄ωi苓菌核生長的影響最小。在9個處理中，處理3的豬苓菌核直徑最大，可達32.8 mm，處理6的豬苓菌核直徑最小，僅9.8 mm。處理3菌核直徑是處理6菌核直徑的3.35倍，所以認為處理3的條件適宜豬苓菌核的形成。也就是控制空氣濕度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的條件最適宜豬苓菌核的形成。在這個條件下30 d，豬苓菌核直徑可達32.8 mm，這樣大小的豬苓菌核可以直接用于豬苓生產。

3 小結與討論

3.1 單因素試驗討論

3.1.1 黑曲霉ZM-8對蜜環(huán)菌菌索和豬苓菌核形成的影響

在自然界可能也存在促進豬苓菌核形成的因素。我們在實驗中偶然發(fā)現，形成豬苓菌核的培養(yǎng)基被黑曲霉感染后不會阻礙豬苓菌核的形成，反而會促進豬苓菌核的形成。之后，采用幾種黑曲霉去侵染，取得了較好的結果，實驗結果表明黑曲霉可以促進豬苓菌核的形成，特別是黑曲霉ZM-8菌株。黑曲霉ZM-8可以促進豬苓菌核的產生和膨大，也能促進蜜環(huán)菌菌索的伸長，接種黑曲霉ZM-8蜜環(huán)菌菌索的長度是對照的6.38倍。

3.1.2 生物素對豬苓菌核形成的影響 生物素—萘乙酸、三十烷醇的加入，都能在一定程度上促進豬苓菌核的形成。僅接種豬苓菌種的處理，在萘乙酸濃度10 mg/kg達到高峰，豬苓菌核直徑18.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大14.2 mm。接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，在萘乙酸濃度10 mg/kg達到高峰，豬苓菌核直徑20.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大12.5 mm。加三十烷醇，在8 mg/kg時達到高峰，分別比不加三十烷醇菌核大10.2 mm和8.5 mm。在生物素影響豬苓菌核形成的過程中我們還發(fā)現，豬苓可以獨立吸收營養(yǎng)，形成菌核，也可以借助蜜環(huán)菌的菌索提供營養(yǎng)形成菌核，蜜環(huán)菌的存在有助于豬苓菌核的產生與生長。

3.2 條件優(yōu)化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度）的正交試驗討論

在四種主要影響因素中，培養(yǎng)基濕度水平對豬苓菌核形成影響最大，黑曲霉ZM-8液影響次之。培養(yǎng)基相對最佳濕度是50%。條件優(yōu)化中認為：控制培養(yǎng)基濕度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的條件最適宜豬苓菌核的形成。在這個條件下30 d，豬苓菌核直徑可達32.8 mm。黑曲霉ZM-8液的加入啟發(fā)我們，它在豬苓菌核形成的培養(yǎng)基中可能充當著某種營養(yǎng)成份，有待進一步研究。

促生豬苓種，即人工培養(yǎng)豬苓菌核，可以為栽培豬苓提供無限的種源，又能打破豬苓栽培的時空限制，推動豬苓栽培業(yè)的發(fā)展。

參考文獻：

[1] 江蘇新醫(yī)學院.中草藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版，1986：2 191-2 192.""""""""""""""""""""""

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：299.

[3] 陳德育，李學俊，田廣文.豬苓菌核代料栽培技術初探[J].食用菌，2007，29（5）：43.

[4] 劉瑛穎，程顯好，郭順星.藥用真菌豬苓菌絲形成菌核的人工培養(yǎng)研究[J].藥學學報（增刊） ，2007，（41）：245-248.

[5] 徐錦堂.中國藥用真菌學[M].北京：中國醫(yī)藥大學中國協和醫(yī)科人學聯合出版社，1997.

[6] 陶雪娟，徐崇敬，徐鳳菊，等.蕈菌液體生物發(fā)酵技術的研究現狀與進展[J].上海農學院學報，1999，17（2）：141-147.

[7] 孫東平，潘鋒，史小麗，等.靈芝菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化與分離純化[J].中草藥，2000，31（12）：941-943.

[8] 郭順星，徐錦堂.蜜環(huán)菌侵染豬苓菌核的細胞學研究[J].植物學報，1993，35（1）：44-50.

[9] 郭順星，徐錦堂.蜜環(huán)菌侵染后豬苓菌核防御結構的發(fā)生及功能[J].真菌學報，1993，12（4）：283-288.

[10] 郭順星，王秋穎，張集慧，等.豬苓菌絲形成菌核栽培方法的研究[J].中國藥學雜志，2001（36）：658.

[11] 程麗娟，薛泉宏.微生物學實驗技術[M].陜西：世界圖書出版社西安公司，2000：38.

[12] 陳文強，鄧百萬.秦巴山區(qū)野生與栽培豬苓菌核主要成分的測定[J].無錫輕工大學學報，2003，22（6）：96-98.