長基因間非蛋白編碼RNA 472對(duì)阿爾茨海默病神經(jīng)元鐵死亡的作用機(jī)制研究

【摘要】目的 探究長基因間非蛋白編碼RNA 472（LINC00472）對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）神經(jīng)元鐵死亡的作用機(jī)制，為臨床治療提供參考。方法 選取雄性昆明種小鼠30只，隨機(jī)分為空白組、模型組、模型+加藥組，各10只?？瞻捉M小鼠腹腔注射等量的生理鹽水和灌胃等量的雙蒸水，模型組小鼠灌胃人β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）5 mg/kg（雙蒸水配制）建立AD模型，模型+加藥組小鼠在模型組基礎(chǔ)上腹腔注射環(huán)磷酸腺苷（cAMP）篩選出的抑制LINC00472靶向藥物。比較3組小鼠迷宮測試結(jié)果，腦組織炎癥因子水平、β淀粉樣蛋白（Aβ）mRNA水平、微管相關(guān)蛋白（tau）mRNA水平、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）mRNA水平、甲基轉(zhuǎn)移酶3（METTL3）水平、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）水平及3組小鼠的Aβ、tau、GPX4免疫組化檢測結(jié)果。結(jié)果 空白組、模型+加藥組小鼠Y形迷宮覓食時(shí)間、莫里斯水迷宮（MWM）逃逸時(shí)間均短于模型組，且空白組均短于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠MWM有效區(qū)域停留時(shí)間均長于模型組，且空白組長于模型+加藥組（均P<0.05）。空白組、模型+加藥組小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、Aβ mRNA、tau mRNA、METT3 mRNA、ASK1水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠GPX4 mRNA水平均高于模型組，且空白組高于模型+加藥組（均P<0.05）。模型組小鼠海馬體Aβ1-42沉積增加，模型+加藥組Aβ1-42表達(dá)水平低于模型組；模型組小鼠海馬體tau磷酸化增加，模型+加藥組海馬體tau磷酸化程度低于模型組；模型組小鼠海馬體GPX4表達(dá)減少，模型+加藥組海馬體GPX4表達(dá)高于模型組。結(jié)論 LINC00472抑制有助于減輕神經(jīng)炎癥，減少Aβ沉積、tau磷酸化，并提高GPX4表達(dá)，進(jìn)而通過抑制AD神經(jīng)元鐵死亡改善神經(jīng)功能，且AD神經(jīng)元鐵死亡的作用機(jī)制與METT3/ASK1通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】長基因間非蛋白編碼 RNA 472；阿爾茨海默?。昏F死亡

【中圖分類號(hào)】R322.8 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.21.0001.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.21.001

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）是常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病原因和機(jī)制目前尚不明確，與遺傳、環(huán)境、年齡增長等有關(guān)，可出現(xiàn)進(jìn)行性加重性認(rèn)知功能障礙與行為損害、記憶和學(xué)習(xí)能力受損，該病患者腦內(nèi)的斑塊、小膠質(zhì)細(xì)胞、纏結(jié)神經(jīng)元中可觀察到鐵沉積現(xiàn)象[1-2]。鐵死亡是非凋亡性程序性細(xì)胞死亡，其特征為鐵依賴性的脂質(zhì)氫過氧化物累積到致死水平，是AD病理生理學(xué)的主要過程[3]。除鐵死亡外，腦組織還易受到神經(jīng)炎癥的影響，鐵滯留可觸發(fā)AD中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和白細(xì)胞介素產(chǎn)生，加劇淀粉樣β蛋白（Aβ）沉積和微管相關(guān)蛋白（tau）磷酸化。有研究表明，鐵死亡抑制劑在卒中疾病動(dòng)物模型中具有保護(hù)神經(jīng)元、恢復(fù)認(rèn)知功能的作用[4]。長基因間非蛋白編碼RNA 472（LINC00472）與鐵死亡密切相關(guān)，其在多種腫瘤中的表達(dá)研究較多，但關(guān)于其在AD中的表達(dá)及作用機(jī)制相關(guān)研究較少?；诖耍狙芯刻骄縇INC00472對(duì)AD神經(jīng)元鐵死亡的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取雄性昆明種小鼠30只[購于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK（滬）2020-0004]， 3月齡，體質(zhì)量300～400 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、模型+加藥組，各10只。

空白組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水和灌胃等量的雙蒸水；模型組小鼠灌胃人β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）5 mg/kg（雙蒸水配制）建立AD模型；模型+加藥組小鼠在模型組基礎(chǔ)上腹腔注射環(huán)磷酸腺苷（cAMP）篩選出的抑制LINC00472靶向藥物，在造模成功1周后連續(xù)灌胃給藥8周。 3組小鼠均于末次給藥后進(jìn)行迷宮實(shí)驗(yàn)，取腦組織，置于-80 ℃環(huán)境保存待測。研究過程遵循國際通行的動(dòng)物福利和倫理準(zhǔn)則。

1.2 研究方法 ⑴迷宮實(shí)驗(yàn)。 Y形迷宮由3個(gè)臂組成，包括1個(gè)起始臂和2個(gè)目標(biāo)臂（每個(gè)臂的尺寸為30 cm×6 cm×30 cm）。訓(xùn)練小鼠3 d后進(jìn)行測試。小鼠在正式測試前禁食12 h。第41天，在2個(gè)目標(biāo)臂之一放置食物，將小鼠分別放置在起始臂末端，用攝像機(jī)記錄每只小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡和尋找食物所用的時(shí)間，并使用

ANY-maze動(dòng)物行為分析軟件進(jìn)行分析。

第43天使用莫里斯水迷宮（MWM）評(píng)估小鼠的空間記憶和導(dǎo)航能力，訓(xùn)練和正式測試均使用MT-200水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)進(jìn)行。水槽被分成4個(gè)象限，向水槽中添加二氧化鈦使水變渾濁。訓(xùn)練小鼠放入水中后有60 s內(nèi)到達(dá)平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留20 s。若有60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則手動(dòng)帶小鼠到平臺(tái)上并停留20 s。共訓(xùn)練

3天。第46天和第47天分別在盲測條件下進(jìn)行導(dǎo)航測試和探索試驗(yàn)，記錄小鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間和（或）通過有效區(qū)域的時(shí)間。

⑵酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。取小鼠腦組織，裂解、研磨，低速離心后取上清液，使用ELISA檢測白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）水平。

⑶免疫組化染色。干燥載玻片，并用二甲苯和乙醇脫蠟。用檸檬酸緩沖液在100 ℃下進(jìn)行載玻片表位檢索，煮沸30 min，用3%過氧化氫孵育。切片用5%的牛血清白蛋白（BSA）阻斷，然后用Aβ、tau、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）一抗（均購自和光純藥工業(yè)有限公司）孵育過夜。最后，加入山羊抗兔二抗孵育，并用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（購自賽默飛世爾科技）染色。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用Harris蘇木精進(jìn)行反染色。用95%和100%乙醇和二甲苯洗滌脫水后，用永久貼載介質(zhì)覆蓋組織切片，在共聚焦顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。

⑷RNA分離和定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）。取大鼠腦組織在1 mL 組織裂解緩沖液中裂解，于冰浴狀態(tài)下在玻璃研磨機(jī)中研磨成勻漿，然后4 ℃裂解30 min，離心20 min。成骨細(xì)胞使用1 mL 組織裂解緩沖液裂解后離心，使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用Hifair Ⅲ第一鏈cDNA合成Super Mix轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（購自賽默飛世爾科技）行定量實(shí)時(shí)PCR。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算Aβ、tau、GPX4 mRNA表達(dá)水平。

⑸蛋白質(zhì)印跡分析。取大鼠腦組織在1 mL組織裂解

緩沖液中裂解，于冰浴狀態(tài)下在玻璃研磨機(jī)中研磨成勻漿，然后4 ℃裂解30 min，離心20 min。成骨細(xì)胞使用1 mL 組織裂解緩沖液裂解后離心，使用補(bǔ)充了1%苯基甲基磺酰氟的放射免疫沉淀測定（RIPA）緩沖液提取成骨細(xì)胞的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF膜）上，用脫脂奶粉（5%）在含有0.05%Tween-20（TBST）的Tris緩沖鹽溶液中封閉。然后，將PVDF膜分別與甲基轉(zhuǎn)移酶

3（METTL3）、細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（購自和光純藥工業(yè)有限公司）在室溫下過夜。用TBST洗滌后，將PVDF膜與二抗IgG，在室溫下孵育2 h。將膜浸入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光溶液。在無光條件下顯影后，觀察條帶并拍照記錄，以β-actin作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算METT3、ASK1蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 空白組、模型+加藥組小鼠Y形迷宮覓食時(shí)間、 MWM逃逸時(shí)間均短于模型組，且空白組短于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠MWM有效區(qū)域停留時(shí)間均長于模型組，且空白組長于模型+加藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），

見表1。

2.2 3組小鼠腦組織炎癥因子水平比較 空白組、模型+加藥組小鼠IL-6、 MCP-1、 IL-1β水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 3組小鼠腦組織Aβ、tau、GPX4免疫組化檢測結(jié)果 模型組小鼠海馬體Aβ1-42沉積增加，模型+加藥組Aβ1-42低于模型組，見圖1；模型組小鼠海馬體tau磷酸化增加，模型+加藥組海馬體tau磷酸化低于模型組，見圖2；模型組小鼠海馬體GPX4表達(dá)減少，模型+加藥組海馬體GPX4表達(dá)高于模型組，見圖3。

2.4 3組小鼠Aβ、 tau、 GPX4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 空白組、模型+加藥組小鼠Aβ、 tau mRNA水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠GPX4 mRNA水平均高于模型組，且空白組高于模型+加藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表3。

2.5 3組小鼠METT3、 ASK1蛋白相對(duì)表達(dá)比較 空白組、模型+加藥組小鼠METT3、 ASK1蛋白表達(dá)水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。 3組小鼠METT3、 ASK1蛋白免疫印跡情況，見圖4。

3 討論

鐵死亡是一種非凋亡性的細(xì)胞死亡形式，其在形態(tài)學(xué)、生化、遺傳學(xué)上均不同于其他形式的細(xì)胞死亡（如凋亡、壞死、自噬），鐵過載可在體內(nèi)誘導(dǎo)鐵死亡，而鐵螯合劑可預(yù)防鐵死亡[5]。鐵死亡可見于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡中，如出血性卒中、缺血性卒中、帕金森病、亨廷頓病等，并伴有脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙及GPX4減少[6]。

腦鐵過載與AD等神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制相關(guān)，然而其潛在機(jī)制尚不明確。此外，鐵死亡抑制劑已在卒中疾病動(dòng)物模型中被證明可保護(hù)神經(jīng)元、恢復(fù)認(rèn)知功能，且敲除小鼠的 GPX4可直接導(dǎo)致年齡依賴性的神經(jīng)退行性變化和嚴(yán)重的神經(jīng)元丟失[7]。考慮AD 中過量鐵的積累會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生顯著增加，因此，鐵死亡可能與 AD 的神經(jīng)元丟失和認(rèn)知障礙有關(guān)。

Aβ、tau、GPX4是鐵死亡及鐵過載的重要反映指標(biāo)。Aβ前體蛋白（APP）是一種1型跨膜糖蛋白，是Aβ生成的關(guān)鍵前體，可先被α-分泌酶或β-分泌酶切割，然后再被γ-分泌酶切割。在健康狀態(tài)下，α-分泌酶首先切割A(yù)PP，即處于非淀粉樣變性途徑。然而，APP首先被β-分泌酶切割，可產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的40～42個(gè)氨基酸的淀粉樣蛋白（淀粉樣變性途徑）。而弗林蛋白酶在介導(dǎo)α-分泌酶或

β-分泌酶的蛋白酶解活化率方面起關(guān)鍵作用，其濃度與

α-分泌酶活性呈正相關(guān)，與β-分泌酶活性呈負(fù)相關(guān)。胞內(nèi)鐵濃度過高可通過減少弗林蛋白酶，增強(qiáng)β分泌酶活性，從而增加淀粉樣變性途徑的Aβ生成。此外，APP mRNA是5'-非翻譯區(qū)（5'-UTR）編碼鐵反應(yīng)元件（IRE），該元件與胞內(nèi)鐵含量密切相關(guān)。當(dāng)胞內(nèi)鐵濃度升高時(shí)，5'-UTR mRNA中的IRE上調(diào)APP的翻譯，從而增加APP蛋白的數(shù)量，并促進(jìn)Aβ的生成。鐵還能直接與Aβ的His6、His13、His14氨基酸殘基結(jié)合，從而增強(qiáng)Aβ的神經(jīng)毒性[8]。

在APP/PS1小鼠AD模型中，亞微米分辨率的X線顯微鏡技術(shù)顯示，淀粉樣斑塊形態(tài)與鐵直接相關(guān)[9]。鐵可通過誘導(dǎo)激酶影響蛋白磷酸酶 2A活性，促進(jìn)tau過度磷酸化，還可通過tau蛋白中的鐵結(jié)合基序引起過度磷酸化的 au聚集[10]。GPX4通過將膜脂質(zhì)氫過氧化物還原為脂質(zhì)醇來抑制脂質(zhì)過氧化，被認(rèn)為是鐵死亡的中樞調(diào)節(jié)器。GPX4的敲除可誘導(dǎo)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的鐵死亡，從而導(dǎo)致成年小鼠迅速癱瘓和死亡。有研究表明，鐵死亡通過敲除前腦神經(jīng)元GPX4，引發(fā)海馬神經(jīng)變性中的主要細(xì)胞死亡，這與認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)。此外，鐵沉積和肽-血紅素復(fù)合物的形成與Aβ和tau相互作用，可產(chǎn)生涉及鐵死亡途徑的ROS[11]。

本研究結(jié)果顯示，空白組、模型+加藥組小鼠Y形迷宮覓食時(shí)間、MWM逃逸時(shí)間均短于模型組，且空白組短

于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠MWM有效區(qū)域停留時(shí)間均長于模型組，且空白組長于模型+加藥組，提示小鼠神經(jīng)功能改善。且免疫組化及PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在AD小鼠中Aβ、tau表達(dá)增加，GPX4表達(dá)減少，LINC00472抑制則逆轉(zhuǎn)其變化，表明LINC00472抑制有助于通過減少AD小鼠神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡改善其神經(jīng)功能。

ASK1是各種依賴于ros的細(xì)胞死亡過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，不僅參與氧化鋁納米顆粒誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元鐵凋亡的調(diào)控，還能通過ASK1-p38 mapk通路，在冷應(yīng)激誘導(dǎo)的鐵凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。有研究表明，ASK1參與多種ros依賴性細(xì)胞死亡過程，作為多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)的樞紐[13]。本研究結(jié)果顯示，空白組、模型+加藥組METT3、ASK1蛋白表達(dá)低于模型組，空白組低于模型+加藥組，推測LINC00472抑制可能是通過METT3/ASK1通路介導(dǎo)進(jìn)而抑制AD小鼠神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，LINC00472抑制有助于抑制神經(jīng)炎癥，減少Aβ沉積、tau磷酸化，并提高GPX4表達(dá)，通過抑制鐵死亡改善神經(jīng)功能，且對(duì)阿爾茨海默病神經(jīng)元鐵死亡的作用機(jī)制與METT3/ASK1通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

張平，季暉，胡慶華.阿爾茨海默癥的臨床治療和天然來源潛在藥物的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 57（7）： 1954-1961.

林小玲，柯維強(qiáng)，唐文軍，等.大黃酚對(duì)Aβ1-42致阿爾茨海默癥大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬CA1區(qū)組織JNK通路的影響[J].中成藥， 2022， 44（6）： 1977-1981.

張朋飛，章立華，華東. Triapine通過ROS/GSH/GPX4軸誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡[J].中國藥理學(xué)通報(bào)， 2023， 39（5）： 833-838.

廖鐘玲，林秀苗，王潔瓊，等.中藥治療缺血性腦卒中鐵死亡機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志， 2023， 21（12）： 2230-2233.

ZHANG G， ZHANG Y， SHEN Y， et al. The potential role of ferroptosis in Alzheimer’s disease[J]. Journal of Alzheimers Disease， 2021， 80（3）： 907-925.

冷蕭如，葉宇航，胡霞敏.鐵死亡在缺血性腦卒中的作用[J].生命的化學(xué)， 2023， 43（9）： 1337-1345.

李賽菲，馮衛(wèi)生，袁培培，等.熟地黃通過抑制自噬和鐵死亡改善缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能損傷[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， _{kk29Kyi4pgBzMebjbaeVFQ==}2024（8）： 6-33.

黃健，安紅偉，曹詩杰.鐵死亡與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展[J].中國病理生理雜志， 2021（11）： 2088-2093.

郭少博，朱文慧，白宇，等.冰菖散通過Nrf2/HO-1信號(hào)通路改善APP/PS1阿爾茨海默病小鼠鐵死亡及認(rèn)知功能障礙的研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 40（6）： 598-607.

于放，馬晶瑩，馬旺然，等.脂氧合酶在鐵死亡驅(qū)動(dòng)阿爾茨海默病中作用的研究進(jìn)展[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志， 2022， 30（12）： 128-132.

蔡雅文，柴玉慧，繆明星，等.細(xì)胞焦亡介導(dǎo)的阿爾茲海默癥發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志， 2021， 56（21）： 1701-1705.

袁美玲，張?jiān)?，汪光云，?通竅活血湯含藥腦脊液調(diào)控ASK1/MKK4/JNK信號(hào)通路對(duì)OGD/R損傷HT22細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志， 2022， 47（19）： 10.

OGIER J M， GAO Y， DUNNE E M ，et al. ASK1 is a novel molecular target for preventing aminoglycoside-induced hair cell death[J].Journal of Molecular Medicine， 2022， 100（5）： 797-813.

1基金項(xiàng)目：2022年度黑龍江省省屬本科高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2022-KYYWF-0815）

作者簡介：林萍，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科疾病的診療。